Estabelecimento e comparação de métodos de detecção de atividade T6SS baseados em fluorescência em Acinetobacter baumannii

Summary

Aqui, propomos um método de detecção quantitativa baseado em marcação fluorescente (especialmente Luciferase) para avaliar com eficiência e precisão a atividade do T6SS bacteriano, que é adequado para análise de alto rendimento de cepas clínicas.

Abstract

O Sistema de Secreção Tipo VI (T6SS) é um mecanismo crucial que medeia as interações intercelulares em bactérias Gram-negativas, particularmente em espécies patogênicas como Acinetobacter baumannii. Estudos anteriores mostraram que o grande plasmídeo pAB3 na cepa A. baumannii ATCC 17978 codifica uma proteína semelhante a TetR que inibe a expressão de genes T6SS centrais. Em contraste, a cepa WT^R- , que não possui pAB3, pode expressar e secretar de forma estável a proteína efetora T6SS Hcp e exibe a capacidade de matar E. coli. O gene tssM , um dos genes centrais do T6SS, é essencial para sua atividade; sua exclusão leva diretamente à inativação do T6SS. No entanto, os métodos tradicionais de detecção de atividade T6SS, como ensaios de eliminação, sofrem de baixo rendimento e sensibilidade insuficiente. Para lidar com essas limitações, desenvolvemos métodos de detecção quantitativa baseados na marcação fluorescente.

Para melhorar a detecção da atividade do T6SS, desenvolvemos três métodos de marcação fluorescente: (1) Um método de detecção quantitativa baseado na marcação da luciferase, que é caracterizado por alta especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade, tornando-o adequado para análise de alto rendimento; (2) Um método de detecção baseado na marcação de proteína fluorescente verde (GFP), que, apesar de ser suscetível a interferências ambientais, oferece a vantagem de alto rendimento; (3) Detecção por citometria de fluxo, que pode avaliar quantitativamente a viabilidade bacteriana, mas é operacionalmente complexa e cara. Após uma comparação abrangente, o método de rotulagem baseado em luciferase provou ser o mais preciso, sensível e fácil de usar. Quando aplicado a 20 isolados clínicos de A. baumannii, este método foi confirmado para avaliar com rapidez e precisão a atividade do T6SS.

Introduction

O Sistema de Secreção Tipo VI (T6SS) é um importante sistema de secreção de proteínas em bactérias Gram-negativas, amplamente envolvido na competição bacteriana, antagonismo contra hospedeiros eucarióticos e regulação das respostas imunes do hospedeiro ^1,2. Ao injetar proteínas efetoras tóxicas em bactérias vizinhas ou células eucarióticas, o T6SS ajuda as bactérias a manter uma vantagem competitiva em ambientes complexos. Nos últimos anos, o papel significativo do T6SS na adaptabilidade, patogenicidade e interações microbianas bacterianas o tornou um hotspot de pesquisa, especialmente em patógenos multirresistentes, onde suas funções fornecem alvos potenciais para o desenvolvimento de novas estratégias antibacterianas ^3,4,5.

Acinetobacter baumannii (Ab) é um patógeno oportunista Gram-negativo amplamente distribuído em ambientes hospitalares. Devido à sua alta resistência aos medicamentos e forte adaptabilidade, tornou-se um importante patógeno nosocomial em todo o mundo ^6,7,8. A sobrevivência de A. baumannii em ambientes microbianos complexos depende de múltiplos sistemas de secreção, entre os quais o T6SS desempenha um papel fundamental em sua competição com outros micróbios e interações com o hospedeiro. Com seu cluster de genes T6SS altamente conservado e funções bem definidas, A. baumannii tornou-se um modelo ideal para estudar os mecanismos do T6SS. Além disso, a estrutura única do T6SS em A. baumannii fornece uma perspectiva distinta para revelar ainda mais a diversidade e as funções do T6SS.

