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Artigo de método

Produtos finais de glicação avançada sensibilizam células neuronais sensoriais humanas ao influxo de cálcio induzido por capsaicina

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DOI:

10.3791/68036

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2 de maio de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pain and Signaling, Butantan Institute, 2Center of Excellence in New Target Discovery, Butantan Institute, 3Innovation and Development Laboratory, Innovation and Development Center, Butantan Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O aumento dos produtos finais de glicação avançada (AGEs) derivados do colágeno está consistentemente ligado a doenças dolorosas. Aqui, investigamos se a glicação sensibiliza os neurônios sensoriais à excitação da capsaicina.

Resumo

O aumento dos produtos finais de glicação avançada derivados de colágeno (AGEs) está consistentemente ligado a doenças dolorosas, incluindo osteoartrite, neuropatia diabética e distúrbios neurodegenerativos. Os neurônios sensoriais humanos diferenciados da linhagem celular SH-SY5Y ganham funções pró-nociceptivas quando expostos a AGEs, liberando a substância P e regulando positivamente a expressão do potencial receptor transitório vanilóide 1 (TRPV1). Aqui, investigamos se esse receptor era funcionalmente ativo e se o processo de glicação sensibiliza os neurônios sensoriais à excitação da capsaicina. Células neuronais sensoriais foram obtidas a partir da diferenciação de células SH-SY5Y com ácido all-trans-retinóico e fator neurotrófico derivado do cérebro. A incubação com matriz extracelular de colágeno glicado (ECM-GC) simulou um estímulo pró-nociceptivo. As células controle foram incubadas com uma matriz de colágeno extracelular não glicada (ECM-NC). O Fluo-8 Calcium Flux Assay Kit foi usado para avaliar o influxo de cálcio, que foi estimulado pela capsaicina. Os resultados mostram que a glicação aumenta o influxo de cálcio em comparação com as células tratadas com colágeno normal, sugerindo que os neurônios sensoriais expressam canais TRPV1 funcionais e que a glicação aumenta a excitação da capsaicina. Esses dados indicam células neuronais sensoriais hipersensíveis aos AGEs, desencadeando sinalização pró-nociceptiva. Juntos, nossos resultados sugerem que estabelecemos um modelo funcional responsivo à capsaicina que pode ser útil para a triagem de candidatos ao tratamento de condições dolorosas.

Introdução

A glicação é um processo não enzimático, irreversível e espontâneo no qual proteínas, como o colágeno, se ligam a moléculas de açúcar redutor, resultando em produtos finais de glicação avançada (AGEs). Os AGEs podem ativar receptores de membrana celular, desencadeando a ativação de vias intracelulares, como proteína quinase regulada por sinal extracelular (ERK) 1/2, proteína quinase ativada por mitógeno p38 (MAPK) e quinases n-terminais c-jun (JNKs), rho-GTPases, fosfoinositol-3-quinase (PI3K), Janus quinase/transdutor de sinal e ativador de transcrição (JAK/STAT) e proteína quinase C (PKC), aumentando a liberação de moléculas pró-inflamatórias e o estresse oxidativo1. O colágeno glicado também prejudica a estrutura e as propriedades da matriz extracelular, e o aumento dos AGEs derivados do colágeno está consistentemente ligado a doenças dolorosas, incluindo osteoartrite, neuropatia diabética e distúrbios neurodegenerativos 2,3.

Nosso grupo demonstrou anteriormente que a linhagem celular SH-SY5Y pode ser diferenciada em células neuronais sensoriais, uma vez que essas células expressam canais envolvidos na nocicepção, como canais de sódio (Nav 1.7, Nav 1.8 e Nav 1.9) e potencial receptor transitório vanilóide tipo 1 (TRPV1), marcadores tipicamente encontrados em neurônios sensoriais periféricos4. O TRPV1 é um canal catiônico não seletivo permeável aos íons cálcio e sensível ao estímulo da capsaicina. É importante ressaltar que, quando as células neuronais sensoriais são expostas à matriz de colágeno glicada (ECM-GC), elas ganham funções pró-nociceptivas aumentando a expressão de c-Fos, um fator de transcrição envolvido na ativação neuronal, e a liberação da substância P, um neuropeptídeo amplamente envolvido na neuroinflamação e na dor. Essas células respondem a analgésicos, como a morfina, o opiáceo protótipo, diminuindo a liberação da substância P induzida por ECM-GC. Em conjunto, esses dados indicam que esse modelo é responsivo a uma molécula pró e antinociceptiva 4,5.

