Artigo de método

Detecção rápida e específica de infecções por Acinetobacter baumannii usando um sistema baseado em amplificação da polimerase recombinase/Cas12a

DOI:

10.3791/67542

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25 de abril de 2025

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1Department of General Practice, The First Hospital of Jilin University, 2Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases, The First Hospital of Jilin University, 3Bioinformatics Laboratory, The First Hospital of Jilin University

Neste artigo

Resumo

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Para facilitar a detecção rápida e precisa de Acinetobacter baumannii, apresentamos um protocolo que emprega a amplificação da polimerase recombinase (RPA) em conjunto com a endonuclease LbaCas12a para identificar infecções por A. baumannii .

Resumo

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Acinetobacter baumannii, uma bactéria gram-negativa, é notória por causar infecções graves com altas taxas de mortalidade. A detecção rápida e precisa de A. baumannii é crucial para o tratamento imediato, controle eficaz de infecções e redução da resistência a antibióticos. No entanto, não existe um método adequado para detecção rápida e fácil no local de A. baumannii. O sistema DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) oferece uma abordagem rápida, precisa e sensível para a detecção de A. baumannii , integrando os recursos de reconhecimento específicos do alvo de Cas12a com a eficiência de amplificação isotérmica da amplificação da polimerase recombinase (RPA). Este protocolo detalha a detecção de A. baumannii usando RPA combinada com endonuclease LbaCas12a. As seguintes etapas são descritas neste artigo: extração de DNA, seleção de uma sequência específica de DNA, projeto de primer e RNA CRISPR (crRNA), construção de plasmídeo recombinante positivo, configuração do ensaio Cas12a-RPA, otimização do sistema de amplificação RPA, visualização do ensaio RPA-CRISPR/Cas12a usando uma ferramenta de detecção de fluorescência, como um instrumento de PCR em tempo real, e avaliação da sensibilidade e especificidade.

Introdução

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Em microbiologia clínica, a detecção de infecções por Acinetobacter baumannii apresenta um desafio significativo. Essa bactéria gram-negativa pode causar infecções com sintomas clínicos graves, mesmo com altas taxas de mortalidade, principalmente entre pacientes imunocomprometidos1. Os métodos tradicionais de detecção baseados em cultura para infecções por patógenos são demorados e podem não ter sensibilidade, o que pode atrasar o tratamento com antibióticos e comprometer os resultados dos pacientes. A identificação rápida e precisa de A. baumannii é crucial para o tratamento eficaz e o controle de surtos. Técnicas moleculares que empregam amplificação de ácidos nucleicos têm sido exploradas para atender a essa necessidade. No entanto, essas abordagens geralmente precisam de equipamentos sofisticados de ciclagem térmica e podem ser limitadas por técnicos bem treinados e laboratórios bem estabelecidos. Para superar esses desafios, a pesquisa está cada vez mais focada no desenvolvimento de métodos de amplificação isotérmica 2,3,4.

A amplificação da polimerase recombinase (RPA) é um método estabelecido por Piepenburg et al 5 e usado para amplificar o DNA, semelhante à reação em cadeia da polimerase (PCR), mas sem a necessidade de ciclos de temperatura. Este método inclui 50 mM de Tris (pH 7,5), 100 mM de acetato de potássio, 14 mM de acetato de magnésio, 2 mM de DTT, 5% de PEG20000 (um polietilenoglicol de alto peso molecular), 200 μM dNTPs, 3 mM de ATP, 50 mM de fosfocreatina, 100 μg/mL de creatina quinase, 120 μg/mL de UvsX, 30 μg/mL de UvsY, 900 μg/mL de Gp32, 30 μg/mL de Bsu LF, Primers de 450 nM e modelos de DNA. O processo de amplificação começa com a proteína recombinase UvsX ligando-se aos primers na presença de 3 mM de ATP e 5% PEG20000 formando um complexo recombinase-primer. Este complexo facilita então a combinação de primers com as sequências homólogas no DNA de fita dupla.

Com a ajuda do UvsY, a recombinase UvsX facilita a troca entre o primer e a fita molde, resultando no deslocamento de uma fita do DNA alvo. A gp32 ajuda a manter a estrutura do DNA de fita simples. Finalmente, a recombinase se dissocia e uma DNA polimerase (Bsu LF) capaz de deslocar as fitas de DNA se liga à extremidade 3 'do primer, alongando-a na presença de trifosfatos desoxirribonucleosídeos (dNTPs). Este processo é repetido ciclicamente, alcançando amplificação exponencial. Todos os processos de amplificação podem ser concluídos em 20-40 min e em temperaturas relativamente constantes entre 37 °C e 42 °C. Essa faixa de temperatura é aproximadamente idêntica às temperaturas fisiológicas, o que permite que a RPA seja conduzida em um ambiente minimalista, tornando a RPA uma ferramenta versátil e eficiente para detecção e análise de DNA.