O cluster de genes T6SS de A. baumannii contém 12 genes de proteínas centrais (como tssA-tssM, sem tssJ) e vários genes com funções desconhecidas (como tagX, tagN, tagF, etc.)^2,9,10. Dentre eles, a proteína co-regulada pela hemolisina (Hcp) é um componente importante do T6SS, e sua secreção é considerada uma marca registrada do T6SS funcional. Estudos mostraram que o grande plasmídeo pAB3 em A. baumannii inibe a expressão de T6SS codificando uma proteína reguladora semelhante a TetR. Em contraste, cepas que perderam pAB3 (como WT^R-) podem expressar e secretar Hcp de forma estável, exibindo atividade significativa de T6SS¹¹. O gene tssM é um dos genes centrais do T6SS, e sua deleção leva diretamente à inativação do T6SS.

No entanto, os métodos tradicionais de detecção de atividade do T6SS (como ensaios de eliminação) têm limitações como baixo rendimento, baixa reprodutibilidade e sensibilidade insuficiente, o que restringe severamente o estudo aprofundado e a aplicação generalizada do T6SS⁵. Portanto, o desenvolvimento de métodos eficientes e precisos de detecção de atividade de T6SS tornou-se uma necessidade urgente na pesquisa atual. Este estudo tem como objetivo estabelecer e comparar métodos de detecção de atividade de T6SS baseados em marcação fluorescente para superar as deficiências dos métodos tradicionais. Por meio da tecnologia de marcação fluorescente, alcançamos o monitoramento quantitativo em tempo real da atividade do T6SS, fornecendo uma ferramenta mais precisa e confiável para o estudo das interações bacterianas. Este estudo validou a eficácia dos métodos de marcação fluorescente e, ao comparar as vantagens e desvantagens de diferentes estratégias de marcação fluorescente, forneceu novas perspectivas e suporte metodológico para pesquisas futuras. Ele não apenas oferece novos meios técnicos para a pesquisa do T6SS, mas também estabelece uma base científica para a compreensão dos complexos mecanismos de interações bacterianas e o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas antibacterianas.

Protocol

1. Fontes de estirpes e plasmídeos

1. Use a cepa padrão de A. baumannii ATCC 17978, E. coli (pZY01) e a cepa clínica de A. baumannii isolada do Departamento de Medicina Laboratorial do Primeiro Hospital da Universidade de Jilin.
2. Use o plasmídeo pZY01-GFP (carregando um gene de resistência à canamicina, capaz de expressão estável em A. baumannii), que foi modificado e preservado em laboratório, e o plasmídeo adquirido comercialmente pGEN-luxCDABE (carregando um gene de resistência à ampicilina).
3. Cultura de A. baumannii e E. coli em meio Luria-Bertani (LB) ou meio mínimo contendo: tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,4), 15 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, succinato de sódio a 0,2% (p/v) como única fonte de carbono e 0,01% (p/v) de extrato de levedura¹². Adicionar antibióticos nas seguintes concentrações quando necessário: E. coli: ampicilina (100 μg/mL) e canamicina (50 μg/mL); A. baumannii: estreptomicina (100 μg/mL).
   NOTA: E. coli (pZY01) e E. coli (pZY01-GFP) expressam resistência à canamicina. E. coli (pZY01) não possui um marcador fluorescente, portanto, pode ser referido como E. coli no texto a seguir.

2. Preparação de cepas bacterianas antes do experimento

1. Retirar as estirpes bacterianas do congelador a -80 °C 2 dias antes da experiência. Inocular as estirpes bacterianas em placas de ágar LB contendo os antibióticos correspondentes. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
   NOTA: Certifique-se de que todas as células retenham os plasmídeos no início do experimento.
2. Escolha duas colônias individuais independentes de cada cepa bacteriana 1 dia antes do experimento. Inocular cada colónia separadamente em dois tubos individuais contendo 5 ml de LB de meio líquido. Incubar as culturas durante a noite a 37 °C com agitação a 200 rpm. Use essas culturas para experimentos subsequentes.
   NOTA: Otimize o tempo de incubação com base na taxa de crescimento bacteriano para garantir que uma quantidade adequada de biomassa bacteriana seja obtida.

