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Estudando interações entre células mieloides e células T CAR in vitro e in vivo

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DOI:

10.3791/68013

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25 de julho de 2025

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1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 4Division of Hematology, Mayo Clinic, 5Department of Immunology, Mayo Clinic

Neste artigo

Resumo

Dados os modelos limitados de xenoenxerto disponíveis para estudar as interações entre CART humano e células mieloides, estabelecemos modelos in vitro e in vivo para entender os impactos dos macrófagos humanos nas células CART. Os resultados podem ser potencialmente generalizados para avaliar os papéis dos macrófagos no microambiente tumoral e testar imunoterapias direcionadas a macrófagos.

Resumo

A terapia com células do receptor T do antígeno quimérico (CART) levou a notáveis sucessos clínicos no tratamento de malignidades hematológicas. No entanto, a maioria dos pacientes recidiva dentro de 1-2 anos. Vários mecanismos que levam à resistência ao CART foram identificados, incluindo a inibição de células T por células mieloides imunossupressoras. Evidências crescentes mostraram que monócitos e macrófagos no microambiente tumoral (TME) contribuem para o baixo desempenho do CART e resultados clínicos. Os modelos pré-clínicos para estudar as interações entre macrófagos humanos e células CART são limitados. Aqui, discutimos abordagens para entender os impactos dos macrófagos humanos nas células CART tanto in vitro quanto in vivo. Descrevemos modelos de cocultura in vitro para mostrar que macrófagos imunossupressores inibem as funções do CART. Além disso, relatamos um modelo de xenoenxerto em que macrófagos humanos e células tumorais são enxertados por via subcutânea em camundongos NSG para estudar as interações de macrófagos semelhantes a M2 com células CART e células tumorais. Esses modelos podem ser usados para avaliar os papéis dos macrófagos no TME e testar imunoterapias contra o câncer direcionadas a macrófagos.

Introdução

A terapia com células T do receptor de antígeno quimérico autólogo (CART) alcançou sucessos clínicos no tratamento de malignidades hematológicas recidivantes ou refratárias, o que levou à aprovação da FDA dos EUA de seis produtos CART direcionados ao antígeno de maturação de células B (BCMA) CD19. Apesar da impressionante atividade inicial da terapia com células CART, a maioria dos pacientes recidiva nos primeiros 1-2 anos após o tratamento2. Vários mecanismos de resistência ao CART foram identificados, incluindo aptidão subótima das células T, escape de antígeno e baixa persistência do CART, bem como inibição mediada pelo microambiente tumoral imunossupressor (TME)2,3. As células mieloides, como monócitos e macrófagos, geralmente compreendem uma parte significativa do TME e demonstraram ser os principais inibidores de outras células imunes, incluindo as células T 4,5. Os efeitos prejudiciais das células mieloides no contexto da eficácia terapêutica das células CART foram relatados em modelos pré-clínicos e em ensaios clínicos de tumores hematológicos e sólidos 3,6. A inibição mediada por mielóides pode ocorrer desde o início do processo de fabricação do CART - foi demonstrado que os monócitos no produto inicial da aférese inibem a expansão ex vivo do CART 7,8. Dada a evidência acumulada de inibição de CART mediada por mieloide, muitos estudos têm como objetivo projetar células CART para direcionar e eliminar macrófagos imunossupressores em TME para melhores respostas imunes5. No entanto, os mecanismos por trás das interações entre células CART e macrófagos imunossupressores ainda não estão totalmente elucidados. Além disso, existem modelos limitados de xenoenxerto disponíveis publicamente dessas interações. Portanto, há uma necessidade urgente de modelos que estudem as interações entre macrófagos humanos e células CART tanto in vitro quanto em modelos de camundongos.

Aqui, descrevemos um método em que células CART humanas direcionadas a CD19 (CART19) são cocultivadas com células tumorais CD19+ e macrófagos semelhantes a M2 polarizados ex vivo . Além disso, relatamos um modelo de camundongo xenoenxerto no qual camundongos imunodeficientes são enxertados por via subcutânea com células-alvo e macrófagos humanos, permitindo a avaliação de imunoterapias de interesse em um ambiente com macrófagos imunossupressores. Especificamente, analisamos a proliferação específica do antígeno CART na presença ou ausência de macrófagos imunossupressores in vitro, mostrando inibição significativa na expansão de células T em placas de co-cultura transwell e direta. Em nosso modelo de xenoenxerto, camundongos NSG foram enxertados por via subcutânea com células tumorais e macrófagos humanos suspensos em Matrigel para triagem terapêutica. Este modelo animal mostrou com sucesso que macrófagos humanos imunossupressores diferenciados ex vivo foram capazes de promover a progressão tumoral em camundongos NSG. Seguindo este protocolo, a eficácia da terapêutica imunossupressora direcionada a macrófagos pode ser testada, incluindo a de medicamentos de moléculas pequenas, biológicos e outras terapias baseadas em células. No entanto, devido às limitações do uso de camundongos imunodeficientes para estudar o TME humano, os modelos propostos são mais adequados para estudos de prova de conceito.

