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Artigo de método

Derivação de um organoide do cérebro humano com desenvolvimento de microglia

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DOI:

10.3791/67491

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17 de janeiro de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Cancer Genetics and Comparative Genomics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo para gerar um organoide cerebral humano com microglia residente, incorporando células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) no desenvolvimento de organoides.

Resumo

Culturas organoides cerebrais tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) fornecem uma importante ferramenta alternativa in vitro para estudar o desenvolvimento do cérebro humano e a patogênese de doenças neurológicas. No entanto, a falta de incorporação da microglia nos organoides cerebrais humanos ainda é um grande obstáculo para os modelos 3D de neuroinflamação. As abordagens atuais incluem a incorporação de micróglia totalmente diferenciada em organoides cerebrais maduros ou a indução de diferenciação microglial desde o estágio inicial de corpos embrióides derivados de iPSC (EBs). A primeira abordagem perde o estágio em que a diferenciação microglial interage com o ambiente neural adjacente, e a abordagem posterior é tecnicamente desafiadora, resultando em inconsistência entre os organoides finais em termos de quantidade e qualidade da micróglia. Para modelar organoides cerebrais com microglia para estudar as interações iniciais entre o desenvolvimento microglial e neuronal, células progenitoras hematopoiéticas (HPC) altamente puras diferenciadas de iPSCs humanas foram incorporadas em EBs derivadas de iPSC para formar organoides cerebrais. Usando imunocoloração e análise de sequenciamento de RNA de célula única (sc-RNA-seq), confirmamos que os HPCs foram incorporados aos organoides 3D, que eventualmente se desenvolveram em organoides cerebrais com micróglia e neurônios. Em comparação com organoides cerebrais sem HPCs, essa abordagem produz incorporação microglial significativa nos organoides cerebrais. Este novo modelo organoide 3D, que consiste em propriedades de desenvolvimento microglial e neural, pode ser usado para estudar as interações iniciais entre o desenvolvimento do sistema imunológico inato e do sistema nervoso e, potencialmente, como um modelo para neuroinflamação e distúrbios neuroinfecciosos.

Introdução

A microglia são células imunes residenciais no cérebro, desempenhando papéis críticos no desenvolvimento e na homeostase do cérebro 1,2. A ativação da microglia resulta na produção de fatores pró-inflamatórios, fagocitose elevada e estresse oxidativo reativo, que remove os patógenos invasores e as células comprometidas. No entanto, a superativação ou ativação prolongada da microglia pode, por outro lado, causar neurodegeneração como mecanismo de patogênese em muitos distúrbios neurológicos, incluindo a doença de Parkinson 3,4. É importante que a microglia seja incluída nos modelos relevantes para o estudo de distúrbios neurológicos humanos. Nos últimos anos, as células-tronco humanas têm sido usadas para desenvolver organoides 3D como modelos in vitro como uma alternativa aos modelos animais e estudos em seres humanos5. Idealmente, os organoides humanos constituem vários tipos de células e estruturas de tecido semelhantes aos órgãos humanos correspondentes, representando melhor a fisiologia e a patogênese humanas do que os modelos animais, mas sem as preocupações éticas envolvidas diretamente em estudos de indivíduos humanos. Eles podem representar o futuro da modelagem de doenças humanas para o estudo da patogênese e desenvolvimento de medicamentos e para a orientação de terapias individualizadas6. Por exemplo, organoides cerebrais humanos 3D derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) prevaleceram no campo da pesquisa em neurociência, modelando doenças infecciosas neurais, incluindo ZIKA, SARS-CoV-27 e doenças neurodegenerativas, incluindo esclerose lateral amiotrófica (ELA) e doença de Alzheimer 8,9. No entanto, os organoides neurais 3D convencionais que usam a inibição dupla do SMAD para induzir a diferenciação neuronal10 produzem organoides cerebrais sem micróglia, pois são derivados de progenitores recrutados do sangue em vez da linhagem neuroectoderma da qual os neurônios são11,12. Sem a presença de microglia, os organoides são inadequados para modelar infecções do SNC, inflamação e neurodegeneração associada.