3. Preparação de cepas de E. coli (GFP) / E. coli (Luciferase)

1. Transformação
   1. Adicione 50 ng de DNA de plasmídeo (pZY01-GFP ou pGEN-luxCDABE, quantificado via NanoDrop em A260 / A280) em 100 μL de células competentes para E. coli DH5α, respectivamente, e misture suavemente.
   2. Incubar no gelo durante 30 min, aquecer o choque a 42 °C durante 60 s e colocar imediatamente no gelo durante 30 s.
   3. Adicione 700 μL de caldo LB livre de antibióticos e incube a 37 ° C com agitação a 180 rpm por 2 h.
2. Revestimento e cultura
   1. Centrifugue a 420 × g por 2 min, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 100 μL de caldo LB livre de antibióticos.
   2. Espalhe o produto de transformação pZY01 (GFP) em placas de ágar LB contendo 50 μg / mL de canamicina.
   3. Espalhar o produto de transformação pGEN-luxCDABE em placas de ágar LB contendo 100 μg/ml de ampicilina. Incubar a 37 °C durante a noite.
3. Verificação de clones positivos
   1. Escolha colônias únicas e extraia DNA como modelos de reação em cadeia da polimerase (PCR) no dia seguinte. Realize a amplificação por PCR e verifique por eletroforese em gel de agarose.
   2. Confirme as cepas positivas e rotule-as como E. coli (GFP) e E. coli (Luciferase).
      NOTA: Certifique-se de que a qualidade das células competentes seja alta para uma transformação eficiente. Evite o excesso de líquido bacteriano durante o revestimento para evitar interferência no isolamento de uma única colônia.

4. Western blotting

1. Preparação da amostra
   1. Recolha as culturas bacterianas e centrifugue (1500 × g, 10 min, 4 °C) para separar o sedimento celular e o sobrenadante.
   2. Adicione uma quantidade apropriada de buffer de carga ao pellet da célula e ao sobrenadante. Ferva a 100 °C em banho de metal por 10 min. Centrifugar (1500 g, 10 min, 4 °C) e recolher os sobrenadantes como amostras de proteínas.
   3. Meça a concentração de proteína usando o ácido bicinconínico (BCA) ou o método de Bradford e ajuste para a mesma concentração.
2. Eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE)
   1. Prepare géis SDS-PAGE de concentrações apropriadas (por exemplo, 12% de gel separador, 5% de gel de empilhamento)¹³.
   2. Carregue 20 μg de proteína samples nos poços de gel junto com um marcador de proteína pré-corado de 1-2 μL. Realize eletroforese a 100-120 V até que o indicador azul de bromofenol atinja o fundo do gel.
      NOTA: Tampão de funcionamento: Tris 25 mM, Glicina 192 mM, SDS 0,1% (p / v), água destilada a 1 L.
3. Transferência (Western Blotting)
   1. Remova o gel das placas de vidro e mergulhe-o em tampão de transferência. Prepare uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) ou nitrocelulose (NC), ative a membrana de PVDF com metanol e mergulhe-a em tampão de transferência.
      NOTA: Tampão de transferência: 25 mM Tris, 192 mM de glicina, 20% de metanol
   2. Monte o aparelho de transferência em uma estrutura "sanduíche" (papel de filtro-gel-papel de membrana-filtro). Transfira a 100 V por 60-90 min (ajuste o tempo com base no peso molecular da proteína; As proteínas da célula hospedeira (HCP) têm um peso molecular de aproximadamente 17 kDa).
      NOTA: Coloque o tanque de transferência em água gelada e adicione bolsas de gelo para manter uma temperatura baixa. Se o tempo de transferência for longo, substitua as bolsas de gelo no meio do caminho.
4. Bloqueio
   1. Após a transferência, coloque a membrana em solução de bloqueio de leite desnatado a 5%. Bloquear à temperatura ambiente (RT) num agitador durante 1 h ou durante a noite a 4 °C.
5. Incubação primária de anticorpos
   1. Lave a membrana três vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 0,1% de tampão Tween 20 (TBST), 5 min de cada vez. Incubar a membrana com anticorpos primários diluídos (anticorpo anti-HCP de ratinho, diluição de 1:1000; anticorpo anti-isocitrato desidrogenase de ratinho (ICDH), diluição de 1:1000) a 4 °C durante a noite ou RT durante 2 h.
6. Incubação secundária de anticorpos
   1. Lave a membrana com tampão TBST 3 vezes, 5 min cada. Incubar a membrana com anticorpo secundário diluído (Imunoglobulina G anti-camundongo conjugada com peroxidase de rábano [HRP], diluição 1:3000) em RT por 2 h.
7. Detecção
   1. Lave a membrana com tampão TBST 3 vezes, 5 min cada. Prepare o substrato quimioluminescente ECL e aplique-o uniformemente na membrana.
   2. Detecte sinais usando um sistema de imagem de quimioluminescência e capture imagens (a proteína HCP tem um peso molecular de aproximadamente 17 kDa, ICDH é uma enzima metabólica citoplasmática com um peso molecular esperado de aproximadamente 45 kDa em A. baumannii).
      NOTA: O ICDH é um importante marcador de controle de qualidade que só pode ser detectado na fração de pellets celulares (contendo bactérias intactas) e não na fração sobrenadante (contendo proteínas secretadas), demonstrando assim que não ocorreu lise celular durante a preparação da amostra. A secreção de Hcp (17 kDa) só deve ser visível em sobrenadantes de cepas ativas de T6SS.