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Protocolo

O protocolo abaixo segue as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Mayo Clinic, do Comitê Institucional de Biossegurança (IBC) e do Departamento de Medicina Comparada sob o protocolo A00001767 do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.

1. Preparação de monócitos clássicos humanos para estudo in vitro

  1. Isole as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores de sangue saudáveis, conforme descrito anteriormente9. Resumidamente, dilua o sangue total com 2% de FBS em PBS em uma proporção de volume de 1:1, seguido de isolamento de PBMC em meio de gradiente de densidade.
  2. Isolar monócitos clássicos humanos (CD14+CD16-) de PBMCs colhidos por seleção de esferas magnéticas negativas de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Lavar brevemente o número adequado de PBMCs com tampão de isolamento e ressuspender as células no volume indicado de acordo com as instruções do fabricante. Rotular células, exceto monócitos clássicos, com um coquetel de anticorpos e microesferas magnéticas. Colete monócitos clássicos do fluxo, retendo os não monócitos nas colunas.
    NOTA: Suponha que 5% de todos os PBMCs sejam monócitos clássicos e ajuste o número de células iniciais de PBMCs de acordo. Guarde os PBMC restantes para confirmação da pureza da população de monócitos na etapa 1.7. Os monócitos clássicos devem sempre ser isolados de PBMCs frescas sem criopreservação prévia.
  3. Contar o número de monócitos isolados utilizando um contador de células (Tabela de Materiais) e centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Ressuspenda as células no tampão de isolamento celular para atingir 1 x 106 células/mL como concentração final. Pegue 100 μL de suspensão celular e transfira para uma placa de fundo plano de 96 poços.
  4. Transfira 1 x 105 PBMCs para a mesma placa como um controle de passagem negativa para confirmar a pureza clássica da população de monócitos por citometria de fluxo. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Mantenha os monócitos isolados no gelo durante as etapas 1.5-1.12.
  5. Lave ressuspendendo as células com 200 μL de tampão FACS e desligue as células a 300 x g a 4 ° C por 3 min. Decantar cuidadosamente os sobrenadantes.
  6. Para cada amostra, prepare 50 μL de tampão FACS contendo 0,3 μL de reagente vivo/morto (excitação a 405 nm), 0,5 μL de CD1410 anti-humano conjugado com APC (1 ng/μL) e 0,5 μL de CD16 11 anti-humano conjugado comPE (1 ng/μL; Tabela de Materiais).
    NOTA: Para manter a coloração consistente, faça uma mistura principal para várias amostras de acordo com o número total da amostra. Transfira 50 μL de solução de coloração para cada poço.
  7. Adicione 50 μL de solução de coloração a cada poço e misture suavemente as células para evitar bolhas. Incube as células no escuro à temperatura ambiente por 15 min.
  8. Adicione 200 μL de tampão FACS a cada poço e desligue as células a 300 x g a 4 °C por 3 min. Decantar cuidadosamente os sobrenadantes.
  9. Lave adicionando 200 μL de tampão FACS a cada poço e gire as células a 300 x g a 4 ° C por 3 min. Decantar cuidadosamente os sobrenadantes e ressuspender as células em 200 μL de tampão FACS. Execute amostras em um citômetro de fluxo (Tabelas de Materiais).
  10. População de portões CD14+CD16- . Certifique-se de que a população CD14 + CD16- esteja acima de 90% das células vivas para uma pureza ideal. Gate CD14+CD16- população de singletos vivos.
    NOTA: Supõe-se que os usuários estejam familiarizados com a análise por citometria de fluxo.

2. Diferenciação de macrófagos M0 de monócitos clássicos humanos

NOTA: A diferenciação de macrófagos semelhantes a M2 de monócitos clássicos humanos é adaptada de uma publicação anterior12.

  1. Spin down monócitos isolados a 300 x g a 4 ° C por 5 min e aspire os sobrenadantes. Ressuspenda as células em meios de cultura de células para atingir uma concentração final de 1 x 106 células/mL.
  2. Adicione GM-CSF recombinante humano para atingir uma concentração final de 10 ng/mL (Tabela de Materiais) e misture bem. Transfira 100 μL de células para uma placa de 48 poços tratada com cultura de tecidos e adicione mais 50 μL de meio de cultura de células. Certifique-se de que cada condição tenha 3 réplicas para a leitura final no dia 11.
    NOTA: Os usuários podem adicionar mais grupos experimentais de acordo. Este protocolo inclui apenas coculturas experimentais de células tumorais e células T com ou sem macrófagos M2-like (Tabela 1).
  3. Transfira 100 μL de células para outra placa de 48 poços e adicione mais 50 μL de meio de cultura de células para fenotipagem de macrófagos. Certifique-se de incluir um poço para fenotipagem de macrófagos M0 e outro para fenotipagem de macrófagos semelhantes a M2.
  4. Adicione 200 μL de PBS nos poços circundantes para evitar a evaporação da cultura de células. Incubar monócitos a 37 °C durante 7 dias para diferenciar as células em macrófagos M0.
  5. Para estudar as interações entre macrófagos diferenciados e células CART19 compatíveis com doadores, isole 1 x 107 células T das PBMCs do mesmo doador e gere células CART19 seguindo um procedimento de produção de CART de 8 dias, conforme descrito anteriormente 9,13,14.
    NOTA: As células CART coestimuladas com domínio de sinalização CD28 são geradas a partir de 5 x 106 células T, conforme descrito anteriormente 9,13,14. Paralelamente, as células T não transduzidas (UTD) são geradas seguindo o mesmo processo 9,13,14. As células T UTD serão usadas como controle negativo na proliferação de células T para controlar a proliferação alogênica.

