O presente protocolo descreve um método cirúrgico padronizado para a indução de aneurismas carotídeos em modelo murino por meio de uma única operação cirúrgica.
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Artigo de método
Um modelo murino de formação de aneurisma carotídeo
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Os aneurismas cerebrais estão presentes em aproximadamente 2%-5% da população e representam um importante problema de saúde pública devido às suas altas taxas de mortalidade e morbidade por ruptura. Apesar dos avanços na pesquisa, o desenvolvimento de modelos animais eficazes e reprodutíveis continua sendo um desafio. Dentre os modelos disponíveis, os aneurismas induzidos cirurgicamente são amplamente utilizados; no entanto, a complexidade técnica desses procedimentos muitas vezes limita sua acessibilidade. Esses métodos requerem ampla experiência cirúrgica e estão associados a taxas mais altas de mortalidade intraoperatória ou formação inconsistente de aneurismas, o que pode comprometer a confiabilidade dos resultados experimentais. Para abordar essas limitações, este artigo em vídeo apresenta um procedimento cirúrgico simplificado para indução de aneurismas carotídeos em camundongos, realizado em uma única sessão. Essa abordagem simplificada demonstrou uma impressionante taxa de sucesso de 87% na indução de aneurismas carotídeos em camundongos fêmeas. Ao reduzir os desafios técnicos e melhorar a reprodutibilidade, este método fornece uma alternativa prática e confiável para a pesquisa de aneurismas cerebrais. Sua ampla adoção pode facilitar estudos padronizados, acelerar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e, em última análise, avançar nossa compreensão da fisiopatologia do aneurisma.
Introdução
Os aneurismas cerebrais são dilatações localizadas nas paredes dos vasos sanguíneos cerebrais, afetando aproximadamente 2% a 5% da população em geral. A ruptura desses aneurismas pode resultar em hemorragia subaracnoidea, que acarreta altas taxas de mortalidade e morbidade 1,2. Compreender a patogênese dos aneurismas cerebrais e identificar potenciais alvos terapêuticos requer modelos animais confiáveis e reprodutíveis que mimetizem a doença humana. Este artigo apresenta um método cirúrgico padronizado para indução de aneurismas carotídeos em camundongos, oferecendo uma alternativa prática e eficiente aos modelos intracranianos mais exigentes tecnicamente3.
O desenvolvimento desta técnica é motivado pelos desafios associados aos modelos de aneurismas cerebrais existentes. Os modelos de aneurismas intracranianos, embora amplamente utilizados, requerem procedimentos cirúrgicos complexos e são limitados pelo pequeno calibre dos vasos intracranianos, o que dificulta sua utilidade para testar dispositivos endovasculares e outras intervenções 4,5. Além disso, variações nos métodos usados entre os estudos - como diferenças nas concentrações de elastase e tempos de exposição - reduzem a reprodutibilidade e dificultam as comparações entre os estudos. Ao padronizar o procedimento, essa técnica aborda essas limitações e fornece uma alta taxa de sucesso da indução do aneurisma com risco cirúrgico mínimo.
Comparado a métodos alternativos, o modelo de aneurisma carotídeo oferece várias vantagens distintas. Primeiro, o procedimento cirúrgico simplificado reduz as barreiras técnicas, tornando-o mais acessível a uma gama mais ampla de laboratórios. Em segundo lugar, o maior calibre da artéria carótida em comparação com os vasos intracranianos facilita o teste de abordagens terapêuticas, incluindo dispositivos endovasculares. Estudos anteriores demonstraram variações desse modelo com resultados promissores, mas protocolos inconsistentes têm reprodutibilidade limitada 6,7. Nossa abordagem refina esses métodos, alcançando uma taxa de sucesso de 87% em camundongos fêmeas e garantindo consistência entre os experimentos.
No contexto mais amplo da literatura, os modelos animais para aneurismas cerebrais são fundamentais para a compreensão dos mecanismos da doença, avaliação de alvos terapêuticos e desenvolvimento de estratégias de intervenção. Modelos foram desenvolvidos em várias espécies, incluindo peixe-zebra, ratos, coelhos e cães, cada um com vantagens e limitações únicas 3,8. Este modelo de aneurisma carotídeo complementa o repertório existente, oferecendo um equilíbrio entre viabilidade técnica e relevância para doenças humanas, tornando-o uma opção ideal para pesquisadores que buscam um modelo confiável e reprodutível para estudos pré-clínicos.