5. Preparação de placas de 96 poços com meio de ágar LB

1. Adicione rapidamente meio de ágar LB autoclavado sem antibióticos, pré-aquecido, em uma placa estéril de 96 poços, 50 μL por poço. Deixe a placa descansar em RT por pelo menos 1 h para garantir a solidificação completa do meio.
2. Use placas de paredes pretas com fundo transparente para detectar a fluorescência GFP.
3. Use placas de 96 poços à prova de luz para detectar a fluorescência da luciferase para evitar interferência de fluorescência entre poços.
   NOTA: Evite gerar bolhas ao adicionar o meio para garantir uma espessura uniforme do gel, o que promove o contato e o crescimento bacteriano ideais.

6. Ensaio de morte de A. baumannii

1. Ensaio padrão de morte
   1. Cultive cepas mutantes WT^R- e ΔtssM durante a noite a 37 ° C com agitação em meio LB suplementado com 100 μg / mL de estreptomicina, cultive E. coli separadamente em meio LB contendo 50 μg / mL de canamicina em condições idênticas.
   2. Lave as culturas bacterianas duas vezes com PBS estéril e ressuspenda-as em meio LB fresco e sem antibióticos. Ajuste o OD₆₀₀ para 1,0 para padronização.
   3. Misture as cepas mutantes WT^R- e ΔtssM com E. coli na proporção de 1:1.
   4. Localize 10 μL da suspensão bacteriana mista em placas de ágar LB sem antibióticos e incube a 37 ° C por 6 h.
   5. Raspe as manchas bacterianas e ressuspenda-as em 1 mL de PBS. Execute cinco diluições seriais de 10 vezes.
   6. Localize 10 μL das suspensões bacterianas diluídas em placas LB contendo canamicina e incube durante a noite a 37 °C.
   7. Analise a atividade antibacteriana dependente de T6SS de cepas mutantes WT^R- e ΔtssM por contagem de colônias.
      NOTA: Garanta a mistura completa de suspensões bacterianas para evitar erros experimentais. Execute pelo menos três réplicas independentes para cada amostra para garantir a confiabilidade dos dados.
2. Detecção quantitativa da atividade de T6SS usando marcação com luciferase
   1. Padronize o OD₆₀₀ de E. coli (Luciferase), WT^R-, mutantes ΔtssM e outras cepas (por exemplo, ATCC 17978, E. coli, Ab # 40, Ab # 170, Ab # 180) para 1.0. Adicione 5 μL de suspensão bacteriana a uma placa de 96 poços contendo ágar LB livre de antibióticos. Após a secagem ao ar no escuro, meça a bioluminescência à base de luciferase para verificar a especificidade da luminescência de E. coli (luciferase).
   2. Realize uma diluição serial de 5 vezes de E. coli (luciferase). Localize 10 μL da suspensão bacteriana diluída em uma placa de 96 poços com ágar LB e uma placa vazia de 96 poços (ambas à prova de luz). Meça a bioluminescência à base de luciferase para avaliar a sensibilidade do método de detecção baseado em luciferase e confirmar se o ágar LB interfere no sinal de luminescência.
   3. Misture E. coli (luciferase) com mutantes WT^R-, ΔtssM e 20 cepas clínicas (OD₆₀₀ padronizado para 1,0) na proporção de 1:1. Dilua 10 vezes, adicione 5 μL a uma placa de 96 poços e configure três réplicas técnicas.
   4. Após a secagem ao ar no escuro, meça a bioluminescência. Incubar a 37 °C no escuro durante 4-6 h e, em seguida, medir novamente a bioluminescência (comprimento de onda de emissão: 562 nm).
   5. Avalie quantitativamente a atividade antibacteriana dependente de T6SS comparando os valores de bioluminescência antes e depois da co-cultura.
      NOTA: Garanta a mistura completa de suspensões bacterianas para evitar erros experimentais. Execute pelo menos três réplicas independentes para cada amostra para garantir a confiabilidade dos dados. Use o teste t de Student para análise estatística.
3. Detecção de atividade de T6SS usando rotulagem GFP
   1. Siga o mesmo procedimento do experimento de marcação da luciferase (comprimento de onda de excitação: 480 nm, comprimento de onda de emissão: 509 nm).
   2. Misture E. coli (GFP) com mutantes WT^R- e ΔtssM (OD₆₀₀ padronizado para 1,0) na proporção de 1:1. Posicione 10 μL em placas de ágar LB sem antibióticos. Após a secagem ao ar em RT, capture imagens usando o canal de fluorescência GFP (programa Alex488, excitação: 488 nm, emissão: 509 nm) de um sistema de imagem multifuncional.
