Artigo de método

Marcação de fluorescência para visualizar proteínas de baixa expressão em peixe-zebra

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DOI:

10.3791/67616

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24 de janeiro de 2025

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1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para marcar proteínas com uma etiqueta de proteína de fluorescência em larvas de peixe-zebra, um sistema in vivo recém-desenvolvido e modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baixa abundância em peixe-zebra.

Resumo

A tecnologia knock-in (KI) mediada por CRISPR/Cas9 permite uma marcação mais fácil de proteínas fluorescentes em peixe-zebra (Danio rerio), um organismo modelo preferido para imagens in vivo devido à sua transparência durante o estágio inicial de desenvolvimento. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a realização de KI do gene de fluorescência de alta eficiência, triagem rápida para fundadores de KI e rastreamento de proteínas de baixa abundância em larvas de peixe-zebra, o que estabelecerá uma base crítica para estudos fisiopatológicos subsequentes em peixe-zebra. O protocolo atual inclui etapas completas para o projeto de sgRNA para o gene de interesse, transcrição in vitro de sgRNA, transcrição in vitro de mRNA Cas9, triagem de sgRNA in vivo para aquele com a maior eficiência, projeto e construção de plasmídeo doador, microinjeção em larvas de peixe-zebra, tela do fundador KI e imagem ao vivo do peixe-zebra. Etapas críticas, dicas de solução de problemas, métodos de controle de qualidade e vantagens e aplicações deste protocolo são incluídos e discutidos. Este protocolo garante resultados rápidos e precisos a baixo custo e foi validado por vários ensaios.

Introdução

Como um organismo modelo bem aceito, o peixe-zebra (Danio rerio) é amplamente utilizado em pesquisas científicas sobre desenvolvimento, regeneração, tumorigênese, infecção e imunidade, etc. 1,2,3,4,5. O peixe-zebra é especialmente adequado para imagens ao vivo in vivo quando tratado com PTU (1-fenil 2-tioureia), um composto químico tóxico que inibe a melanogênese e torna as larvas do peixe-zebra transparentes por um período de tempo relativamente longo6. Cepas de peixe-zebra transparentes geneticamente modificadas, como o casper7 e o crystal8, também estão disponíveis, permitindo a visualização ao vivo e o rastreamento da linhagem até a idade adulta. Além desses esforços para superar a pigmentação para uma melhor visualização ao vivo em peixes adultos, nossa pesquisa também se concentra no desenvolvimento de poderosas estratégias de edição de genes para tornar a marcação de proteínas fluorescentes mais eficiente e menos artificial.

A tecnologia KI baseada em CRISPR/Cas9 mediada por microhomologia (MMEJ) é agora amplamente aplicada em modificações genéticas em vários organismos, incluindo peixe-zebra, devido à sua eficiência relativamente alta de KI 9,10,11,12. Para obter imagens in vivo bem-sucedidas, dois desafios precisam ser enfrentados. Um deles são os indels ou cicatrizes introduzidas pelo processo de recombinação; A outra é que alguns genes-alvo são expressos endogenamente em um nível baixo, levando a sinais fracos da marca de fluorescência co-expressa e à falha de detecção in vivo. Visando a marcação eficiente e precisa de proteínas e minimizando a interferência dos níveis de expressão gênica endógena, um trabalho recente relatou uma estratégia otimizada combinando um método de marcação "VH" amplificador de sinal de fluorescência e um fluxo de trabalho de triagem de linha germinativa refinado13, que é mais adequado para marcação de fluorescência de genes de baixa expressão e mais eficiente do que os métodos anteriores, otimizando a estrutura do doador e combinando reação em cadeia da polimerase (PCR) e verificações de fluorescência para implementar a tela germinativa com o menor custo de tempo e esforço. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo detalhado para o método relatado, incluindo etapas de preparação de embriões e criação de peixe-zebra, design de sgRNA, transcrição in vitro de sgRNAs, transcrição in vitro de mRNA Cas9, microinjeção de embrião de peixe-zebra, triagem in vivo para sgRNAs com a mais alta eficiência, design e construção de plasmídeo de doador, genotipagem de peixe-zebra KI, triagem germinativa KI e imagem e fenotipagem de peixe-zebra KI. Este protocolo tudo-em-um, fornecendo um método de rotulagem de fluorescência de última geração, sem dúvida promoveria estudos usando peixe-zebra em vários campos científicos e beneficiaria leitores de diferentes formações acadêmicas.