Para resolver esse problema crítico, foram feitas tentativas de incorporar micróglia diferenciada nos organoides cerebrais13 ou induzir a diferenciação microglial dentro dos organoides desde o início, usando abordagens alternativas em vez da inibição dupla de SMAD13. No entanto, ao incorporar a microglia diferenciada nos organoides cerebrais, as interações iniciais entre o desenvolvimento neuronal e microglial são perdidas. Isso pode ser importante no desenvolvimento do SNC ou na patogênese de distúrbios neuroinfecciosos direcionados ao desenvolvimento do cérebro infantil, como na infecção pelo vírus ZIKA14. Por outro lado, a diferenciação da micróglia inata dentro de organoides cerebrais derivados de iPSC sem estágios intermitentes envolve um processo prolongado e tem maior variabilidade dentro dos produtos finais15. Neste protocolo relatado, incorporamos as células progenitoras hematopoiéticas derivadas de iPSC (HPCs) nas iPSCs para formar corpos embrióides (EBs), que foram posteriormente diferenciados em organoides 3D, incluindo neurônios e microglia.

Nosso protocolo fornece uma abordagem fácil que pode ser adotada para estudar o sistema nervoso central humano envolvendo interações neurônio-microgliais precoces e a patogênese de distúrbios infecciosos neurais e neuroinflamação envolvendo ativação microglial.

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Protocolo

As amostras de sangue originais de doadores adultos saudáveis foram coletadas no Banco de Sangue de Medicina Transfusional do NIH, e os formulários de consentimento informado assinados foram obtidos de acordo com o Conselho de Revisão Institucional do NIH.

1. Produção de células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) a partir de iPSCs humanas

NOTA: As células iPSC humanas 510 e 507 foram usadas para produzir os resultados representativos. Os métodos de geração e manutenção das iPSCs podem ser encontrados em publicação anterior16.

  1. Dia 0: Cubra uma placa celular de 12 poços adicionando 500 μL/poço de solução gelada de Matrigel (matriz de membrana basal [BMM]) diluída em meio DMEM/F12 e incube-a por pelo menos 30 min em temperatura ambiente (RT).
  2. Remova completamente o sobrenadante do revestimento e substitua-o por 1 mL de meio E8 Flex por poço.
  3. Verifique a cultura de iPSC em uma placa de 6 poços ao microscópio para confirmar se as iPSCs são de alta qualidade e sem sinais de diferenciação. Escolha uma colônia de tamanho médio marcando-a com uma caneta marcadora embaixo do fundo da placa.
  4. Remova o meio da cultura de iPSC e adicione 500 μL de tampão de dissociação iPSC de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (0,5 mM de EDTA, 0,45 g/L de NaCl em DPBS) ao poço.
  5. Observe ao microscópio se há sinais de dissociação celular quando três a quatro fileiras de células das bordas da colônia começam a encolher, com espaço vazio aparecendo entre as células. Isso geralmente leva de 1 a 3 minutos.
  6. Descarte completamente a solução de EDTA. Desaloje a colônia iPSC marcada pipetando 1 mL de meio E8 Flex com força e diretamente sobre ela. Certifique-se de que a colônia se desprenda completamente em manchas celulares contendo 20-50 células cada após 1-3 vezes de pipetagem.
  7. Colete o sobrenadante contendo adesivos celulares e adicione-o ao primeiro poço dos poços revestidos na placa de 12 poços.
  8. Misture o poço pipetando uma ou duas vezes e transfira 1 mL das células para o segundo poço que contém 1 mL de meio.
  9. Repita a etapa 1.8 duas vezes para fazer culturas de iPSC diluídas em série em um total de quatro poços.
  10. Incubar a placa numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
  11. Após 24 h, no dia 1, verifique as colônias ao microscópio e conte o número de colônias percorrendo todos os campos em um poço continuamente. Escolha um poço que contenha 10-20 colônias de iPSC.
  12. Substitua o meio por 1 mL de meio A do Kit hematopoiético. Coloque a placa de volta na incubadora por 48 h.
  13. No dia 3, remova 500 μL de meio gasto e adicione 500 μL de meio fresco A.
  14. No dia 4, observe ao microscópio e observe um crescimento celular significativo e diferenciação das colônias de iPSC. Substitua o meio por 1 mL de meio B.
  15. Monitore a diferenciação celular ao microscópio e faça a mudança de meio com 500 μL de meio B em dias alternados. As células semelhantes a HPC aparecem nos dias 6-7.
  16. No dia 10, observe ao microscópio células redondas únicas brilhantes com a morfologia de HPCs normais flutuando no meio ou frouxamente presas à camada inferior única de células planas, com alguns agregados de células soltas.
    NOTA: Os HPCs diferenciados estão prontos para coleta para caracterização ou experimento posterior.
  17. Colete todos os HPCs diferenciados pipetando para cima e para baixo três vezes usando uma ponta de pipeta de 1 mL para quebrar os agregados de células e separar os HPCs da superfície da placa.
  18. Adicione as células em um tubo de 15 mL e centrifugue as células a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio B.
  19. Conte as células e ajuste a concentração para 1 milhão de células/mL. Nesta fase, mais de 1 milhão de HPCs são gerados. Quando verificado com citometria de fluxo, certifique-se de que a pureza seja superior a 85% das células com CD34+/CD43+. Certifique-se de que nenhuma célula morta significativa (mais de 5%) seja notada.