3. Diferenciação de macrófagos semelhantes a M2 de macrófagos M0 por meio de cocultura com células-alvo

  1. No dia 7, pegue a placa de 48 poços com macrófagos M0 e incube no gelo por pelo menos 30 min. Pipete vigorosamente as células constantemente, mantendo o prato no gelo.
    NOTA: A duração da incubação do gelo depende de quão aderentes são os macrófagos, que podem ser diferentes devido à variação do doador. A primeira mistura é coletar macrófagos fracamente aderentes, portanto, uma pipetagem de 5 minutos deve ser suficiente.
  2. Transferir as células separadas para um novo tubo cónico de 15 ml (Tabela de Materiais) pré-arrefecido em gelo. Adicione 200 μL de PBS gelado aos poços da placa de 48 poços e pipete vigorosamente as células restantes a cada 10 minutos até que a maioria dos macrófagos esteja separada do fundo. Após cada pipetagem, verifique as células ao microscópio e ajuste o tempo de incubação do gelo conforme necessário, com tempos de incubação mais longos para células mais aderentes.
  3. Transfira os macrófagos M0 destacados restantes para o tubo cônico de 15 mL no gelo. Misture as células com cuidado e conte as células em um contador de células.
  4. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar os sobrenadantes. Ressuspenda em PBS gelado para atingir uma concentração final de 1 x 106 células / mL.
  5. Transfira 200 μL de células para uma placa de fundo plano de 96 poços (Tabelas de Materiais). Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente os sobrenadantes. Como controle de bloqueio negativo, adicione um extra bem corado apenas com marcadores da população parental.
  6. Adicione 100 μL de tampão FACS suplementado com 1 μL de solução de bloqueio do receptor Fc a cada amostra. Incube as células por 10 min em temperatura ambiente. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente os sobrenadantes.
    NOTA: É importante pré-incubar macrófagos com tampão de bloqueio do receptor Fc antes da coloração real do marcador para evitar resultados falso-positivos.
  7. Para o poço da amostra, prepare 50 μL de tampão FACS contendo 0,3 μL de reagente vivo/morto (excitação a 405 nm), 0,5 μL de CD1410 anti-humano conjugado com APC 10 (1 ng/μL), 0,5 μL de CD20615 anti-humano conjugado com APC/Cy7 (2 ng/μL) e 0,5 μL de CD163 16 anti-humano conjugado com PerCP(2 ng/μL; Tabela de Materiais). Para o controle de gating negativo, prepare 50 μL de tampão FACS contendo 0,3 μL de reagente vivo/morto e 0,5 μL de CD14 anti-humano conjugado com APC.
  8. Adicione 50 μL de solução de coloração a cada poço e misture suavemente as células para evitar bolhas. Incube as células no escuro à temperatura ambiente por 15 min.
  9. Adicione 200 μL de tampão FACS a cada poço. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente os sobrenadantes.
  10. Lave adicionando 200 μL de tampão FACS. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente os sobrenadantes e ressuspender as células em 200 μL de tampão FACS.
  11. Execute amostras em um citômetro de fluxo e bloqueie a população de células CD14 + CD206 + CD163 + . Use a expressão de CD163 e CD206 em macrófagos M0 como linha de base para fenótipos semelhantes a M2. A migração populacional de CD163baixo, CD206baixo para CD163alto ou CD206alto é esperada em macrófagos semelhantes a M2. A magnitude da mudança populacional pode depender do doador.
  12. Prepare a linhagem de células tumorais de interesse e conte com um contador de células.
    NOTA: Este protocolo usa a linha celular de linfoma de células do manto CD19 + não aderente, JeKo-1, como alvo. Outras linhagens de células tumorais e sua capacidade de diferenciar macrófagos semelhantes a M0 em M2 podem ser testadas conforme necessário.
    1. Mantenha as células JeKo-1 com os meios de cultura sugeridos pelo fornecedor (Tabela de Materiais) a 1 x 106 células/mL em um frasco de cultura de tecidos. Misture as células tumorais no frasco e conte-as com um contador de células.
  13. Centrifugar as células-alvo a 300 x g a 4 °C durante 3 min e aspirar os sobrenadantes. Ressuspenda as células-alvo com meios de cultura de células para atingir uma concentração final de 2 x 106 células/mL.
    NOTA: Prepare o número apropriado de células tumorais com base no número de grupos experimentais. Certifique-se de que haja 2 x 105 células-alvo para cada grupo de cocultura de macrófagos semelhantes a M2, incluindo a placa de fenotipagem M2.
  14. Transfira 100 μL de células tumorais para grupos de cocultura de macrófagos semelhantes a M2 na placa de 48 poços preparada no dia 0 e pipete suavemente para misturar. Incubar as células a 37 °C durante mais 24 h.
    NOTA: Uma proporção de 2: 1 de macrófagos JeKo-1: M0 foi testada para diferenciação de fenótipo semelhante a M2. Outras proporções podem ser testadas conforme necessário.
  15. No dia 8, coloque a placa de fenotipagem do tipo M2 no gelo, desprenda vigorosamente as células e prepare-se para a fenotipagem conforme descrito nas etapas 3.4-3.11.
    NOTA: Os macrófagos semelhantes a M2 são muito mais aderentes do que os macrófagos M0, portanto, espera-se a necessidade de uma incubação de gelo mais longa. Este protocolo usa apenas gelo e PBS gelado para separar macrófagos para minimizar o estresse nas células.
  16. Combine os arquivos de citometria de fluxo da fenotipagem M0 do dia 7 com a fenotipagem semelhante a M2. Gate CD206 e CD163 da população de células-mãe CD14+ da amostra de macrófagos M0 e aplique a mesma estratégia de gating à amostra de macrófagos do tipo M2 para visualizar a mudança da população.
  17. Para introduzir células T nas coculturas, colha as células T CART19 e UTD do dia 8 geradas na etapa 2.5 e transfira as células para tubos cônicos de 50 mL. Misture bem com uma pipeta e conte com um contador de células.
  18. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar cuidadosamente os sobrenadantes. Ressuspenda as células T CART ou UTD em meios de cultura celular para atingir uma concentração final de 2 x 106 células/mL.
  19. Prepare a linhagem de células tumorais e conte com o contador de células. Girar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar os sobrenadantes.
  20. Ressuspenda as células tumorais com meios de cultura de células para atingir a concentração final de 2 x 106 células/mL. Transfira 100 μL de células tumorais para poços de cocultura sem macrófagos semelhantes a M2 (Tabela 1).
  21. Transfira 100 μL de células T CART ou UTD para os poços de cocultura adequados (Tabela 1). A cocultura final com macrófagos semelhantes a M2 deve ter células tumorais, células T e macrófagos na proporção de 2:2:1. Use coculturas sem macrófagos como controles.
  22. Para manter o volume final consistente entre os grupos, adicione mais 100 μL de meio de cultura celular a poços sem macrófagos. Incubar as células a 37 °C durante 3 dias.
    NOTA: Se células CART alogênicas estiverem sendo usadas, os usuários devem incluir células T UTD compatíveis com doadores nas coculturas como um controle adequado para detectar qualquer expansão de células T induzida por alogeneidade. Nesse caso, as células T CART e UTD criopreservadas previamente geradas devem ser descongeladas e recuperadas adequadamente, seguidas por pelo menos 3-4 h de repouso antes de serem adicionadas às coculturas.