O monitoramento das mudanças na concentração intracelular de Ca2+ é essencial para estudar vários processos celulares. Nos neurônios, pode ser uma ferramenta útil para prever danos neuronais e propriedades neuroprotetoras de drogas. A capsaicina, o ingrediente ativo pungente da pimenta, é o agonista mais estudado do receptor TRPV15 e uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos da dor e rastrear novos analgésicos potenciais. Estudos anteriores demonstraram que os neurônios sensoriais primários dos gânglios da raiz dorsal de roedores incubados com glicose alta exibem um aumento significativo no influxo de cálcio induzido pela capsaicina6. No entanto, se o canal TRPV1 era funcionalmente ativo em nosso modelo celular e se o colágeno glicado sensibiliza células neuronais sensoriais à excitação da capsaicina, que pode ativar vias de sinalização nociceptivas, permanece desconhecido. Portanto, nosso objetivo foi desenvolver um protocolo econômico utilizando ferramentas simples para monitoramento de cálcio em tempo real em células sensoriais, garantindo uma análise confiável. Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para ajudar os pesquisadores a passar pelas etapas para diferenciar células SH-SY5Y em células neuronais sensoriais e como sensibilizá-las a estímulos pró-nociceptivos. Este método pode contribuir para a descoberta de novos compostos analgésicos ou neuroprotetores.

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Protocolo

Cultura e diferenciação de 1. SH-SY5Y em células neuronais sensoriais

NOTA 1: Todas as etapas presentes nesta seção precisam ser feitas sob uma capela de fluxo laminar e todas as soluções e suprimentos precisam ser estéreis.

  1. Primeiro, prepare um frasco de cultura (25 cm2) adicionando 5 mL de meio de cultura.
    NOTA: Para descongelamento, expansão e manutenção deste tipo de célula, use uma mistura de meio de cultura: Dulbecco Modified Eagle's and Ham's Medium F12 (DMEM/F12) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor e 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Em seguida, remova o criotubo contendo as células SH-SY5Y do nitrogênio líquido e mantenha-o no gelo. Descongele as células em banho-maria a 37 °C durante 2 min.
  3. Adicione 1 mL de meio de cultura completo ao criogenial, transfira as células para um tubo de 15 mL, adicione 3 mL de meio de cultura completo (DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor) e misture extraindo-o repetidamente e dispensando-o de volta ao tubo usando uma pipeta.
  4. Pipetar as células para o tubo de 15 ml e centrifugar a 290 g. Descarte o sobrenadante para remover o dimetilsulfóxido (DMSO), um agente crioprotetor usado para evitar a formação de cristais de gelo durante o congelamento das células.
  5. Adicione 1 mL de meio de cultura ao pellet celular, misture bem com uma pipeta e coloque-os em um frasco de cultura25 cm 2 para expandir as células. Colocar as células numa incubadora numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 °C.
    NOTA: As células podem ser usadas quando atingem aproximadamente 80% de confluência. Para diferenciação neuronal, recomenda-se o uso de células SH-SY5Y até a passagem celular vinte.
  6. Prepare a matriz de colágeno extracelular (100 μg / mL) diluindo o colágeno tipo I de cauda de rato em PBS estéril e despeje 1 mL dessa solução em uma placa de Petri (35/10 mm) para revestimento.
  7. Incube isso em uma incubadora em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 por aproximadamente 1 h.
  8. Após esse período, lave a placa duas vezes com PBS estéril e, em seguida, conte as células usando a câmara de Neubauer.
  9. Para contar as células, lave primeiro o balão de cultura2 de 25 cm contendo a célula com 5 ml de PBS estéril para remover todo o meio de cultura. Em seguida, remova o PBS estéril, adicione 3 mL de tripsina a 0,05% às células e coloque-as em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por aproximadamente 3-5 min para completar o descolamento celular.
  10. Em seguida, retirar as células da incubadora, adicionar 6 ml de meio de cultura ao balão de cultura e transferir esta solução para um tubo de 15 ml. Centrifugue a 290 g por 5 min.
  11. Remova o sobrenadante e ressuspenda bem as células em 1 mL de meio de cultura completo.
  12. Finalmente, conte as células usando uma câmara de contagem de Neubauer. Misture 20 μL de células e 20 μL de azul de tripano e adicione 10 μL dessa mistura a uma câmara de Neubauer. Conte as células vivas que não se coram em azul.
  13. Placa 5 × 10células de 4 células/mL em uma placa de Petri (35/10 mm) no mesmo meio de cultura descrito anteriormente. Use o volume total de 1 mL por placa.
  14. Em seguida, aguarde 24 h para iniciar o protocolo de diferenciação neuronal. Para isso, retirar o meio de cultura e substituí-lo por 1 mL de DMEM/F12 suplementado com 2% de soro fetal bovino inativado pelo calor, 1% de penicilina-estreptomicina e 10 μM de ácido all-trans retinóico (AR 10 μM).
  15. Aguarde 48 h e substitua o meio de cultura todos os dias durante 3 dias. Colocar as células numa incubadora numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 °C.
  16. No quinto dia, remova o meio das células e adicione 1 mL de meio de cultura sem soro suplementado com fator neurotrófico derivado do cérebro humano (BDNF 50 ng/mL) em cada placa.
    NOTA: BDNF de diferentes empresas (ver tabela de material) foi testado. Todos eles funcionaram da mesma maneira.
  17. No sétimo dia de diferenciação, lave as células com PBS estéril uma vez e use células neuronais sensoriais para experimentos. Se for impossível usar essas células imediatamente para experimentos, adicione um meio de cultura sem soro para mantê-las vivas até o uso.
    NOTA: Ao final da diferenciação neuronal, é necessário lavar as células com PBS estéril para remover o BDNF restante, evitando a toxicidade celular.