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Protocolo

Todas as criações e experimentos de peixe-zebra foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética e Gerenciamento de Animais de Laboratório da Universidade de Xiamen e estavam em estrita conformidade com as boas práticas animais, conforme definido pelo Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Xiamen. O estudo cumpriu todos os regulamentos éticos relevantes para o uso de animais.

NOTA: Todos os peixes-zebra adultos e larvais foram mantidos seguindo protocolos padrão a 28,5 ° C com um ciclo claro/escuro de 13/11 h no sistema de aquário de peixe-zebra da Universidade de Xiamen. Os embriões foram mantidos no tampão embrionário (Tabela 1) em uma incubadora controlada (temperatura, 28 ± 0,5 °C; luz, 13 h de ciclo claro/11 h escuro). A alimentação e o monitoramento geral de todos os peixes-zebra foram realizados duas vezes ao dia (9h e 16h). A cepa do tipo selvagem (WT) usada nesta pesquisa foi Tübingen (Tü).

1. Escolhendo genes de interesse e projetando o RNA guia

  1. Conheça as informações do gene de interesse. Pesquise no banco de dados (https://zfin.org/) e certifique-se de que o número de variantes genéticas seja conhecido. Decida qual variante manipular e baixe as informações do gene alvo do Ensembl (https://www.ensembl.org/), incluindo sequência do genoma, sequência de cDNA e sequência de codificação (CDS). Marque éxons, íntrons, UTRs, códons de início e códons de parada nas sequências.
  2. Escolha não mais do que 200 bp de CDS a montante do códon de parada (TAA, TAG ou TGA) do gene alvo como a região alvo do sgRNA.
    NOTA: É melhor certificar-se de que esta região não possui polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) por sequenciamento de DNA.
  3. Use o site CRISPRscan (https://www.crisprscan.org/) para projetar sgRNAs candidatos dentro da região-alvo escolhida e prever eficiências de sgRNA.
    1. Insira a sequência de DNA no quadro de design.
    2. Selecione as informações correspondentes, incluindo espécies, incompatibilidade(s) máxima(s) em alvos externos, endonuclease e promotor. Neste caso, escolha Zebrafish- Danio rerio, Sem incompatibilidade, Cas9-NGG e promotor T7 in vitro.
    3. Clique em Obter sgRNAs para obter alguns sgRNAs. Selecione 5-7 sgRNAs com uma pontuação alta de CRISPRscan e uma pontuação baixa fora do alvo para a tela in vivo .
  4. Projete primers de PCR flanqueando os locais-alvo de sgRNA cujo produto é de cerca de 500 pb para amplificação subsequente de PCR, teste de digestão enzimática e sequenciamento para verificar a eficiência do nocaute após microinjeção de sgRNA/Cas9. Selecione uma sequência de aproximadamente 20 pb nas regiões a montante e a jusante e certifique-se de que seu conteúdo de GC seja de cerca de 50% e o valor de Tm varie de 50 a 55 ° C.
    NOTA: Projete dois primers a montante e dois primers a jusante se houver necessidade de fazer combinações.

2. Preparação de sgRNAs

NOTA: A sequência comum de andaimes de sgRNA (Figura 1) foi clonada em um plasmídeo (Tabela de Materiais).