2. Desenvolvimento de corpos embrióides a partir de iPSCs e HPCs mistas

  1. No mesmo dia da coleta dos HPCs, certifique-se de que uma cultura de iPSC também atinja 80% de confluência em um poço em uma placa de 6 poços (ou dois poços em uma placa de 12 poços).
  2. Trate um poço da placa de cultura de micropoços para formação de EB com 500 μL de solução de enxágue antiaderente, adicionando-a para minimizar as bolhas.
  3. Gire a placa a 2000 x g por 5 min em um rotor de caçamba oscilante equipado com suportes de placa para remover possíveis bolhas.
  4. Remova a solução de enxágue completamente por pipetagem e lave os poços duas vezes com 1 mL de DPBS e depois 1 mL de DMEM/F12 sem gerar bolhas.
  5. Dissocie as iPSCs da placa tratando as células com 1 mL de solução de Accutase.
  6. Observe ao microscópio até que as células mostrem sinais de separação, mas ainda estejam presas ao fundo. Isso geralmente acontece dentro de 1-3 minutos após o tratamento com Accutase. Não digere demais os iPSCs.
  7. Remova a solução de Accutase completamente sem perturbar as células e adicione 1 mL de meio DMEM / F12 aos poços. Além disso, dissocie as células em células únicas pipetando para cima e para baixo algumas vezes usando uma ponta de 1 mL.
  8. Colete as células em um tubo de 15 mL e encha-o até 5 mL com meio DMEM/F12. Gire as células a 300 x g por 5 min.
  9. Remova o sobrenadante pipetando e ressuspenda as células em 1 mL de meio E8 Flex. Conte as células e ajuste a concentração celular para 1 milhão de células por mL no meio E8 Flex.
  10. Misture iPSCs com HPCs em uma proporção de 2:1, adicionando 1 milhão de iPSCs (1 mL) e meio milhão de HPCs (500 μL). Adicione todas as células misturadas no poço previamente tratado da placa de cultura de micropoços.
  11. Adicione 1 μL de solução estoque do inibidor de rocha Y27632 (1 mM) por meio de 1 mL no sobrenadante. Agite o prato de um lado para o outro algumas vezes para distribuir as células uniformemente.
  12. Gire a placa de cultura de micropoços a 300 x g por 5 min em um rotor de caçamba oscilante equipado com suportes de placa. Observe ao microscópio para ver se as células se acomodaram nos micropoços. (Figura 1A suplementar).
  13. Sem perturbar as células, coloque a placa em uma incubadora de células a 37 °C, 5% de CO2 .
  14. No dia 2, 48 h depois, observe as células ao microscópio para a formação de EBs. Quando os EBs estiverem claramente formados, continue para a próxima etapa (Figura Suplementar 1B).
  15. Trate uma placa de cultura de células de 24 poços com tampão de enxágue antiaderente (500 μL) por 15 min para fazer uma placa de fixação baixa.
  16. Remova completamente o tampão de enxágue e lave os poços duas vezes com 1 mL de DPBS e, em seguida, adicione 1 mL de meio E8 Flex nos poços.
  17. Ressuspenda os EBs na placa de cultura de micropoços pipetando-os com uma ponta de pipeta de orifício de 1 mL de largura por algumas vezes.
  18. Para cada poço das placas de 24 poços tratadas com baixa aderência, colete e adicione 100 μL de meio contendo EBs. Isso resultará em 10-20 EBs por poço. Adicione o meio E8 Flex ao poço antigo que contém os EBs restantes como backups.
  19. Incubar a placa numa incubadora de células a 37 °C, CO5% 2 durante 48 h.