O sistema de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) e proteínas associadas a CRISPR (CRISPR-Cas) funciona como um mecanismo imunológico adaptativo em bactérias e archaea, abrangendo sistemas de Classe I e Classe II. A classe II inclui proteínas como Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) e Cas14, que identificam e clivam o DNA ou RNA alvo guiado pelo RNA CRISPR (crRNA)6,7,8. LbaCas12a (ou Cpf1) é uma endonuclease de DNA guiada por crRNA. O crRNA serve como um RNA guia dentro do sistema CRISPR-Cas, onde se complexa com as proteínas Cas. Ele aproveita sua região espaçadora para emparelhar com o DNA alvo, direcionando efetivamente o complexo de proteínas para as sequências alvo. A sequência 5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3' serve como a repetição conservada de crRNA, um elemento constante em todos os crRNAs LbaCas12a. Após essa repetição, há um segmento específico do alvo que difere com base no alvo de DNA pretendido. Essa sequência de direcionamento varia de 18 a 24 nucleotídeos de comprimento.

A sequência PAM (Protospacer-Adjacent Motif) (TTTV, onde V pode ser A, C ou G) está localizada na extremidade 5' da fita não complementar do alvo de DNA. O Cas12a corta o DNA de fita dupla alvo na sequência PAM. Posteriormente, as proteínas Cas ativadas executam transclivagem não específica de DNA de fita simples (ssDNA) 9 , 10 , 11 , 12 . Assim, o ssDNA marcado com um fluoróforo e um supressor sofre clivagem, resultando na emissão de um sinal fluorescente após a clivagem colateral 8,13. A intensidade da fluorescência pode ser quantificada usando um leitor de fluorescência para detecção precisa de ácidos nucleicos14. Notavelmente, Cas12a é amplamente utilizado para análise de DNA, com sua ligação e clivagem de sequências-alvo dependentes do reconhecimento do Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM), enquanto Cas13a opera independentemente de tal requisito.

Os sistemas CRISPR-Cas 15,16,17 facilitam a clivagem em uma única reação 18,19,20,21. A combinação dos dois acima pode criar uma ferramenta robusta conhecida como A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) para detecção de ácido nucleico 22,23,24. Este protocolo demonstra o uso de RPA em conjunto com a atividade DNase de Cas12a para direcionar e clivar especificamente uma sequência guiada por crRNA dentro do gene 16s rDNA de A. baumannii, permitindo assim a detecção sensível e precisa do patógeno.

O método A. baumannii-DETECTR apresenta várias vantagens em relação aos métodos convencionaisde detecção 25,26. Em primeiro lugar, a característica isotérmica do RPA agiliza os procedimentos operacionais e reduz os custos por meio de seu mecanismo de amplificação independente do termociclador5. Em segundo lugar, a endonuclease Cas12a aumenta a especificidade do ensaio por meio de direcionamento mediado por crRNA e emparelhamento de bases Watson-Crick7. Por fim, o uso do método de um tubo de A. baumannii-DETECTR não apenas economiza tempo, mas também reduz significativamente o risco de contaminação do amplicon19.

O protocolo descreve as etapas para a extração de DNA, a seleção de sequências de DNA alvo, o design de primers e crRNAs, a construção de plasmídeos recombinantes positivos, o estabelecimento da configuração do ensaio Cas12a-RPA, a otimização da otimização da amplificação de RPA e a visualização dos resultados com o uso de ferramentas de instrumentos de detecção de fluorescência, como uma máquina de PCR em tempo real, completo com avaliações de sensibilidade e especificidade.

O método A. baumannii-DETECTR é promissor para melhorar os resultados dos pacientes, facilitando o tratamento oportuno e eficaz, o controle robusto da infecção e a contenção da disseminação da resistência aos antibióticos. Este protocolo pode servir como uma diretriz abrangente para a implementação da tecnologia Cas12a-RPA, aumentando sua utilidade em vários ambientes de saúde. No entanto, é crucial observar que cada etapa deve ser otimizada com base nas condições laboratoriais específicas e na variedade de amostras para garantir resultados consistentes e confiáveis.