2. Colágeno glicado e processo de glicação

NOTA: Todas as etapas desta seção devem ser feitas sob uma capela de fluxo laminar e todas as soluções e suprimentos devem ser estéreis.

  1. Prepare a glicação do colágeno incubando o colágeno tipo I do estado fibrilar da cauda do rato (3,89 mg / mL) com 200 mM de D-ribose, 160 mM de D-glicose e 200 mM de D-treose a 4 ° C por 7 dias.
    NOTA: Para preparar o colágeno glicado, pese os açúcares com base em seu peso molecular e misture-os com colágeno tipo I do estado fibrilar da cauda de rato (3,89 mg / mL).
  2. Incubar cultura de células de neurônios sensoriais por 24 h com matriz extracelular de colágeno glicado (ECM-GC, 100 μg/mL) ou matriz extracelular de colágeno normal (ECM-NC, 100 μg/mL) preparada em meio de cultura DMEM/F12 sem suplementação de soro e antibiótico.

3. Ensaio de influxo de cálcio

  1. Para o influxo de cálcio, use o kit de ensaio de fluxo de cálcio e prepare as soluções de acordo com as instruções do fabricante, conforme indicado abaixo.
  2. Inicialmente, prepare 1 mL de carga de corante Fluo-8 adicionando 2 μL de solução estoque de Fluo-8 em 998 μL de tampão de ensaio 1x (uma mistura de tampão HBSS e 10x Pluronic F127 Plus.
    NOTA: Esta solução de trabalho é estável por pelo menos 2 h em temperatura ambiente (RT).
  3. Posteriormente, incubar 250 μL dessa solução em cada placa plaqueada de células neuronais sensoriais previamente diferenciadas e tratadas com ECM-NC ou ECM-GC por 30 min em atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37 °C. Em seguida, retire o prato da incubadora e mantenha-o em RT (no escuro) por 30 min.
    NOTA: Esta solução torna-se citotóxica se a incubação de 2 h for extrapolada. Prepare a solução de capsaicina durante o período de incubação.

4. Indução de capsaicina

NOTA: A capsaicina, um agonista do TRPV1, foi usada para induzir o influxo de cálcio nas células.

  1. Pesar e diluir a capsaicina em etanol a 1% e água ultrapura. Em seguida, prepare uma solução na concentração de 2 μM, que também foi diluída em água ultrapura.
    NOTA: A solução de capsaicina deve ser feita no dia do uso. Diluir a capsaicina primeiro em etanol e depois em água; caso contrário, ele irá precipitar.
  2. Adicionar 250 μL de solução de capsaicina 2 μM a cada placa de Petri de 35/10 mm, de modo a que a concentração final seja de 1 μM.
    NOTA: A concentração da solução estoque de capsaicina foi de 2 μM para garantir melhor dispersão e evitar picos de fluorescência isolados.