Este método é particularmente adequado para laboratórios que pretendem investigar os fundamentos moleculares e biomecânicos da formação de aneurismas, testar agentes farmacológicos ou avaliar dispositivos endovasculares. Os pesquisadores devem considerar se as características anatômicas e fisiológicas deste modelo se alinham com seus objetivos experimentais específicos. Ao fornecer um protocolo padronizado e reprodutível, essa técnica visa avançar na pesquisa de aneurismas cerebrais e promover maior consistência entre os estudos da área.
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Protocolo
O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh (IS00022015). Camundongos C57BL/6J fêmeas do tipo selvagem (WT), com 6-8 semanas de idade, foram usados para os experimentos. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação animal
- Induza a anestesia.
- Coloque o camundongo em uma câmara de indução e administre o gás isoflurano na concentração de 3% a 4% para indução usando um sistema vaporizador de anestesia (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Ajuste a taxa de fluxo para 1,0-1,5 L/min de oxigênio.
- Monitore o animal quanto a sinais de anestesia completa (por exemplo, falta de resposta a estímulos externos e frequência respiratória reduzida).
- Transferência para o local da cirurgia.
- Assim que o camundongo estiver totalmente anestesiado, transfira-o para a estação cirúrgica, mantendo a anestesia com isoflurano em uma concentração de manutenção de 1-3% e uma taxa de fluxo de oxigênio de 0,8-1,0 L/min. Certifique-se de que o mouse esteja conectado ao sistema de administração de anestesia por meio de um cone nasal.
- Manutenção da temperatura.
- Posicione o mouse em uma almofada de aquecimento pré-ajustada para 36 °C. Conecte uma sonda de temperatura para monitorar continuamente a temperatura corporal durante todo o procedimento. Ajuste a configuração da almofada de aquecimento, se necessário, para manter uma temperatura estável.
2. Preparação para a cirurgia
- Imobilize o animal.
- Coloque o mouse na posição supina. Use tiras de fita cirúrgica para prender suavemente cada membro à plataforma cirúrgica, garantindo que o corpo esteja estabilizado sem tensão indevida.
- Depile a área do pescoço.
- Usando pequenos cortadores cirúrgicos, raspe o pelo da região do pescoço (área de aproximadamente 2 cm x 2 cm). Remova os pelos soltos com gaze cirúrgica estéril.
- Esterilize o local da cirurgia.
- Aplique duas rodadas de solução de iodopovidona na área do pescoço usando aplicadores com ponta de algodão, seguidas por duas rodadas de etanol a 70%. Deixe a área secar ao ar entre as aplicações para garantir a esterilização adequada.
3. Estágio I: ligadura da artéria carótida comum
- Confirme a anestesia.
- Realize um teste de pinça do dedo do pé usando uma pinça romba. A falta de retirada ou movimento reflexo confirma a anestesia adequada.
- Realize a incisão na linha média.
- Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão vertical de 1 cm ao longo da linha média do pescoço, começando logo abaixo da linha da mandíbula. Corte a derme e a fáscia subjacente.
- Exponha a glândula submandibular.
- Use uma pinça romba para mobilizar a glândula submandibular lateralmente, tomando cuidado para não danificar os tecidos circundantes. Levante suavemente a glândula e separe-a do esterno por dissecção romba.
- Prenda a glândula com um pequeno afastador ou clipe estéril para manter um campo cirúrgico claro.
- Exponha o músculo esternocleidomastóideo (SCM).
- Identifique visualmente o músculo esternocleidomastóideo ipsilateral (SCM). Use uma pinça romba para levantar o músculo suavemente e enfie uma sutura de seda trançada 5-0 por baixo. Reflita o músculo lateralmente puxando suavemente a sutura para expor a bainha carotídea.
- Isole a artéria carótida.
- Abra a bainha carotídea usando uma pinça afiada. Separe cuidadosamente a artéria carótida da veia jugular adjacente e do nervo vago.
- Para melhorar a visibilidade, insira um manguito de silicone estéril ou afastador sob a artéria carótida. Evite causar trauma na artéria ou nas estruturas circundantes.
- Ligue a artéria carótida.
- Usando uma pinça afiada, retire a artéria carótida e passe uma sutura 9-0 por baixo. Dê um nó duplo seguro para ligar a artéria, garantindo a tensão adequada para ocluir o fluxo sanguíneo sem danificar o vaso. Apare as extremidades da sutura para minimizar a irritação do tecido.
- Feche a incisão.
- Aproxime as bordas da pele usando sutura de náilon estéril (5-0) ou grampos cirúrgicos. Aplique uma leve pressão com gaze estéril para garantir a hemostasia.