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Protocolo

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1. Construção do A. baumannii -DETECTR

NOTA: A construção de A. baumannii-DETECTR é um processo de quatro etapas envolvendo o projeto de primer e crRNA, a construção de plasmídeo recombinante positivo, a preparação de soluções de reação, amplificação isotérmica de DNA por RPA e a visualização do ensaio RPA-CRISPR/Cas12a. O esquema do ensaio DETECTR é ilustrado na Figura 1.

  1. Desenho do primer e do RNAcr (ver Arquivo Suplementar 1)
    1. Projete 12 pares de primers usando ferramentas de design com base nos princípios de design do Primer. Obtenha quatro primers diretos (F0-F3) e três primers reversos (R1-R3) para compor doze pares de primers (F0R1, F0R2, F0R3, F1R1, F1R2, F1R3, F2R1, F2R2, F2R3, F3R1, F3R2, F3R3).
      1. Certifique-se de que a extremidade 5' do primer contenha bases C ou T nos primeiros 3-5 nucleotídeos em vez de um trecho G contínuo. Além disso, certifique-se de que os últimos três nucleotídeos na extremidade 3 'sejam idealmente bases G e C para aumentar a amplificação.
      2. Projete primers sem sequências auto-complementares para evitar a formação de grampos de cabelo e com não mais do que quatro bases complementares ou homólogas entre eles. Evite a complementaridade da extremidade 3' para evitar a dimerização do primer.
    2. Avalie cada par de primers quanto à especificidade usando a ferramenta Primer-BLAST do National Center for Biotechnology Information (NCBI) para avaliar a eficácia e especificidade dos primers.
      NOTA: O Primer-BLAST pode utilizar o banco de dados do NCBI para encontrar sequências que correspondam aos primers projetados, ajudando os usuários a avaliar a eficácia e a especificidade dos primers.
    3. Após a triagem do primer, projete o RNA CRISPR (crRNA) ou RNA guia (gRNA) usando a sequência de andaime de crRNA LbaCas12a (5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3') como a sequência fixa. Incorpore um segmento específico do alvo (5'-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3'), garantindo que o motivo PAM esteja localizado na extremidade 5' da fita não complementar.
      NOTA: As sequências de todos os oligonucleotídeos e crRNA são apresentadas na Tabela 1.
  2. Construção de plasmídeo recombinante positivo
    1. Amplifique o segmento de rDNA 16s usando o conjunto de primers A. baumannii 16s rDNA-F (primer direto) e A. baumannii 16s rDNA-R (primer reverso).
      1. Adicione 1 μL de 10 μM F e 10 μM R, 10 μL de tampão 5x FastpFu, 1 μL de FastpFu Polimerase, 4 μL de 2,5 mM dNTPs, 1 μL de 10 ng/μL de DNA genômico de A. baumannii e 32 μL de água livre de nuclease ao sistema de PCR de 50 μL.
      2. Defina as condições de ciclo de PCR da seguinte forma: desnaturação inicial a 95 °C por 5 min, seguida por 33 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 s, recozimento a 55 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 1 min e 20 s. Por fim, execute 10 min a 72°C para a extensão final.
    2. Para purificar o produto de PCR positivo, use um Kit de Purificação de DNA de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, clone o DNA purificado no vetor pUC57, que foi digerido com as enzimas BamHI e SalI.
      NOTA: Este processo resultará na criação de um plasmídeo recombinante positivo contendo uma região conservada.
    3. Diluir o plasmídeo recombinante positivo em série em incrementos de dez vezes com ddH2O esterilizado para atingir uma concentração de uma cópia/μL a 107 cópias/μL. Armazenar o plasmídeo diluído a -20 °C para experiências subsequentes.
  3. Preparação da solução