4. Análise da proliferação específica do antígeno de coculturas

  1. No dia 11, coloque a placa de cocultura no gelo e pipete vigorosamente as células. Misture bem as células e transfira as células para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: A leitura primária das coculturas é quantificar a expansão das células T, portanto, o descolamento dos macrófagos não é necessário, a menos que os usuários planejem analisar outros marcadores nos macrófagos no mesmo painel também.
  2. Adicione 200 μL de PBS gelado nos poços de amostra e pipete vigorosamente. Transfira a solução restante para os mesmos tubos de microcentrífuga.
  3. Verifique os poços ao microscópio (10x) para certificar-se de que as células em suspensão estão sendo colhidas completamente. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar os sobrenadantes.
  4. Ressuspenda as células de todas as condições com 200 μL de tampão FACS e transfira para uma placa de fundo plano de 96 poços. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente os sobrenadantes.
  5. Prepare 50 μL de tampão FACS contendo 0,3 μL de reagente vivo/morto (excitação a 405 nm) e 0,5 μL de CD317 anti-humano conjugado com APC (1 ng/μL; Tabela de Materiais) para cada amostra bem. Adicione 50 μL de solução de coloração em cada poço e misture cuidadosamente as células com uma pipeta para evitar bolhas.
    NOTA: Nesta etapa, haverá pellets de células grandes. Para certificar-se de que todas as células T estão sendo coradas, verifique o fundo da placa para confirmar se não há pellets de células restantes depois de misturar bem.
  6. Incube as células no escuro à temperatura ambiente por 15 min. Adicione 200 μL de tampão FACS a cada poço. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente os sobrenadantes.
  7. Lave adicionando 200 μL de tampão FACS. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 3 min. Decantar cuidadosamente os sobrenadantes e ressuspender as células em 200 μL de tampão FACS.
  8. Execute amostras em um citômetro de fluxo. Gate células CD3 + e quantifique o número absoluto de células CD3 + vivas como abaixo:
    figure-protocol-1
  9. Faça um gráfico do número absoluto de células CD3+ em cada condição usando o GraphPad Prism.
    NOTA: Espera-se que as coculturas com macrófagos semelhantes a M2 tenham um número absoluto muito menor de células T CD3 do que as condições na ausência de macrófagos semelhantes a M2.

