Apresentamos um protocolo para gerar um organoide cerebral humano com microglia residente, incorporando células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) no desenvolvimento de organoides.
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Artigo de método
Derivação de um organoide do cérebro humano com desenvolvimento de microglia
Neste artigo
Resumo
Resumo
Culturas organoides cerebrais tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) fornecem uma importante ferramenta alternativa in vitro para estudar o desenvolvimento do cérebro humano e a patogênese de doenças neurológicas. No entanto, a falta de incorporação da microglia nos organoides cerebrais humanos ainda é um grande obstáculo para os modelos 3D de neuroinflamação. As abordagens atuais incluem a incorporação de micróglia totalmente diferenciada em organoides cerebrais maduros ou a indução de diferenciação microglial desde o estágio inicial de corpos embrióides derivados de iPSC (EBs). A primeira abordagem perde o estágio em que a diferenciação microglial interage com o ambiente neural adjacente, e a abordagem posterior é tecnicamente desafiadora, resultando em inconsistência entre os organoides finais em termos de quantidade e qualidade da micróglia. Para modelar organoides cerebrais com microglia para estudar as interações iniciais entre o desenvolvimento microglial e neuronal, células progenitoras hematopoiéticas (HPC) altamente puras diferenciadas de iPSCs humanas foram incorporadas em EBs derivadas de iPSC para formar organoides cerebrais. Usando imunocoloração e análise de sequenciamento de RNA de célula única (sc-RNA-seq), confirmamos que os HPCs foram incorporados aos organoides 3D, que eventualmente se desenvolveram em organoides cerebrais com micróglia e neurônios. Em comparação com organoides cerebrais sem HPCs, essa abordagem produz incorporação microglial significativa nos organoides cerebrais. Este novo modelo organoide 3D, que consiste em propriedades de desenvolvimento microglial e neural, pode ser usado para estudar as interações iniciais entre o desenvolvimento do sistema imunológico inato e do sistema nervoso e, potencialmente, como um modelo para neuroinflamação e distúrbios neuroinfecciosos.
Introdução
A microglia são células imunes residenciais no cérebro, desempenhando papéis críticos no desenvolvimento e na homeostase do cérebro 1,2. A ativação da microglia resulta na produção de fatores pró-inflamatórios, fagocitose elevada e estresse oxidativo reativo, que remove os patógenos invasores e as células comprometidas. No entanto, a superativação ou ativação prolongada da microglia pode, por outro lado, causar neurodegeneração como mecanismo de patogênese em muitos distúrbios neurológicos, incluindo a doença de Parkinson 3,4
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Protocolo
As amostras de sangue originais de doadores adultos saudáveis foram coletadas no Banco de Sangue de Medicina Transfusional do NIH, e os formulários de consentimento informado assinados foram obtidos de acordo com o Conselho de Revisão Institucional do NIH.
1. Produção de células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) a partir de iPSCs humanas
NOTA: As células iPSC humanas 510 e 507 foram usadas para produzir os resultados representativos. Os métodos de geração e manutenção das iPSCs podem ser encontrados em publicação anterior16.
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Resultados
Nosso protocolo segue um esquema para diferenciar HPCs de iPSCs e, em seguida, misturar os HPCs com iPSCs para fazer EBs, seguido de indução neural, diferenciação e maturação (Figura 1). A alta qualidade da diferenciação de HPC é crítica para o sucesso da formação de EB e posterior diferenciação de organoides. Uma técnica de cultura de diluição em série é usada para produzir o número e o tamanho apropriados de colônias de iPSC para iniciar a diferenciação de .......
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Discussão
Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para a fabricação de organoides neurais 3D contendo micróglia inata a partir de EBs derivados de iPSCs mistas e HPCs diferenciadas por iPSC. É uma abordagem relativamente curta e fácil que envolve apenas técnicas de cultura de células e equipamentos geralmente disponíveis na maioria dos laboratórios.