4. Cuidados pós-operatórios
- Monitore o animal.
- Observe o animal diariamente em busca de sinais clínicos de complicações, como ruptura prematura do aneurisma (evidenciada por letargia ou hematoma súbito), acidente vascular cerebral, convulsões ou perda de peso significativa (>10% do peso basal).
- Sacrificar prontamente os animais (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente) que apresentem sintomas graves para minimizar a dor e o sofrimento.
- Tratamento de feridas
- Imediatamente após a cirurgia, aplique gel de lidocaína a 4% no local da incisão para alívio da dor local. Aplique uma fina camada de pomada antibiótica (por exemplo, bacitracina) para prevenir a infecção. Repita o tratamento da ferida diariamente por pelo menos 3 dias ou até que a ferida mostre sinais de cicatrização.
- Ambiente de recuperação
- Coloque o animal em uma gaiola de recuperação limpa com cama macia. Garanta o acesso a fluidos aquecidos ou a um gel de hidratação para ajudar na recuperação. Monitore até que o animal esteja totalmente acordado e móvel e, em seguida, devolva-o ao seu alojamento padrão.
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Resultados
Um total de 15 camundongos fêmeas do tipo selvagem (WT) foram submetidos ao procedimento de indução do aneurisma seguindo o protocolo padronizado descrito (Figura 1). Duas semanas após a cirurgia, a formação de aneurisma foi alcançada com sucesso em aproximadamente 87% dos camundongos, conforme confirmado pelo exame morfológico macroscópico (Figura 2 e Figura 3). Ess...
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Discussão
O modelo de aneurisma carotídeo induzido por ligadura da artéria carótida foi inicialmente descrito na década de 1970 por Yasargil e Matsuda, que utilizaram enxertos venosos para induzir o desenvolvimento do aneurisma 9,10. Modificações subsequentes a essa técnica, incluindo a adição de tratamento com elastase e ligadura carotídea, permitiram a geração de aneurismas carotídeos maiores de maneira mais eficiente e rápida
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sutura trançada absorvível 5-0 | Ethicon / Ethilon | J463G | |
| Sutura monofilamento 5-0 não absorvível | Ethicon / Ethilon | 8698G | |
| Sutura monofilamento não absorvevelmente 9-0 | Ethicon / Ethilon | 2829G | |
| Absorventes de preparação para álcool | Medline | CUR45585RB | |
| Animal Pocket Pro Shaver | Wahl | 9861-900 | |
| Pinça Dumont #5 | Roboz | RS-5058 | |
| Pinça de Titânio Dumont; Padrão #5 | Roboz | RS-5050 | |
| Pinça Graefe | Roboz | RS-5138 | |
| Pinças de tecido Graefe | Roboz | RS-5155 | |
| lidocaína, 4%, tópica | Medline | 52565-009-50 | |
| Micro-clip reto, 5 mm | Roboz | RS-5420 | |
| Tesouras microdissecadoras | Roboz | RS-5610 | |
| Micro-Sclip reto, 8 mm | Roboz | RS-5424 | |
| Pinça de mosquito, 4" | Roboz | RS-7100 | |
| Luvas de nitrilo | Fisherbrand | 19-130-1597 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Elastase pancreática suína | Worthington | LS002274 | |
| Povidona-iodo | Medline | MDS093943 | |
| Tesoura, extra fina | Roboz | RS-5880 | |
| Tesoura, tudo bem | Roboz | RS-5840 | |
| Solução salina estéril de 0,9% | Baxter | 2B1324X | |
| Aplicador de algodão estéril | Dynarex | 4303 | |
| Toalhas cirúrgicas descartáveis estéreis, azul | Medline | MDT2168202H | |
| Revestimento Transparente Tegaderm | 3M | 1624W |
Referências
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- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. E. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369 (9558), 306-318 (2007).
- Strange, F., Gruter, B. E., Fandino, J., Marbacher, S. Preclinical intracranial aneurysm models: A systematic review. Brain Sci. 10 (3), 134(2020).
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- Yasargil, M. G., Fox, J. L. The microsurgical approach to intracranial aneurysms. Surg Neurol. 3 (1), 7-14 (1975).
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- Dolan, J. M., Kolega, J., Meng, H. High wall shear stress and spatial gradients in vascular pathology: A review. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1411-1427 (2013).
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- Broderick, J. P. Jr Unruptured intracranial aneurysms: Epidemiology, natural history, management options, and familial screening. Lancet Neurol. 13 (4), 393-404 (2014).
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Reimpressões e permissões