5. Impacto de macrófagos semelhantes a M2 em células CART em um sistema transwell

NOTA: As placas transwell separam fisicamente os macrófagos semelhantes a M2 das células CART estimuladas e permitem apenas que as moléculas solúveis trafeguem entre os tipos de células, permitindo que os usuários estudem a dinâmica das interações independentes de contato entre macrófagos e células CART (Figura 1).

  1. Isolar 1 x 106 monócitos clássicos humanos e confirmar a pureza da população por citometria de fluxo, conforme descrito nos passos 1.1-1.10. Centrifugar 1 x 106 monócitos a 300 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar sobrenadantes.
    NOTA: Os usuários podem querer gerar células UTD autólogas CART e compatíveis com doadores, conforme descrito na etapa 2.5.
  2. Ressuspenda as células em meios de cultura de células para atingir uma concentração final de 1 x 106 células/mL. Adicione GM-CSF recombinante humano para atingir uma concentração final de 10 ng/mL e misture bem.
  3. Transfira 200 μL de células ressuspensas para o poço inferior de uma placa transwell de 24 poços (0,4 μm) com 3 réplicas técnicas. Adicione mais 100 μL de meio de cultura celular a cada poço e certifique-se de que o fundo do poço esteja totalmente coberto. Adicionar 300 μL de meios de cultura de células a outros 3 alvéolos para condições sem macrófagos (controlo positivo).
  4. Adicione 200 μL de PBS nos poços circundantes para evitar a evaporação da cultura de células. Incubar as células a 37 °C durante 7 dias.
  5. No dia 7, prepare 1,4 x 106 células tumorais JeKo-1 e transfira-as para um tubo cônico de 15 mL. Girar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar os sobrenadantes.
  6. Ressuspenda as células tumorais com meios de cultura de células para atingir uma concentração final de 2 x 106 células/mL. Adicione 200 μL de células tumorais nos poços inferiores de todas as condições da amostra e misture bem. Incubar as células a 37 °C durante mais 24 h. Use poços de fundo com apenas JeKo-1 como controle positivo.
  7. No dia 8, colha as células CART e UTD T geradas na etapa 5.1. e ressuspender células T em meios de cultura de células para atingir uma concentração final de 1 x 106 células/mL.
    NOTA: Se células CART alogênicas estiverem sendo usadas, os usuários devem incluir células T UTD compatíveis com doadores nas coculturas, conforme descrito na etapa 3.22.
  8. Conte e prepare 1,4 x 106 células JeKo-1. Transfira as células tumorais para um tubo de centrífuga de 15 mL e gire as células a 300 x g a 4 ° C por 5 min.
  9. Aspirar sobrenadantes e ressuspender células em meios de cultura celular para atingir uma concentração final de 1 x 106 células/ml. Transfira 100 μL de células T preparadas e 100 μL de células tumorais para cada poço superior para todas as condições de amostra.
  10. Misturar bem as células no poço superior e incubar a 37 °C durante 3 dias.
  11. No dia 11, misture as células na câmara superior e transfira para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Lave os poços superiores com 200 μL de PBS e transfira as células restantes para os tubos de microcentrífuga.
  12. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar os sobrenadantes. Realize o ensaio de proliferação de células T conforme descrito nas etapas 4.4-4.9.
    NOTA: Os macrófagos semelhantes a M2 polarizados por JeKo-1 podem suprimir a proliferação de células T específicas do antígeno de maneira independente do contato. Outros modelos de tumor podem ser testados conforme necessário.