3. 3D indução, proliferação e maturação de organoides neurais

  1. No dia 2 após a formação do EB, descongele as alíquotas de BMM no gelo por pelo menos 30 min.
  2. Use uma ponta pré-resfriada de 20 μL e adicione 15 μL de gota de BMM gelada sabiamente em cima do meio para revestir os EBs. Isso cria um filme de BMM que os EBs irão anexar e crescer.
  3. Colocar a placa numa incubadora de células a 37 °C, 5% de CO2 .
  4. No dia 4, após a formação do EB, remova 500 μL de meio com cuidado, sem descartar os EBs, e repita o revestimento do BMM seguindo o passo 3.2.
  5. Inicie imediatamente a indução neural adicionando 500 μL de meio de indução neural PSC no topo das células.
  6. Nos dias 6 e 8, execute a troca de meio meio removendo cuidadosamente 500 μL de meio sem tocar nas células e adicionando 500 μL de meio de indução neural.
  7. Nos dias 10, 12 e 14, realizar meio meio de troca com meio de células-tronco neurais (NSC): Knockout DMEM/F12 + 1x suplemento Glutamax + 1x suplemento neural + bFGF + EGF.
  8. No dia 15, transfira todo o poço de esferas com meio para uma nova placa de 12 poços tratada com solução de enxágue antiaderente, conforme descrito anteriormente. Adicione 500 μL de meio de maturação neuronal (DMEM/F12 + 1x suplemento de N2 + 1x suplemento de B27 + 1x antibióticos-antimicóticos) no topo da cultura.
  9. Realize a mudança de meio meio com o meio de maturação neuronal a cada dois dias.
  10. Durante a fase de maturação, se houver sinais de depleção nutricional, como mudança de cor do meio, mova o organoide para placas de 6 poços, que suportam até 3 mL de meio por poço.
  11. Opcionalmente, 17 dias após a formação da EB, suplementar o meio de maturação com citocinas (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) por 6 dias para facilitar a maturação microglial.
  12. No dia 23, colete os organoides neurais resultantes para caracterização ou experimentos adicionais.

4. Depuração e imunocoloração de organoides neurais 3D

  1. Fixe até 10 organoides por imersão em 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) a 4 °C por 24 h.
  2. Transfira os organoides por alvéolo para uma placa inferior transparente de 96 poços e lave com 200 μL de DPBS 2 vezes por 1 h de cada vez com agitação suave.
  3. Permeabilize os organoides lavando-os uma vez em 50% de metanol em DPBS, 80% de metanol em água bidestilada (dd) e 100% de metanol seco por 10 min cada, a 4 °C com agitação suave.
  4. Lave os organoides em série em 20% de DMSO/metanol, 80% de metanol em água dd, 50% de metanol em DPBS, em 100% de DPBS, depois em DPBS com 0,2% de Triton X-100, por 10 min cada a 4 °C com agitação suave. Faça um esforço para remover completamente o tampão residual após cada lavagem.
  5. Incubar em tampão permeabilizante (DPBS com 0,2% de Triton X100, 0,3 M de glicina e 20% de DMSO) com agitação suave por 40 min em RT.
  6. Bloqueio em tampão de bloqueio (DPBS com 0,2% de Triton X100, 6% de soro de cabra e 10% de DMSO) por 1 h a 37 °C com agitação suave em um agitador a 80 rpm.
  7. Incubar com anticorpos em tampão de diluição de anticorpos (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubulina, 1:1000, 100 μL / poço em DPBS com 0,2% Tween 20, 100 μg / mL de heparina, 3% de soro de cabra e 5% de DMSO) a 37 ° C por 2 h ou em câmara fria com agitação suave a 80 rpm por 3 dias.
  8. Lavar com DPBS com 0,2% Tween 20, 100 μg/mL Heparina 5 vezes, 10 min cada em RT com agitação suave em um shaker a 80 rpm.
  9. Incubar com anticorpo secundário (1:200 cabra anti-camundongo Alexa488) a 37 ° C por 1 h, seguido de RT durante a noite com agitação suave em um agitador a 80 rpm.
  10. Para coloração de contraste nuclear, execute a coloração DAPI junto com a incubação de anticorpos ou em um tampão de lavagem.
  11. Lave os organoides 10 vezes em tampão de lavagem, 10 min de cada vez a 37 °C, agitando suavemente.
  12. Observe ao microscópio. Se o fundo ainda estiver alto, continue lavando-o 5 vezes.
  13. Descarte o sobrenadante o máximo possível. Adicione 200 μL de solução de limpeza organoide e incube-a por 5 minutos antes da observação e tire imagens usando um microscópio confocal.