5. Imagem de influxo de cálcio e análise de microscopia confocal

NOTA: A imagem foi realizada em um microscópio confocal equipado com uma objetiva de 20x/0,75NA e um laser de excitação de 488 nm (intensidade de 0,5%). A emissão foi detectada a 520 nm. As células foram escaneadas em eixos xy (512 x 512 pixels) ao longo do tempo (t) a uma velocidade de 600 Hz com um intervalo de aquisição de 433 ms e um tempo total de aquisição de 5 min. A imagem foi realizada a 37 °C para manter a condição fisiológica das células usando o software de microscopia.

  1. Prepare uma seringa com 250 μL de solução de capsaicina 2 μM (a concentração final na placa será de 1 μM) e conecte-a a um conjunto de veias do couro cabeludo - Butterfly tipo 23 GA estéril. Prenda a seringa usando um suporte de laboratório e clamp.
  2. Coloque a placa de Petri no estágio do microscópio e, com extremo cuidado, coloque a agulha do couro cabeludo na placa de Petri, evitando o contato com o fundo, a ponta da agulha não deve ser submersa no líquido.
    NOTA: Uma fita adesiva pode ser usada para fixar a posição do couro cabeludo.
  3. Encontre um campo com um número adequado de células (mais de 20) e ajuste o foco usando luz de campo brilhante.
  4. Inicie o modo Live com um laser de 488 nm e ajuste os parâmetros de foco e iluminação.
  5. Inicie o registro da aquisição e, após o período basal (t = 0 a t = 60 segundos), aplique 250 μL de capsaicina 2 μM e empurre suavemente o êmbolo da seringa para estimular o influxo de cálcio nas células.
    NOTA: O tempo final de aquisição do registro foi de aproximadamente 300 s por placa.

6. Pós-processamento/análise de dados

  1. Execute a análise celular usando o software de microscopia no modo de quantificação . Primeiro, analise as células de pico de fluorescência antes e depois do estímulo da capsaicina.
  2. Crie uma região de interesse (ROI) em cada célula responsiva, ou seja, células que exibem um pico de fluorescência após a capsaicina. Certifique-se de desenhar ROI em toda a área da célula, conforme demonstrado acima (Figura 1).
  3. Exporte os dados em um arquivo CSV (valores separados por vírgula) para análise subsequente.
  4. Como alternativa, execute a análise usando o software disponível gratuitamente FIJI7 (https://fiji.sc).
    1. Para abrir os arquivos de imagem, use o plug-in Bio-Formats navegando até Arquivo > Importar > Bio-Formats e selecionando o arquivo.
  5. Em seguida, use a ferramenta Lupa para aumentar o zoom e a ferramenta Seleção à mão livre para desenhar uma Região de interesse (ROI) ao redor das células responsivas.
  6. Depois de desenhar cada ROI, pressione a tecla T para adicioná-lo ao ROI Manager. Repita esse processo para todas as células de interesse (Figura 2).
  7. Depois que todos os ROIs forem adicionados, vá para a janela Gerenciador de ROI , selecione todos os ROIs e navegue até Analisar > Definir Medidas no menu principal.
  8. Em seguida, retorne ao ROI Manager e selecione More > Multi Measure para medir a intensidade em todos os quadros. Os resultados aparecerão em uma nova janela; exporte como um arquivo CSV acessando Arquivo > Salvar como.
    NOTA: O arquivo CSV pode ser analisado no Excel, Google Sheets e software GraphPad. Use a equação ΔF/F0 = (F(t) - F0)/F0 para converter os valores de intensidade de fluorescência obtidos com o kit de ensaio de fluxo de cálcio Fluo-8 em uma medida relativa da mudança do influxo de cálcio. Aqui, F0 representa a fluorescência basal, calculada como a intensidade média das imagens capturadas de t = 0 s a t = 60 s antes da estimulação com capsaicina. F(t) é o valor da intensidade máxima de fluorescência observada após o estímulo, que permite avaliar o pico de influxo de cálcio. Essa abordagem destaca o aumento da fluorescência em relação à linha de base, onde um aumento no ΔF / F0 indica um nível elevado de cálcio intracelular.