6. Estabelecimento de modelo de xenoenxerto com macrófagos humanos e tumor em camundongos NSG

  1. Isolar 1 x 107 monócitos clássicos humanos e confirmar a pureza por citometria de fluxo, conforme descrito nas etapas 1.1-1.10. Use camundongos NSG enxertados com JeKo-1 sozinho como controle para confirmar os efeitos pró-tumorais de macrófagos semelhantes a M2, conforme ilustrado na Figura 2.
    NOTA: Este protocolo enxerta camundongos NSG com 5 x 105 macrófagos humanos por via subcutânea. A recuperação de macrófagos após o descolamento no dia 7 é de aproximadamente 50%. Os usuários podem ajustar os números das células de acordo e preparar células extras.
  2. Spin down monócitos isolados a 300 x g a 4 ° C por 5 min e aspire os sobrenadantes. Ressuspenda as células em meios de cultura de células para atingir uma concentração final de 1 x 106 células/mL.
  3. Adicione GM-CSF recombinante humano para atingir uma concentração final de 10 ng/mL e misture bem. Transferir os monócitos para um balão de cultura de tecidos T25 e incubar as células a 37 °C durante 7 dias.
  4. No dia 7, pipete vigorosamente as células no gelo a cada 10 minutos e verifique as células ao microscópio até que a maioria dos macrófagos esteja destacada. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL no gelo, lave o frasco com PBS gelado para soltar as células restantes e combine as células no tubo cônico.
  5. Conte as células no contador de células. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar os sobrenadantes.
  6. Lave e ressuspenda as células com 5 mL de PBS gelado. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar os sobrenadantes.
  7. Ressuspenda as células em PBS gelado para atingir uma concentração final de 2 x 107 células/mL. Transfira a solução celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e mantenha-o no gelo.
  8. Prepare 1,5 x 107 células de luciferase + JeKo-1 e transfira as células para um tubo cônico de 15 mL.
    NOTA: Devido ao baixo número de células injetadas, a imagem de bioluminescência (BLI) é necessária para monitorar a carga tumoral. O número de macrófagos e células tumorais para injeções subcutâneas pode ser aumentado conforme necessário. Se os tumores forem visíveis e acessíveis por paquímetro após a injeção, células tumorais do tipo selvagem podem ser usadas.
  9. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 minutos e aspirar os sobrenadantes. Ressuspenda as células em PBS gelado para atingir uma concentração final de 4 x 107 / mL.
  10. Transfira o mesmo volume de macrófagos e células tumorais para outro tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mL e misture bem. Adicione o mesmo volume de matriz de membrana basal solubilizada na solução de células mistas e misture bem no gelo.
    NOTA: A matriz da membrana basal precisa ser descongelada no gelo durante a noite para evitar a solidificação. Neste ponto, cada 100 μL de solução celular tem 5 x 105 macrófagos e 1 x 106 JeKo-1 suspensos na matriz da membrana basal, que usa a mesma proporção de número de células usada no protocolo de diferenciação de macrófagos semelhantes a M2 in vitro .
  11. Como controle, transfira as células JeKo-1 preparadas restantes com o mesmo volume de PBS gelado para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionando o mesmo volume da matriz da membrana basal à solução celular e misturando bem no gelo.
  12. Prepare 10 camundongos NOD-SCID-γ-/- (NSG) fêmeas e machos de 6-8 semanas de idade (~ 20 g) para anestesia inalatória com isoflurano a 2,5%. Introduza a anestesia com isoflurano usando um aparelho de anestesia inalante para roedores. O isoflurano vaporizado é entregue em uma câmara e em um estágio aquecido com cones nasais.
  13. Coloque os ratos na câmara anestésica por 1-2 min. Transfira os camundongos para os cones do nariz no estágio aquecido, uma vez que os reflexos posturais e retos são perdidos18. Mantenha os ratos no estágio de aquecimento durante todo o procedimento. Aplique pomada para os olhos em ambos os olhos dos camundongos para evitar danos à córnea devido à perda do reflexo de piscar durante a anestesia.
  14. Raspe cuidadosamente o flanco direito de cada camundongo para expor a pele depois que os camundongos forem anestesiados. Carregue uma seringa de 0,5 mL com 100 μL de mistura de células JeKo-1-macrófagos e remova cuidadosamente as bolhas na solução.
  15. Levante cuidadosamente a pele exposta com a mão e insira a agulha na região levantada. Continue levantando a pele com a agulha e pressione um dedo no local da injeção. Tente não mover a agulha depois de inserida para evitar perfurações acidentais e vazamento de células.
  16. Solte lentamente as células na camada subcutânea e remova cuidadosamente a agulha. Repita as injeções subcutâneas para todos os 10 camundongos NSG, com 5 camundongos recebendo JeKo-1 e macrófagos e 5 camundongos recebendo JeKo-1 sozinho.
  17. Prepare a D-luciferina (Tabela de Materiais) na concentração de 15 mg / mL. Carregue uma seringa de 0,5 mL com 200 μL de D-luciferina e injete em cada camundongo por via intraperitoneal.
  18. Coloque os camundongos anestesiados no palco para BLI 10 min após a injeção de D-luciferina. Realize o BLI para cada camundongo e registre como linha de base (Dia 0) a carga tumoral. Coloque os ratos de volta em suas gaiolas.
    NOTA: Os usuários precisam garantir que os camundongos anestesiados não sejam deixados sem vigilância até que recuperem a consciência para manter a decúbito esternal após o procedimento de imagem.
  19. Monitore a carga tumoral por BLI 2x por semana até que os desfechos experimentais ou humanos sejam alcançados. O desfecho de sobrevida global é atingido quando o volume do tumor é igual ou superior a 2000 mm3, calculado pela fórmula abaixo:
    figure-protocol-2
    NOTA: A duração do monitoramento do tumor pode ser ajustada com base no objetivo dos experimentos e nas leituras desejadas. Devido aos tamanhos de tumor extremamente pequenos nas primeiras 2-3 semanas, o BLI é recomendado para indicação de carga tumoral. Uma vez que os tumores se tornam visíveis e acessíveis pelo paquímetro, as medições de BLI e paquímetro são recomendadas para uma análise precisa do tumor.
  20. Para estudar as interações entre macrófagos humanos enxertados e células CART19 autólogas em camundongos NSG, gere e enxerte macrófagos humanos diferenciados ex vivo, conforme descrito nas etapas 6.1-6.16. Isole as células T autólogas do mesmo doador de sangue na etapa 6.1 seguindo o protocolo de fabricação CART de 8 dias, conforme descrito anteriormente 9,13,14.
    NOTA: Cada mouse NSG é tratado com 2 x 106 células CART19. Os usuários devem gerar pelo menos 2 x 107 células CART para tratar 10 camundongos. As células CART são criopreservadas no dia 8 e armazenadas até que os macrófagos JeKo-1 / sejam enxertados nos camundongos, 5 dias após as injeções subcutâneas.
  21. Após 5 dias de injeções de tumor/macrófagos, randomize os camundongos com base no BLI, conforme descrito nas etapas 6.17-6.18. Descongele e prepare as células CART conforme descrito na etapa 3.22. Lave as células CART com PBS e gire as células a 300 x g a 4 ° C por 5 min.
  22. Ressuspenda as células CART em PBS para atingir uma concentração final de 2 x 107 células / mL. Carregue uma seringa de 0,5 mL com 100 μL de células CART preparadas e injete em cada camundongo enxertado com tumor por via intravenosa através da veia da cauda.
  23. Monitore a carga tumoral pelo BLI uma vez por semana durante 4 semanas.
    NOTA: Devido às funções imunossupressoras dos macrófagos humanos enxertados, espera-se atividades antitumorais de CART prejudicadas e maior carga tumoral em camundongos injetados com JeKo-1 / macrófagos.