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Resultados

Nosso protocolo segue um esquema para diferenciar HPCs de iPSCs e, em seguida, misturar os HPCs com iPSCs para fazer EBs, seguido de indução neural, diferenciação e maturação (Figura 1). A alta qualidade da diferenciação de HPC é crítica para o sucesso da formação de EB e posterior diferenciação de organoides. Uma técnica de cultura de diluição em série é usada para produzir o número e o tamanho apropriados de colônias de iPSC para iniciar a diferenciação de ...

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Discussão

Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para a fabricação de organoides neurais 3D contendo micróglia inata a partir de EBs derivados de iPSCs mistas e HPCs diferenciadas por iPSC. É uma abordagem relativamente curta e fácil que envolve apenas técnicas de cultura de células e equipamentos geralmente disponíveis na maioria dos laboratórios.

O fator mais crítico para o sucesso deste protocolo é a qualidade da diferenciação de HPC. Adotamos o método publicado<...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo é apoiado por fundos de pesquisa intramuros do NINDS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de cultura de células de 12 poçosCorning #3512
Placa de cultura de células de 24 poçosSARSTEDT#83.3922
AccutaseThermoA1110501
Aggrewell 400placa Stemcell technologies#34411Referida como placa de cultura de micropoços 
Anticorpo anti-rato para cabras Alexa Fluor 488techniologiesA11001diluição 1:400
Anticorpo anti-coelho para cabras Alexa Fluor 594Life techniologiesA11012diluição 1:400
Allegra X-30R Centrifuge com rotor S6069Beckman Couler
Anti-Adherence  Solução de enxágueStem Cell Technologies#07010
anticorpo anti-CD34Stem Cell Technologies#60013diluição 1:100
anticorpo anti-CD43 humanoStem Cell Technologies#600851:100 diluição
anti-IBA1 anticorpo rabbbitFujifilm019-197412.5 µ g/mL
anti-TREM2  pAb de ratoRD Systemsmab172912.5 µ g/mL
Antibiótico-antimicóticoGibco15240-0621x
suplemento B27Life technologies17504-0441x
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CD200NovoproteínaC311  Frascos CryoTube de 100 ng/mL
Thermo#368632
CX3CL1Peprotech300-31  100 ng/mL
DAPISigmaD95421 µ g/mL
DMEM/F12Life technologies12400-0241x
DMSOSigmaD2650
DPBSGibco#41901361x
E8 Flex kit médioThermoA2858501
EDTA Mediatech46-034-Cl 0,5 mM
EGFPeprotechAF-100-1520 ng/
mL EVOS FL Microscópio AutomáticoMicroscópio de Fluorescência Térmica 
FastStart Universal SYBR Green PCR master mixRoche#4913850001
GlutamaxGibco#35050079
Soro de cabraSigmaG90234%
IL-34Peprotech200-34  100 ng/mL
ImageXpress Micro ConfocalMolecular Devices
Knockout DMEM/F12Gibco#10829018
M-CSFPeprotech300-25  25 ng/mL
MatrigelCorning#354277Matriz de membrana basal (BMM)
Mouse anti-β III-tubulina anticorpoPromegaG712Adiluição 1:1000
Mr. Frosty recipienteThermo5100-0001
suplemento N2Life technologies17502-0481x
ParaformadeídoSigmaP61484%
PSC Neural Induction MediumGibcoA1647801
Inibidor de rocha Y27632Stemcell technologies#723041 mM stock
RT LTS 1000 ul ponteiras de pipetaRAININ#30389218  para transferência de organoides
STEMdiff Cerebral Organoid KitStem Cell Technologies#08570
STEMdiff Hematopoietic KitStemCell Technologies#5310Referido como kit hematopoiético
StemPro Neural SupplementGibcoA1050801Referido como suplemento neural
TGF-β 1Peprotech100-2150 ng/mL
Total RNA Purification Plus KitNorgen#48400
TritonX-100SigmaT92840.10%
Visikol Histo-Starter KitVisikolHSK-1Contém solução de limpeza de organoides HISTO-M, tampão de lavagem
Microscópio Confocal Zeiss LSM 510-METAZeiss
Life

Referências

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