  1. A PCR amplifica a sequência conjugada promotor-sgRNA T7 usando primers e mistura de PCR mostrados na Tabela 2 e na Tabela 3, respectivamente. Execute o programa de PCR na Tabela 4. Eletroforese em gel (gel de agarose, 1,2% de agarose em tampão TAE; tampão TAE [Tabela 1]; 200 V; cerca de 5 min) com 2 μL dos produtos de PCR para garantir que os produtos estejam corretos (o MW é de cerca de 150 pb).
  2. Purifique os produtos de PCR usando um kit de purificação (Tabela de Materiais) ou outros kits disponíveis comercialmente seguindo as instruções do fabricante.
    NOTA: A partir de agora, devem ser utilizados reagentes e materiais isentos de RNase, e os procedimentos devem ser conduzidos com especial cuidado para evitar a contaminação por RNase (ver Discussão).
    1. Adicione o tampão de ligação aos produtos de PCR em uma proporção de volume de 5:1 e misture. Aplicar a mistura na coluna colocada num tubo de recolha de 2 ml. Centrifugar a 17.900 × g durante 1 min a 25 °C. Descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no mesmo tubo de coleta.
    2. Adicione 750 μL do tampão de lavagem à coluna e centrifugue a 17.900 × g por 1 min a 25 °C. Descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no mesmo tubo de coleta. Centrifugar a 17.900 × g durante 2 min a 25 °C. Coloque a coluna em um tubo limpo de 1,5 mL.
    3. Adicionar 20 μL de água livre de nuclease à coluna, centrifugar a 17.900 × g durante 2 min a 25 °C, para eluir o ADN e medir a concentração utilizando um espectrofotómetro.
  3. Use o Sistema de Produção de RNA T7 em Tabela de Materiais ou kits equivalentes para transcrever in vitro 250 ng do DNA purificado. Operações e condições livres de RNase são necessárias.
    1. Preparar a reação em tubos de PCR (sem RNase) de acordo com o quadro 3 e misturar suavemente. Incubar a 37 °C num banho de metal durante 2 h.
    2. Adicione 0,5 μL de DNase I (sem RNase) e misture delicadamente. Incubar a 37 °C em banho de metal durante 15-20 min.
    3. Precipitação de etanol
      1. Adicione água livre de RNase a cada reação para que o volume final atinja 20 μL e transfira as amostras para tubos de 1,5 mL.
      2. Adicione 50 μL de etanol 100% (2,5 V, sem RNase), misture bem, coloque a mistura no gelo por 10 min e centrifugue a 21.000 × g por 15 min a 4 °C.
      3. Descarte o sobrenadante, lave o pellet com 500 μL de etanol a 75% (sem RNase) e centrifugue a 21.000 × g por 5 min a 4 °C.
      4. Rejeitar o sobrenadante, secar o pellet a 45 °C num banho de metal e dissolver com 40 μL de água isenta de RNase.
        NOTA: Para KI, os sgRNAs precisam ser precipitados por LiCl (veja abaixo), mas para KO, não é necessário.
    4. Execute géis de agarose (gel de agarose: 1,2% de agarose em tampão TAE; tampão TAE [Tabela 1]; 200 V; cerca de 5 min) com 1-2 μL de RNA para estimar a qualidade e depois medir a concentração usando um espectrofotômetro.
      NOTA: os sgRNAs podem ser armazenados a -20 ° Cor -80 ° C para uso posterior.

3. Preparação de mRNA Cas9

  1. Realize a digestão enzimática do plasmídeo Cas9 (Tabela de Materiais) por mais de 1,5 h usando XbaI de acordo com as instruções do fabricante (para a mistura de reação, consulte a Tabela 3). Teste por eletroforese em gel (gel de agarose: agarose a 1,2% em tampão TAE; tampão TAE [Tabela 1]; 200 V; cerca de 10 min) com 1 μL para verificar se a digestão é completa.
  2. Purifique os produtos da mesma forma que os produtos de PCR de sgRNA (etapas 2.2.1-2.2.3). A partir daqui, são necessários materiais e operações livres de RNase.
  3. Use o kit de transcrição T3 (Tabela de Materiais) ou kits equivalentes para transcrição in vitro de mRNA Cas9.
    1. Preparar a reação em tubos de PCR isentos de RNase de acordo com o quadro 3 e misturar suavemente. Incubar a 37 °C durante mais de 2,5 h.
    2. Adicione 1 μL de Turbo DNase sem RNase e incube a 37 °C por 15-20 min.
    3. Precipitação de LiCl
      1. Transfira as amostras para tubos de 1,5 mL, adicione 30 μL de LiCl (1,5 V) e misture delicadamente.
      2. Colocar a mistura a -20 °C durante cerca de 30 min e depois centrifugar a 21 000 × g durante 30 min a 4 °C.
      3. Descarte o sobrenadante, lave os pellets com 500 μL de etanol a 75% (sem RNase) e centrifugue a 21.000 × g por 5 min a 4 °C.
      4. Rejeitar o sobrenadante, secar o sedimento a 45 °C e dissolvê-lo em 40 μL de água isenta de RNase.
  4. Medir a concentração do ARNm Cas9 utilizando um espectrofotómetro. Execute géis de agarose (gel de agarose: 1,2% de agarose em tampão TAE; tampão TAE [Tabela 1]; 200 V; cerca de 10 min) com 1-2 μL do RNA para verificar a concentração e a qualidade.
    NOTA: Um OD 260/280 deve estar acima de 2,0 e a concentração deve estar em torno ou superior a 1000 ng/μL. O mRNA Cas9 pode ser armazenado a -20 °Cor -80 °C para uso posterior.