O fator mais crítico para o sucesso deste protocolo é a qualidade da diferenciação de HPC. Adotamos o método publicado<.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este estudo é apoiado por fundos de pesquisa intramuros do NINDS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de cultura de células de 12 poços | Corning | #3512 | |
| Placa de cultura de células de 24 poços | SARSTEDT | #83.3922 | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | |
| Aggrewell 400 | placa Stemcell technologies | #34411 | Referida como placa de cultura de micropoços |
| Anticorpo anti-rato para cabras Alexa Fluor 488 | techniologies | A11001 | diluição 1:400 |
| Anticorpo anti-coelho para cabras Alexa Fluor 594 | Life techniologies | A11012 | diluição 1:400 |
| Allegra X-30R Centrifuge com rotor S6069 | Beckman Couler | ||
| Anti-Adherence Solução de enxágue | Stem Cell Technologies | #07010 | |
| anticorpo anti-CD34 | Stem Cell Technologies | #60013 | diluição 1:100 |
| anticorpo anti-CD43 humano | Stem Cell Technologies | #60085 | 1:100 diluição |
| anti-IBA1 anticorpo rabbbit | Fujifilm | 019-19741 | 2.5 µ g/mL |
| anti-TREM2 pAb de rato | RD Systems | mab17291 | 2.5 µ g/mL |
| Antibiótico-antimicótico | Gibco | 15240-062 | 1x |
| suplemento B27 | Life technologies | 17504-044 | 1x |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CD200 | Novoproteína | C311 | Frascos CryoTube de 100 ng/mL |
| Thermo | #368632 | ||
| CX3CL1 | Peprotech | 300-31 | 100 ng/mL |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 µ g/mL |
| DMEM/F12 | Life technologies | 12400-024 | 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | #4190136 | 1x |
| E8 Flex kit médio | Thermo | A2858501 | |
| EDTA Mediatech | 46-034-Cl | 0,5 mM | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 20 ng/ |
| mL EVOS FL Microscópio Automático | Microscópio de Fluorescência Térmica | ||
| FastStart Universal SYBR Green PCR master mix | Roche | #4913850001 | |
| Glutamax | Gibco | #35050079 | |
| Soro de cabra | Sigma | G9023 | 4% |
| IL-34 | Peprotech | 200-34 | 100 ng/mL |
| ImageXpress Micro Confocal | Molecular Devices | ||
| Knockout DMEM/F12 | Gibco | #10829018 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | 25 ng/mL |
| Matrigel | Corning | #354277 | Matriz de membrana basal (BMM) |
| Mouse anti-β III-tubulina anticorpo | Promega | G712A | diluição 1:1000 |
| Mr. Frosty recipiente | Thermo | 5100-0001 | |
| suplemento N2 | Life technologies | 17502-048 | 1x |
| Paraformadeído | Sigma | P6148 | 4% |
| PSC Neural Induction Medium | Gibco | A1647801 | |
| Inibidor de rocha Y27632 | Stemcell technologies | #72304 | 1 mM stock |
| RT LTS 1000 ul ponteiras de pipeta | RAININ# | 30389218 | para transferência de organoides |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | Stem Cell Technologies | #08570 | |
| STEMdiff Hematopoietic Kit | StemCell Technologies | #5310 | Referido como kit hematopoiético |
| StemPro Neural Supplement | Gibco | A1050801 | Referido como suplemento neural |
| TGF-β 1 | Peprotech | 100-21 | 50 ng/mL |
| Total RNA Purification Plus Kit | Norgen | #48400 | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | 0.10% |
| Visikol Histo-Starter Kit | Visikol | HSK-1 | Contém solução de limpeza de organoides HISTO-M, tampão de lavagem |
| Microscópio Confocal Zeiss LSM 510-META | Zeiss |
Referências
- Sabate-Soler, S., et al. Microglia integration into human midbrain organoids leads to increased neuronal maturation and functionality. Glia. 70 (7), 1267-1288 (2022).
- Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. Physiology and diseases of tissue-res....
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Reimpressões e permissões