figure-protocol-1
Figura 1: Exemplo de ROI nas células selecionadas para análise de influxo de cálcio no software LAS X. (A) Interface LAS X no modo de quantificação. O retângulo rosa mostra a guia de quantificação. O retângulo amarelo mostra a ferramenta desenhar polilinha e o retângulo ciano mostra as ferramentas de redução e ampliação. (B) Campo de visão (FOV) capturado. (C) Amplie o FOV para facilitar o desenho do ROI em toda a célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-2
Figura 2: Exemplo de ROI nas células selecionadas para análise de influxo de cálcio no software FIJI. (A) Interface FIJI mostrando o menu principal e a ferramenta. O quadrado vermelho mostra a ferramenta de lupa e o quadrado verde mostra a seleção à mão livre. (B) Campo de visão (FOV) capturado com zoom e um ROI desenhado. (C) A janela do gerenciador de ROI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Solução de problemas

  1. Se a imagem estiver fora de foco, tente o seguinte:
    1. Verifique a aderência da fita; Se afrouxar, isso pode fazer com que a agulha se desloque e afete o foco.
    2. Recoloque a agulha com fita adicional para maior estabilidade.
    3. Substituição de agulhas padrão. Use pontas de agulha dentária pré-dobradas para melhorar o alinhamento na placa.
  2. Se as células estiverem exibindo um sinal saturado, tente as seguintes etapas:
    1. Diminua a intensidade do laser e as configurações de ganho.
    2. Verifique o tempo de incubação do reagente. Se exceder a recomendação do fabricante, pode levar à saturação do sinal, complicando a detecção do influxo de cálcio.
  3. Siga estas sugestões adicionais para solução de problemas:
    1. Calibração regular: Certifique-se de que o equipamento de imagem esteja calibrado regularmente para manter o foco e a qualidade da detecção do sinal.
    2. Alterações de documentos: Mantenha um registro de todos os ajustes feitos no protocolo para referência futura e para facilitar a solução de problemas.
    3. Ajustes reativos: Se os problemas persistirem, considere testar com diferentes concentrações de reagentes ou métodos alternativos de detecção de sinal.

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Resultados

Diferenciação de células SH-SY5Y em neurônios sensoriais
Imagens de triagem de alto conteúdo demonstram que o protocolo de diferenciação neuronal altera a morfologia das células SH-SY5Y. As células neuronais sensoriais (células diferenciadas) exibem um corpo celular arredondado que projeta uma extensa rede de neurofilamentos. Eles formam ramos de projeções de neuritos mais alongadas conectando os neurônios circundantes, o que é consistente com as características dos neurônios maduros (

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Discussão

Os nociceptores são subconjuntos especializados de neurônios sensoriais que medeiam a dor. Essas células expressam canais iônicos dependentes de voltagem e ligantes, como o TRPV1, cuja ativação leva ao influxo de cálcio e à liberação de neuropeptídeos e neurotransmissores que regulam a transmissão nociceptiva. Aqui, descrevemos um protocolo para diferenciar SH-SY5Y em células neuronais sensoriais para avaliar o influxo de cálcio induzido por capsaicina 8,9

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Divulgações

O MCB, o AMCT e o VOZ possuem uma patente sobre o processo de identificação de entidades moleculares envolvidas na dor da osteoartrite (BR102018008561-1).

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Fundação Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FAPESP Processo nº 2015/50040-4 e 2020/13139-0, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo e GlaxoSmithKline, FAPESP 2022/08417-7 e 2024/04023-0.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido all-trans retinóicoTocris695
BDNFTocrisTOCR-2837
BDNFSigma-AldrichB3795
Borboleta tipo 23GA estérilBeckton Dickinson Asepto38833814Conjunto de veias do couro cabeludo
CapsaicinaSigma-AldrichM2028
D-glicoseSigma-AldrichG5767
DMEM / F12Gibco12500062meio basal
D-riboseSigma-AldrichR7500
D-threoseSigma-AldrichT7392
Fluo-8 Kit de ensaio de fluxo de cálcioAbcamab112129Sem lavagem
Soro bovino fetal inativado por calorGibcoA5670801
alto teor Exibição Molecular Devices
Software LASXLeica MicrosystemsSoftware de microscopia
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsLeica TCS SP8Microscópio confocal
Penicilina-estreptomicinaGibco15140130 placa de
Petri (35/10 mm)Greiner bio-one627965
Cauda de rato tipo I colágenoCorning
SH-SY5YMerck94030304-1VLLinha celular de neuroblastoma
354236

Referências

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Reimpressões e permissões

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