4. Preparação para a microinjeção

  1. Prepare o peixe-zebra: Na noite anterior à microinjeção, coloque uma fêmea saudável de peixe-zebra e dois machos saudáveis em um tanque de acasalamento, usando uma divisória para separar os machos e as fêmeas para prepará-los para o acasalamento.
  2. Prepare agarose a 4%, tampão de lise e tampão embrião (pH 8,0) (Tabela 1).
  3. Prepare agulhas de vidro capilar para a microinjeção (Tabela de Materiais).
  4. Prepare placas de microinjeção: Despeje 35 mL de agarose a 4% derretida em uma placa de Petri de 10 cm e coloque delicadamente um molde de plástico para criar calhas em forma de cunha. Evite bolhas de ar batendo suavemente no molde. Depois de solidificar, adicione um pouco de água bidestilada (ddw) e coloque a placa a 4 °C para uso posterior.

5. Teste de eficiência de sgRNA por microinjeção

  1. No dia da microinjeção, prepare a mistura de microinjeção conforme listado na Tabela 5 no gelo em um ambiente livre de RNase.
  2. Carregue a solução de microinjeção na agulha usando uma ponta de pipeta sem RNase (Tabela de Materiais). Tenha cuidado para não trazer bolhas.
  3. Coloque a agulha carregada em um micromanipulador conectado a um microinjetor. Corte a ponta da agulha de injeção sob o microscópio com a pinça pontiaguda, beliscando suavemente a ponta da agulha para quebrá-la. Em seguida, ajuste a pressão de injeção até que a agulha ejete consistentemente uma gota de 1-nL, que é quantificada usando um micrômetro de estágio e um capilar.
  4. Remova a divisória e deixe os peixes se reproduzirem por cerca de 6 min. Colete e transfira os embriões de estágio de 1 célula para uma placa de Petri contendo tampão de embriões.
    1. Examine a saúde dos embriões ao microscópio óptico e remova quaisquer ovos ou detritos não fertilizados. Separe 20 embriões saudáveis como controles não injetados em uma placa de Petri separada e rótulo.
  5. Transfira e alinhe suavemente embriões saudáveis em estágio de 1 célula nas ranhuras da placa de microinjeção aquecida à temperatura ambiente (RT) usando uma escova pequena. Remova o excesso de buffer.
  6. Execute todas as operações subsequentes sob um microscópio estéreo. Use a ponta da agulha para ajustar suavemente a posição do embrião de modo que o pólo do animal fique voltado para a agulha. Injete 1 nL da solução misturada no poste do animal.
  7. Aproximadamente a injeção de 100 embriões é suficiente para um sgRNA. Após a injeção, enxágue suavemente os embriões em uma placa de seis poços com tampão de embrião. Coloque o prato em uma incubadora de temperatura constante de 28.5 °C. Por volta de 10 h após a fertilização (hpf), examine o desenvolvimento embrionário sob um microscópio estéreo e remova os embriões mortos.
  8. Aos 24 hpf, coletar embriões em tubos de 1,5 mL para genotipagem (3 tubos por sgRNA e 5 embriões por tubo). Descarte a água extra cuidadosamente com uma pipeta, adicione 100 μL de tampão de lise contendo proteinase K (a uma concentração final de 0,5 mg / mL) em cada tubo e incube a 56 ° C por 1 h e depois a 95 ° C por 15 min.
  9. Adicione 200 μL de etanol (2V), misture bem e centrifugue a 19.000 × g por 10 min em RT.
  10. Descarte o sobrenadante, lave o pellet com 500 μL de etanol a 70% e centrifugue a 19.000 × g por 3 min em RT.
  11. Rejeitar o sobrenadante, secar o sedimento a RT e dissolver com 50 μl de ddw. Em seguida, utilizar 1 μl dos extractos para preparar a mistura de reacção para a PCR (Quadro 3) (para os iniciadores de PCR, ver passo 1.4).
  12. Execute géis de agarose (gel de agarose: 1,2% de agarose em tampão TAE; tampão TAE [Tabela 1]; 200 V; cerca de 10 min) com 2 μL dos produtos de PCR para confirmar que a PCR foi bem-sucedida e, em seguida, realizar digestão enzimática (Tabela 3) para determinar a eficiência dos sgRNAs. Misture suavemente a mistura de digestão enzimática. Incubar à temperatura durante o período de tempo sugerido pelo fabricante.
  13. Execute géis de agarose para os produtos digeridos (gel de agarose: 1,2% de agarose em tampão TAE; tampão TAE [Tabela 1]; 200 V; cerca de 10 min) com os produtos de PCR não digeridos como controles para confirmar se a digestão ocorre.
    NOTA: O local de clivagem Cas9 está cerca de 3 pb a montante do PAM, portanto, o local de reconhecimento da enzima de restrição é melhor para cobrir 6 pb a montante do PAM. Se a eficiência do sgRNA for alta, o corte e o reparo incorreto levarão a indels, portanto, há uma grande possibilidade de que a enzima de restrição não possa mais reconhecer o local de corte. Se o sgRNA for ineficiente e o local de reconhecimento da enzima de restrição estiver intacto, a digestão enzimática pode ocorrer normalmente. Através da eletroforese em gel de agarose, pode-se distinguir se ocorreu digestão enzimática.
  14. Se não houver um local adequado de reconhecimento de enzimas de restrição, sequencie os produtos de PCR e analise a eficiência do sgRNA por TIDE (https://tide.nki.nl/). Lembre-se de fazer PCR e também sequenciar o DNA genômico WT como controle.
    1. Abra o site e clique em Iniciar TIDE. Insira a sequência guia de sgRNA no quadro em Sequência guia.
    2. Clique em Procurar em Cromatograma de Amostra de Controle (.ab1 ou .scf) para inserir o resultado do sequenciamento para o controle WT e clique em Procurar em Testar Cromatograma de Amostra (.ab1 ou .scf) para inserir o resultado do sequenciamento para a amostra editada.
    3. Clique em Atualizar Visualização. O site fornecerá uma porcentagem da diferença entre as duas sequências. Uma porcentagem maior indica uma maior eficiência do sgRNA. Um sgRNA com uma eficiência de nocaute acima de 80% é adequado para procedimentos subsequentes de IC.