7. Confirmação do fenótipo semelhante ao M2 nos macrófagos humanos enxertados por coloração por imunofluorescência

  1. Para confirmar o fenótipo semelhante a M2 induzido por JeKo-1 em macrófagos humanos enxertados descritos na etapa 6 por coloração por imunofluorescência, siga as etapas 6.1-6.19 e aumente o número de macrófagos injetados e luciferase + JeKo-1 para 5 x 106 células e 1 x 107 células por camundongo NSG, respectivamente.
    NOTA: Os usuários devem certificar-se de que o volume final de injeção para cada mouse seja de 100 μL.
  2. No dia 7, eutanasiar camundongos NSG com CO2, realizar luxação cervical e confirmar a perda dos reflexos da córnea conforme descrito anteriormente19. Coloque os ratos na bancada de trabalho com os tumores voltados para cima. Pulverize etanol 70% nos locais do tumor e colha cuidadosamente os tumores enxertados com tesoura e fórceps.
  3. Transferir os tecidos tumorais para tubos cônicos de 50 mL preenchidos com 20-30 mL de paraformaldeído a 4% para fixação conforme descrito anteriormente20. Criopreservação e criossecção de tecidos tumorais para coloração de imunofluorescência de acordo com protocolo publicado anteriormente20.
  4. Corar lâminas de tecido tumoral com anticorpo de camundongo anti-CD206 humano conjugado com AF546 (1:50) e anticorpo iNOS de coelho anti-humano conjugado com AF647 (1:100) diluído em tampão de coloração de imunofluorescência, seguido de coloração e preservação do núcleo conforme descrito anteriormente21.
    NOTA: Para obter os melhores resultados de coloração, os usuários devem realizar a titulação de anticorpos de acordo, especialmente quando diferentes linhas de células tumorais estão sendo usadas.
  5. Adquira imagens de imunofluorescência com microscopia confocal a 40x. Para confirmar que os macrófagos humanos enxertados desenvolvem um fenótipo semelhante ao M2, espere ver a expressão de CD206 humano e a expressão mínima de iNOS humano.

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Resultados

O objetivo deste protocolo é estabelecer modelos in vitro e in vivo para estudar interações entre macrófagos imunossupressores humanos e células CART devido à natureza complexa e dinâmica das interações e aos limitados modelos de xenoenxerto existentes. Seguindo o protocolo, monócitos clássicos humanos isolados são diferenciados para adquirir fenótipos semelhantes a M2 e se tornarem funcionalmente imunossupressores.

Para confirmar a pureza dos monócitos clássicos humanos isol...