    1. Prepare a Solução A da seguinte forma: para cada reação, adicione 29,5 μL de tampão de reidratação sem primer, 2,4 μL de 10 μM de A. baumannii-F e 10 μM de A. baumannii-R e 12,2μL de ddH2O para atingir um volume final de 46,5 μL. Vórtice e gire brevemente. Em seguida, adicione a mistura de reação aos tubos de reação enzimática do Kit RPA. Pipeta para misturar.
      NOTA: Os primers de A. baumannii-F e R são usados no ensaio que tem como alvo o gene A. baumannii . Consulte a Tabela 1 para obter a sequência.
    2. Prepare a Solução B da seguinte forma: para cada reação, adicione 0,24 μL de repórter de ssDNA 10 μM, 2 μL de tampão de reação Cas12a 10x, 1 μL de crRNA 1 μM, 1 μL de Cas12a 1 μM e 10,76μL de ddH2O para atingir um volume final de 15 μL.
      NOTA: As sondas (repórter ssDNA) foram compradas e consistiam em um repórter de DNA de fita simples que foi marcado com um fluoróforo de 5-carboxifluoresceína (FAM) na extremidade 5 'e um quencher Black Hole Quencher 1 (BHQ1) na extremidade 3 '. No caso de numerosas amostras que necessitem de detecção, preparar uma quantidade substancial da solução B e, em seguida, dividir as amostras em alíquotas posteriormente.
  4. Amplificação isotérmica de DNA (RPA)
    1. Adicionar 1 μL do plasmídeo recombinante positivo de 107 cópias/μL à solução A com diferentes pares de iniciadores; Homogeneizar. Em seguida, adicione 2,5 μL de acetato de magnésio (MgOAc) 280 mM à solução e misture bem.
      NOTA: As reações de RPA começam assim que o MgOAc é adicionado.
    2. Incubar a 39 °C durante 20 min. Após 20 min, purifique os produtos amplificados com diferentes primers usando RPA com um kit de purificação e, em seguida, execute os amplicons limpos em um gel de agarose a 1% a 120 V por 10 min para selecionar a banda mais brilhante e larga como o melhor par de primers.
      NOTA: Para um número baixo de cópias do modelo, após 4 min, remova o tubo EP, o vórtice e gire brevemente; em seguida, substitua-o no dispositivo de aquecimento por mais 16 min. Após a amplificação, os tubos devem ser abertos com extremo cuidado para evitar a contaminação das superfícies de trabalho com amplicons. Essa precaução reduzirá o risco de induzir resultados falsos positivos em procedimentos experimentais subsequentes.
  5. Otimização do sistema de amplificação RPA
    NOTA: O par de primers ideal F3R3 selecionado na etapa anterior foi definido para diferentes concentrações finais para a reação de amplificação de RPA para filtrar a concentração e o tempo ideais do primer. NC é um controle em branco para a concentração de primer correspondente.
    1. Manter constantes as concentrações dos outros componentes e o volume total de 46,5 μL na solução A. Ajustar o volume de ddH2O livre de RNase em conformidade para atingir as concentrações finais de 10 μM F3 e 10 μM R3 a 0,40 μM (2,0 μL), 0,44 μM (2,2 μL), 0,48 μM (2,4 μL) e 0,52 μM (2,6 μL), respectivamente.
    2. Incubar a 39 °C por diferentes momentos: 10 min, 20 min, 30 min.
    3. Limpe os produtos RPA usando um kit de purificação de DNA e realize eletroforese em um gel de agarose a 1% a 120 V por 10 min para identificar a concentração ideal do primer e os tempos de incubação analisando as características das bandas.
  6. Visualização do ensaio RPA-CRISPR/Cas12a
    1. Adicione 5 μL do produto RPA na solução B e misture bem até ficar homogêneo.
    2. Coloque as amostras no instrumento de PCR quantitativo de fluorescência, defina o canal FAM e leia os valores a cada minuto por 60 min a 37 °C, 60x para um total de 60 min.
      NOTA: O sinal de fluorescência verde pode durar vários dias. Para garantir que o sistema funcione de forma eficaz, é melhor realizar um teste livre de DNA e RNase.