6. Construção do plasmídeo doador para marcação de proteínas fluorescentes

  1. Projete sequências que seriam primeiro clonadas no plasmídeo e depois inseridas no genoma do peixe como Figura 2: uma sequência de 25 pb a montante do local de clivagem de Cas9 previsto é projetada como o braço de homologia esquerdo, e uma sequência de 25 pb a jusante do local de clivagem de Cas9 previsto é o braço de homologia direito. Introduza CDS entre o local alvo do sgRNA e o códon de parada no doador para manter a integridade do gene endógeno.
    NOTA: O 5 'do CDS complementado (elemento 4 na Figura 2) precisa ser mutado como sinônimo para evitar a clivagem secundária do genoma recombinante pelo complexo sgRNA / Cas9.
  2. Use clonagem independente de ligação (LIC)14 usando exonuclease III (Tabela de Materiais) para a construção do plasmídeo doador. Outros métodos, como a montagem de Gibson, também são viáveis. Os primers de clonagem são ilustrados na Figura 2. Os elementos "1", "2", "3" e "4" são transportados pelos primers:
    1. Design Primer F1, que é composto por uma sequência sobreposta com o vetor, elemento "1" e uma parte do elemento "2".
    2. Design Primer R2, que é composto por uma parte do elemento "1", elemento "2" e elemento "3".
    3. Design Primer F2, que é composto pelos elementos "3", "4" e a sequência 5' do CDS seguindo o local alvo do sgRNA.
    4. Design Primer R1, que é composto pela sequência 3' do CDS do gene e uma sequência sobreposta com o vetor.
    5. Use o cDNA do peixe-zebra como modelo e faça PCRs usando os primers.
      NOTA: A sobreposição recomendada entre os primers ou entre o primer e o vetor é de 15 a 20 pb. Esses primers são específicos do gene alvo, e um exemplo dos primers para cx39.9 e cx44.1 é dado na Tabela 2. Este projeto foi aplicado com sucesso conforme descrito anteriormente13. Mapas detalhados de plasmídeos são fornecidos no Arquivo Suplementar 1 e no Arquivo Suplementar 2. As sequências de DNA e proteínas projetadas de cx39.9 e cx44.1 são fornecidas no Arquivo Suplementar 3.
    6. Purifique os produtos de PCR da mesma forma que os produtos de PCR de sgRNA (etapas 2.2.1-2.2.3).
  3. Digerir o vector dador (figura 3 e quadro 6) por enzimas de restrição adequadas. Neste exemplo, as enzimas são PciI e Acc65I (Tabela de Materiais). Realize o de acordo com as instruções do fabricante (Tabela 3). Purificar o vector dador digerido da mesma forma que os produtos de PCR de sgRNA (etapas 2.2.1-2.2.3).
  4. Quantificar os fragmentos de PCR purificados e o vetor doador digerido por eletroforese em gel de DNA (gel de DNA: agarose a 1,2% em tampão TAE; tampão TAE [Tabela 1]; 200 V; cerca de 10 min). Preparar a mistura de reacção para a LIC de acordo com o quadro 3.
    NOTA: Todos os tubos e componentes da reação devem ser colocados no gelo, e a reação e todas as manipulações devem ser realizadas no gelo. Adicione 1 μL de Exo III (20 unidades) à reação como último componente e, em seguida, pipete imediatamente para cima e para baixo para misturar bem todos os componentes. Lembre-se de incluir uma mistura de reação sem fragmentos de PCR como controle para mostrar o potencial de auto-recozimento do vetor digerido.
  5. Coloque imediatamente a mistura de reação no gelo e incube por 60 min.
  6. Adicione 1 μL de EDTA 0,5 M (pH 8,0) para interromper a reação, pipete para cima e para baixo para misturar bem e, em seguida, incube a 60 ° C por 5 min e depois no gelo por 5 min.
  7. Transforme células competentes, como a DH5α, usando os produtos LIC e cultive as bactérias em placas LB (Tabela de Materiais e Tabela 1) com antibióticos adequados (ampicilina neste caso) por 16 h.
  8. Certifique-se de que haja diferenças de ordens de magnitude entre o número de colônias nas placas contendo fragmentos de PCR e na placa de controle. Escolha colônias únicas das placas LIC para análise de digestão enzimática e sequenciamento de DNA.
  9. Extrair e purificar os plasmídeos dadores corretos com um kit de purificação da mesma forma que os produtos de PCR de sgRNA (etapas 2.2.1-2.2.3). Certifique-se de que a concentração final esteja acima de 300 ng/μL.