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Discussão

A terapia celular com CART mostrou vários sucessos clínicos no tratamento de subconjuntos de pacientes com malignidades hematológicas, mas a maioria dos pacientes recidiva dentro de 1-2 anos após a infusão de CART 1,2. Vários mecanismos potenciais de resistência ao CART foram identificados, e as células mieloides imunossupressoras desempenham um papel importante na imunossupressão do TME e subsequente falha do CART

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Divulgações

A SSK é inventora de patentes no campo da imunoterapia CAR licenciadas para a Novartis (por meio de um acordo entre a Mayo Clinic, a Universidade da Pensilvânia e a Novartis), a MustangBio (por meio da Mayo Clinic) e a Sendero (por meio da Mayo Clinic). A RLS e a SSK são inventoras de patentes no campo da imunoterapia CAR licenciadas para a Humanigen (por meio da Mayo Clinic). KY, RLS, TH, BK, ES e SSK são inventores de patentes no campo da imunoterapia CAR licenciadas para a Immix. A SSK recebe financiamento de pesquisa da Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte e Lentigen. A SSK participou de reuniões consultivas com Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio e Novartis. SSK atuou no conselho de segurança e monitoramento de dados da Humanigen e da Carisma. SSK atuou como consultor para Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma e Humanigen.

Agradecimentos

Este estudo foi parcialmente financiado pelo Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), pelo Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), pelo Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), pelo National Institutes of Health grant R37CA266344-01 (SSK) e pelo Department of Defense grant CA201127 (SSK).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de 0,5 mLFisher Científico329461
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLEppendorf1415-2508
Tubo cônico de 15 mLCiências da Vida da Corning352097
Placa transwell de 24 poços (0,4 μ m)Ciências da Vida da Corning3397
Tubo cônico de 50 mLCiências da Vida da Corning352098
CD206 anti-humano conjugado com APC/Cy7Biolenda321119Anticorpo de fluxo
CD14 anti-humano conjugado com APCBiolenda325607Anticorpo de fluxo
CD3 anti-humano conjugado com APCBiolenda344811Anticorpo de fluxo
Solução de enxágue autoMACSMiltenyi Biotec130-091-222Tampão de isolamento de monócitos clássicos 
Matriz de membrana basalCiências da Vida da CorningCLS356237Matriz de membrana basal solubilizada
Meios de cultura celular10% de soro AB humano 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina em X-VIVO 15 Meio de Célula Hematopoiética sem soro
Kit clássico de isolamento de monócitos, humanoMiltenyi Biotec130-117-337
Sistema CytoFLEX B5-R3-V5Beckman CoulterC04652Citômetro de fluxo
D-luciferinaBiotecnologia de OuroSORTE-1G
D-PBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco)Gibco14190250 
Pomada para os olhosThermoFisher19-090-832
Buffer FACS2% FBS 1% azida de sódio em PBS
Soro fetal bovinoCiências da Vida da Corning35-011-CV
Placa de fundo plano de 96 poçosCiências da Vida da CorningCLS3997
Soro AB humano inativado por calorPesquisa inovadora4931
Human TruStain FcX (Solução de Bloqueio do Receptor Fc)Biolenda422301
Isoflurano líquido   Piramal Pharma Limitada66794-017-10
Sistema de imagem in vivo IVIS SpectrumPerkinElmer124262
Meios de cultura de linhagem celular JeKo-110% FBS 1% penicilina-estreptomicina-glutamina em meio RPMI-1640
Kit de coloração de células mortas Aqua corrigível viva/morta, para excitação de 405 nmInvitrogenL34966
Coluna LSMiltenyi Biotec130-042-401Seleção negativa de contas
LinfoprepTecnologias de células-tronco07811Gradiente de densidade médio
Solução de estoque MACS BSAMiltenyi Biotec130-091-376Tampão de isolamento de monócitos clássicos 
Anticorpo de camundongo anti-humano CD206 conjugado com AF546 Santa Cruz BiotecnologiaSC-376232
ACENO. Cg-Prkdcsid  Camundongos Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)Laboratório Jackson 5557
CD16 anti-humano conjugado com PEBiolenda302007Anticorpo de fluxo
Penicilina-estreptomicina-glutamina (100x), líquidoGibco10378-016
CD163 anti-humano conjugado com PerCPBiolenda333625Anticorpo de fluxo
Anticorpo iNOS anti-humano de coelho conjugado com AF647 Tecnologia de proteínaCL647-18985
GM-CSF humano recombinanteTecnologias de células-tronco78015
RPMI-1640 médioGibco11875093
SepMate-50 IVDTecnologias de células-tronco85450Isolamento de PBMC por centrificação de gradiente de densidade 
Azida de sódio, 5% (p / v)Ricca Química7144.8-16
Placa de 48 poços tratada com cultura de tecidosCiências da Vida da Corning3548
Analisador de viabilidade de células XR de células ViBeckman CoulterContador de células
X-VIVO 15 Meio de Células Hematopoiéticas Sem SoroLonza04-418Q

Referências

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