2. Avaliação da especificidade da plataforma de deteção baseada em RPA-CRISPR/Cas12a

NOTA: Para testar a especificidade de A. baumannii-DETECTR, os ácidos nucléicos de A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Cockerella burnetii, Serratia e amostras humanas foram submetidos ao teste DETECTR.

  1. Use modelos de DNA obtidos de várias espécies usando o Kit de DNA referenciado ou isolando-os fervendo as bactérias na água. Certifique-se de que todos os modelos tenham concentrações iguais. Use a água como controle negativo.
  2. Adicione 10 ng ou 1 μL de moldes de DNA à Solução A contendo primers F3R3. Adicione 2,5 μL de MgOAc, misture bem e incube a mistura a 39 °C por 20 min.
  3. Após 20 min, adicione 5 μL do produto da etapa anterior à solução B e misture.
  4. Coloque no instrumento de PCR quantitativo de fluorescência, defina o canal para FAM e leia o valor uma vez a cada minuto a 37 ° C, para um total de 60 x por 60 min.

3. Avaliação de sensibilidade da plataforma de detecção baseada em RPA-CRISPR/Cas12a

  1. Utilizar um plasmídeo recombinante positivo, que tenha sido preparado para uma concentração de 1-107 cópias/μl, como modelo para a reacção. Use água para o controle negativo.
  2. Execute o método seguindo as etapas 2.2-2.4.
    NOTA: O conjunto de primers RPA-F3 e RPA-R3 foi projetado para amplificar um fragmento mais curto de 174 pares de bases do plasmídeo recombinante positivo.

4. Preparações enquanto a amostra está sob luz UV e detecção LFS

  1. Retire o número necessário de tiras de teste e rotule-as adequadamente.
  2. Transfira 10 μL dos produtos amplificados das etapas 2 e 3 para tubos de PCR separados, respectivamente. Em seguida, adicione 40 μL de ddH2O a cada tubo.
    NOTA: Se estiver usando um sistema de reação auto-preparado, recomenda-se explorar a taxa de diluição ideal.
  3. Execute o teste.
    1. Submeter o tubo de PCR que contém os produtos amplificados a um transiluminador para avaliar a presença de fluorescência.
    2. Insira as tiras de teste nos tubos de PCR com a extremidade da almofada de amostra voltada para baixo.
    3. Deixe repousar em temperatura ambiente por 5 a 10 minutos para ler o resultado. Após este tempo, certifique-se de que o nível do líquido não exceda a linha máxima antes de prosseguir.
    4. Interprete os resultados como negativos se a linha T não mostrar cor. Interprete os resultados como positivos se a linha T for visível a olho nu, indicando que a sonda de ácido nucleico foi clivada pela enzima Cas e a enzima Cas foi ativada. Considere o resultado inválido se nem a linha C nem a linha T mostrarem cor.

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Resultados

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Neste estudo, apresentamos uma nova plataforma de diagnóstico portátil chamada A. baumannii-DETECTR, que integra a eficiência de amplificação isotérmica do sistema RPA e CRISPR-Cas12a para identificação de campo rápida e confiável de A. baumannii. O esquema do ensaio DETECTR é ilustrado na Figura 1.

Doze pares de primers foram projetados usando ferramentas de design com base nos pr...

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Discussão

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Os métodos tradicionais de diagnóstico para infecções por A. baumannii têm várias restrições que os tornam menos acessíveis e viáveis para testes no local de atendimento27. Por exemplo, a PCR tem boa sensibilidade e especificidade, mas requer equipamentos especializados de ciclagem térmica e fluxos de trabalho complexos que devem ser operados por profissionais. O novo método apresentado aqui, que combina RPA e edição do genoma CRISPR-LbaCas12a com recombi...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Projeto do Plano de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia da Província de Jilin, China (20240305027YY) e pelo Departamento de Finanças da Província de Jilin (JLSWSRCZX2023-55, JLSWSRCZX2021-041).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
 -20 > C FreezerHaierHYCD-290China
Agarose BasicBioFroxx1110GR100China
Todos os oligonucleotídeos e crRNA foram sintetizados pela empresawww.comatebio.com
substrato de corte Cas12a - ssDNA - tipo fluorescenteEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BHQChina
Cas12a substrato de corte - ssDNA - tipo de papel de testeEZassay Biotech. Co., Ltd.DNA-FAM-BIOChina
Aparelho de eletroforeseBIO-RADPOWEREUA
Instrumento de PCR quantitativo de fluorescênciaBIO-RADCFX ConnectUSA
Sistema de imagem em gelBIO-RADGel Doc 2000EUA
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
Tira de papel de fluxo lateral (Biotina/FAM)EZassay Biotech. Co. Ltd.HD-FMBOChina
LbaCas12a (Cpf1) melhorou a proteínaEZassay Biotech. Co. Ltd.CAS-12E-001China
Transiluminador LEDLABGICBL-20China
Acetato de magnésio, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
MicrocentrifugeallshengMini-6kChina
Tubos de tiraPCRPST-0208-FT-CChina
TGrade Incubadora de Banho SecoTiangen tecnologia bioquímica OSE-DB-01Kit de
DNA de Bactérias TianampTecnologia bioquímica Tiangen DP302-02
China TIANamp Kit de DNA de Bactérias TIANGEN BIOTECH  (PEQUIM) CO.; Ltd.DP302  China 
TransStart  FastPfu  DNA polimerase TransGen Biotech. Co. Ltd.AP221  China 
Kit BásicoTwistAmp TwistDXTABAS03KITUK
Kit Universal de Purificação de DNATecnologia bioquímica Tiangen DP214-03China
PAC1000 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast de da China

Referências

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