7. Microinjeção de embriões de peixe-zebra para o gene KI

  1. Execute todas as manipulações de microinjeção descritas acima, exceto a preparação da solução de microinjeção de acordo com a Tabela 7.

8. Triagem e identificação de progênie marcada com proteína fluorescente

  1. Observe a fluorescência sob um microscópio de fluorescência estéreo 12-48 h após a microinjeção.
  2. Aplique um método de tela recém-estabelecido13. Se for observada fluorescência óbvia, retire as larvas fluorescentes e crie-as. Se apenas um traço de fluorescência ou mesmo nenhuma fluorescência for observado, criar todas as larvas injetadas.
  3. Aos 1 mês de idade, anestesiar o peixe-zebra microinjetado com tricaína a 0,02% (Tabela 1). Para cada peixe-zebra, colete um pequeno pedaço da barbatana caudal em um tubo de PCR rotulado e mantenha o peixe-zebra anestesiado correspondente em um poço de uma placa de seis poços contendo água filtrada esterilizada por UV (pH 7,2) com o mesmo rótulo.
  4. Use o método de lise alcalina (tampão de lise na Tabela 1)15 para extração de DNA genômico, seguido pela PCR de junção 5'. Projete o primer dianteiro a montante do braço de homologia esquerdo e o primer reverso no inserto (Figura 4). O tamanho do produto de PCR é de cerca de 500 pb. Para exemplos de primers, consulte a Tabela 2.
    NOTA: Para o peixe-zebra fluorescente, este PCR é usado para verificar a precisão do KI, de modo que o produto do PCR é então submetido ao sequenciamento. Para o peixe-zebra sem fluorescência, esta PCR é usada para verificar se ocorre KI. Escolha os peixes positivos para PCR e crie-os até a idade adulta como F0.
  5. Examine os embriões F1 obtidos do acasalamento do F0 rastreado com WT para padrões de expressão de GFP e genotipados por PCR de junção.
    NOTA: Se a inserção do alvo ocorrer em F1 (perfeita ou não), o F0 correspondente é definido como F0 hereditário, cujo produto de PCR é então sequenciado. Se a inserção for precisa, o F0 correspondente é definido como o F0 desejado.
  6. Quando o F0 desejado for obtido, use a progênie para imagens para observar e rastrear a proteína alvo.

9. Imagem e processamento de dados

  1. Determine o estágio de desenvolvimento a ser fotografado. Prepare o peixe com antecedência. Adicione 1-fenil 2-tioureia diluído (PTU; 0,003%, Tabela de Materiais) ao peixe para remover os pigmentos, se necessário.
    NOTA: A PTU seria menos eficaz se aplicada após 24 hpf. Neste exemplo, o PTU foi adicionado ao tampão embrionário antes de 24 hpf e mantido no tampão até 48 hpf, quando as larvas do peixe-zebra foram processadas para imagem.
  2. Adicione 2 mL de agarose a 4% derretida (Tabela 1) a um prato de 35 mm e deixe solidificar. Transfira o peixe para o tampão embrionário contendo 0,02% de tricaína (Tabela 1).
  3. Diluir 200 μL de agarose a 4% derretida em 1 mL de ddw. Transfira o peixe anestesiado para a agarose diluída usando uma pipeta de 1 mL quando a agarose estiver esfriando. Misture e transfira delicadamente a agarose para montagem de peixe no prato contendo gel de agarose a 4% solidificado preparado na etapa 9.2.
  4. Posicione o peixe de forma que a parte de interesse fique no topo.
  5. Use um microscópio de fluorescência confocal vertical para imagem e processamento de dados seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).