   3. Incube a 37 °C no escuro por 4-6 h e, em seguida, capture as imagens novamente. Avalie a atividade do T6SS com base nas mudanças na intensidade de fluorescência das manchas bacterianas.
      NOTA: Execute todas as etapas no escuro para evitar interferência nos sinais de fluorescência. Garantir uma mistura completa de suspensões bacterianas para evitar erros experimentais. Execute pelo menos três réplicas independentes para cada amostra para garantir a confiabilidade dos dados.
4. Detecção por citometria de fluxo
   1. Misture WT^R- com E. coli (GFP) e mutantes ΔtssM com E. coli (GFP) na proporção de 1:1. Pegue uma quantidade apropriada da suspensão bacteriana mista e dilua-a até uma concentração adequada (normalmente OD₆₀₀ de 0,1-0,5) usando PBS estéril ou tampão 1×.
      NOTA: 1× tampão refere-se ao tampão de coloração por citometria de fluxo (1×), os ingredientes incluem: 1× PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4), complementado com: 2-5% (v / v) FBS inativado por calor (ou 1% BSA como alternativa), 2 mM EDTA.
   2. Centrifugar a suspensão bacteriana mista diluída a 300 x g durante 2 min e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 1 mL de PBS estéril ou 1× tampão e misture delicadamente. Filtrar a solução ressuspensa através de um filtro de células de 35 μm para remover os agregados e assegurar uma suspensão unicelular.
   3. Ligue o citômetro de fluxo, pré-aqueça o laser e calibre o instrumento.
      1. Defina os parâmetros de detecção: use um laser de 488 nm para excitar GFP. Canal de detecção: FL1 (normalmente um filtro de 530/30 nm para detecção de fluorescência GFP). Defina os parâmetros de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) para distinguir as células bacterianas.
      2. Use E. coli não rotulada como controle negativo, ajuste a tensão e o ganho e certifique-se de que a população negativa para GFP esteja na linha de base do sinal de fluorescência.
   4. Misturar suavemente a amostra filtrada e transferir 100 μL para um tubo de citometria de fluxo.
      1. Analise as amostras usando as seguintes configurações do instrumento: Defina o limite FSC-H em 19.000 para excluir detritos, com valores de ganho de 100 (FSC), 110 (SSC) e 80 (FITC).
      2. Para gating, exclua inicialmente detritos e sinais não-alvo no gráfico de dispersão FSC-A vs. SSC-A, seguido de análise populacional no canal FITC. Adquira um mínimo de 10.000 eventos da população-alvo (definida pelas características do FSC/SSC) para cada amostra.
   5. Analise os dados usando um software de citometria de fluxo (por exemplo, FlowJo, BD FACSDiva).
      1. Plote gráficos de dispersão FSC vs. SSC para bloquear a população bacteriana alvo. Plote histogramas de fluorescência FL1 para distinguir populações GFP-positivas e GFP-negativas.
      2. Calcule a porcentagem de células positivas para GFP e a intensidade média de fluorescência (MFI).
   6. Centrifugar a restante suspensão bacteriana mista a 300 g durante 2 min e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 10 μL de água estéril e coloque-o em placas de ágar LB sem antibióticos.
   7. Incubar a 37 °C no escuro durante 5 h, depois raspar as manchas bacterianas e ressuspendê-las em 500 μL de PBS 1×. Pegue 100 μL da solução ressuspensa, dilua adequadamente e execute a detecção por citometria de fluxo, repetindo as etapas 6.4.4-6.4.5.
   8. Compare a porcentagem de células positivas para GFP e a intensidade de fluorescência antes e depois da co-cultura. Avaliar o efeito de morte dos mutantes WT^R- e ΔtssM em E. coli (GFP).
      NOTA: Garanta uma suspensão de célula única para evitar que a agregação celular afete os resultados da detecção. Calibre o instrumento antes da detecção para garantir a precisão e reprodutibilidade dos sinais de fluorescência. Evite expor amostras a luz forte durante o experimento para evitar a extinção de fluorescência GFP. Execute pelo menos três réplicas para cada amostra para garantir a confiabilidade dos dados.