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Resultados

As junções comunicantes que consistem em proteínas poliméricas chamadas conexinas são essenciais para a troca de metabólitos e íons de baixo peso molecular entre as células em contato. O método de marcação de proteínas fluorescentes descrito acima foi usado para marcar a conexina 39.9 (Figura 5A) e a conexina 44.1 (Figura 5B), respectivamente. O KI correto foi verificado por PCR de junção (Figura 6). De acordo com ...

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Discussão

Para conduzir este experimento sem problemas e com sucesso, deve-se prestar mais atenção a alguns aspectos importantes. O estágio ideal de desenvolvimento do peixe-zebra para injeção deve ser o estágio de uma célula. A conclusão da injeção dentro deste estágio pode garantir que todas as células produzidas por meio da divisão subsequente contenham os componentes necessários para o KI, aumentando assim a probabilidade de ocorrência simultânea de KI em todas as células e melhorando a taxa g...

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Divulgações

Todos os autores declaram não haver interesses conflitantes neste artigo.

Agradecimentos

Agradecemos a Lu Zhou (Universidade de Xiamen) pela revisão e edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82388201 de concessão a J.H.; 31801158 de concessão a Y.Z.), o Programa Nacional de P&D da China (2020YFA0803500 para J.H.), o Fundo de Inovação CAMS para Ciências Médicas (CIFMS) (2019-I2M-5-062 para J.H.), a Província de Fujian Central para o Programa Especial de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia Local (2022L3079 para J.H.), e o Programa de Cooperação Distrital FuXia-Quan Zi-Chuang (3502ZCQXT2022003 para J.H.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisões de publicação ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1000 µ L  dicasQualquer marcaN/APara todas as manipulações
Tubos de 1,5 mLQualquer marcaN/APara armazenamento e centrifugação de várias soluções Tubos de
1,5 mL (sem RNase)Qualquer marcaN/APara armazenamento e centrifugação de soluções sem RNase
10 µ L dicasQualquer marcaN/APara todas as manipulações
10 µ Pontas L (sem RNase)Qualquer marcaN/APara manipulações sem RNase
1000 µ L  dicas (sem RNase)Qualquer marcaN/APara manipulações sem RNase
1-fenil 2-tioureia (PTU)SigmaP7629Para inibir a melanogênese e manter as larvas transparentes
200 µ L dicasQualquer marcaN/APara todas as manipulações
200 µ Pontas L (sem RNase)Qualquer marcaN/APara manipulações sem RNase
2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)VazymeP213-03PCR para testes de eficiência de sgRNA
Placas de 35 mmCorning430165Para imagens
de placas de 6 poçosQualquer marcaN/APara criação individual e temporária de peixe-zebra
Acc65INEBR0599SPara digestão enzimática
Ácido acéticoSigma695092Para preparação de tampão TAE
AgarBiofroxx8211GR500Para placas LB
Ampicilina, sal de sódioSangonA610028Para placas LB
CaCl2SigmaC5080Para preparação de tampão embrião
Tubos capilaresHarvard Apparatus30-0016Para agulhas geneating para injeção
Tubos capilaresQualquer ID de marca(diâmetro interno) = 0,1 mmPara quantificar uma gota de 1-nL
CRISPRscanCRISPRscan  http://www.crisprscan.org/Para design de sgRNA
DH5 e alfa;TIANGENCB101Para transformação
EDTASigmaE6758Para tampão de lise e preparação de tampão TAE
EnsemblEnsembl  https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/IndexPara encontrar informações genéticas
EtanolHUSHI64-17-5Para purificação e extração de DNA
Exonuclease IIITakara2170A
LIC Micro-injetor a gás WarnerInstrumentsPLI-100APara microinjeção
Sistema de eletroforese em gelWIXWIX-EP3000Para gel Luvas de eletroforese
Qualquer marcaN / APara todas as manipulações
Glicosesgdbio10010518Para placas LB
GlicerolSangonA501745Para placas LB
gRNA-pMD19-TChina Zebrafish Resource Center (CZRC)Plasmídeo CZP3 sgRNA contendo andaime sgRNA
KClSigmaP5405Para embrião preparação de tampão
Solução de precipitação de cloreto de lítioThermofisherAM9480Precipitação de sgRNAs, sem RNase
Agarose de baixo ponto de fusãoSangonA600015Para preparação de géis de agarose a 4%
Sulfato de magnésiosgdbio20025118Para placas LB
Banho de metalQualquer marcaN/APara incubação em temperatura constante
Azul de metilenoSigmaM9140Para preparação de tampão de embrião
Molde de microinecçãoCaseiroN/APara gerar sulcos para segurar embriões durante a microinjeção
Microloader, ponta para preenchimento de Femtotips e outros microcapilares de vidro, estéreis, 0,5 – 20 µ L, 100 mm, cinza claro, 192 unid. (2 racks × 96 pcs.)Eppendorf5242956003Para Carregar a solução de microinjeção na agulha de injeção, sem RNase
Extrator de micropipetasSutter InstrumentP-97Para gerar agulhas para injeção
MicropipetasEppendorfN/APara todas as manipulações
MicroondasQualquer marcaN/APara fundição de placa de injeção e géis de agarose
MinElute PCR Kit de purificação (50)QIAGEN28004Para purificar produtos de PCR e produtos de digestão,
mMESSAGE mMACHINE T3 sem RNase Kit de transcriçãoInvitrogenAM1348Transcrição in vitro de mRNA Cas9,
N2Any sem/APara microinjeção
NaClSigmaS5886Para tampão de embrião e preparação de tampão de lise
NaHCO3SigmaS5761Para preparação de tampão embrionário
NaOHSangonA100173Para preparação de tampão TAE
Água livre de nucleaseThermofisherR0581Manipulações relacionadas com RNA,
PciINEBR0655SPara máquina de PCR de digestão enzimática
Qualquer marcaN/AAmplificação de PCR
Tubos de tiras de PCRQualquer marcaN / APara
tubos de PCRFEITONGKANGblp-200Para placa de Petri PCR
Qualquer marcaN / APara criação de larvas de peixe-zebra etc.
Vermelho de fenolSigmaP0290Para microinjeção, sem RNase
Suporte de pipetaWarner InstrumentsPLI-PH1Para microinjeção
PrimeStar (Premix)TakaraDR040APara clonagem molecular
Proteinase KMerck539480Para extração de DNA genômico
pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)China Zebrafish Resource Center (CZRC)Modelo de plasmídeoCZP11
Centrífuga refrigeradaQualquer marcaN / APara centrifugação relacionada ao RNA
EscalaSartoriusBCE124-1CCNPara fundição de placa de injeção e géis de agarose
TesouraQualquer marcaN / APara cortar caudas de peixes adultos
SDSSangonA600485Para preparação
de tampão de liseEscovas pequenasQualquer marcaN/APara mover suavemente embriões em placas de microinjecção
EspectrofotómetroThermofisherNanoDrop 2000Para medições de concentração de ADN/RNA
Micrómetro de palcoQualquer marcaDIV (Divisão) = 0,01 mmPara quantificar uma gotícula de 1 nL
Microscópio de fluorescência estéreoOlympusSZX16Para observação da expressão génica
Microscópio estéreoMoticSMZ-168Para observação e microinjecção
T7 RiboMAX Express Sistema de produção de RNA em grande escalaPromegaP1320Transcrição in vitro de sgRNAs, sem RNase
Incubadora com temperatura controladaQualquer marcaN/APara incubação de embriões
TIDETIDEhttps://tide.nki.nl/Para análise da eficiência do sgRNA 
Tricaine metanossulfonatoSigmaA5040Para preparação de solução de tricaína
TrisSangonA600194Para solução de tricaína, tampão de lise e preparação de tampão TAE
TriptonaOXOIDLP0042Para placas LB
PinçasQualquer marcaN / APara agulhas de injeção de corte
XbaINEBR0145SPara enzimático digestão
Extrato de leveduraOXOIDLP0021Para placas LB
Sistema de aquário de peixe-zebraESENESEN-AW-S1Para criação de peixes adultos
Tanques de acasalamento de peixe-zebra (com uma divisória)Qualquer marcaN/APara acasalamento dos peixes
Zeiss LSM 900+Airyscan2ZEISSZeiss LSM900Para imagens confocais dos peixes marcados com fluorescência e análise de dados
Site daZFIN ZFINhttp://zfin.org/Para encontrar informações sobre genes
RNase N sem RNase Cas9

Referências

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