Results

Os métodos tradicionais para detectar a atividade do T6SS geralmente envolvem a co-cultura de cepas predadoras e alvo em placas de ágar LB livres de antibióticos por 5 h, seguidas de raspagem das manchas bacterianas, ressuspensão-as e realização de diluições em série. A suspensão bacteriana diluída é então detectada em placas de ágar selectivas. Ao contar as colônias da cepa alvo nas placas no dia seguinte, a atividade do T6SS pode ser avaliada qualitativamente. No entanto, esse método tem limitações, incluindo procedime...

Discussion

O Sistema de Secreção Tipo VI (T6SS) é uma maquinaria multiproteica complexa cujas funções são realizadas principalmente através da secreção de proteínas efetoras. Essas proteínas efetoras medeiam a competição interbacteriana matando ou inibindo outras espécies bacterianas, proporcionando assim à bactéria hospedeira uma vantagem competitiva nas comunidades microbianas¹⁵. Além de seu papel na competição, estudos mostraram que o T6SS está envolvido em vários process...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10%, 15% Kit de Preparação de Gel SDS-PAGE	Epizyme	PG112-20
° C Freezer	Haier	HYCD-290
37 ° C Incubadora	Bluepard	181254254
4 ° Geladeira C	Haier	HYC390-80
° C Freezer	Haier	DW-86L726G(726L)
Placa de 96 poços	JET	TCP010096
Agar	Biofrox	8211KG001
Persulfato de Amônio (APS)	Thermo	7727-54-0
Gabinete de Segurança Biológica	ESCO	AC2-4S1
Balança Eletrônica	Sartorius AG	BSA124S-CW
Aparelho de eletroforese	BIO-RAD	POWER
Máquina de gelo em flocos	GRANT	XB70
Citômetro de fluxo	BECKMAN COULTER	AW38143
Citometria de fluxo Tampão de coloração	proteintech	PF00018
Gel Imaging System	BIO-RAD	Gel Doc 2000
Glycine	Zike	ZK-L2577
Centrífuga de alta velocidade	Eppendorf	5405IN106358
Anticorpo secundário de coelho / camundongo conjugado com HRP	proteintech	SA00001-2
LB Caldo	Solarbio	L8291
Centrífuga de alta velocidade de baixa temperatura	Thermo	17R
Metanol	Thermo	R40121
Micro UV-Vis Espectrofotômetro	Thermo	Nanodrop uma
Microcentrífuga	allsheng	Mini-6k
Microplate Reader	Bio-Tek	H1M
NuPAGE LDS Sample Buffer	Thermo	NP0007
Solução de tampão de fosfato (PBS)	Zike	ZK-L1649
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610374
SDS Tampão de carregamento de amostra	Beyotime	poo15L
Leite em pó desnatado	Thermo	LP0033B
Dodecyl Sulfate de sódio (SDS)	Zike	zk6885
Banho-maria termostático	JingHong	DK-420S
Aparelho de Transferência	Bio-Rad	PowerPac HC
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)	Zike	ZK-L2557
Aparelho de Eletroforese Vertical	Bio-Rad	Mii-PROTEAN Tetra