O aumento dos produtos finais de glicação avançada (AGEs) derivados do colágeno está consistentemente ligado a doenças dolorosas. Aqui, investigamos se a glicação sensibiliza os neurônios sensoriais à excitação da capsaicina.
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Artigo de método
Produtos finais de glicação avançada sensibilizam células neuronais sensoriais humanas ao influxo de cálcio induzido por capsaicina
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O aumento dos produtos finais de glicação avançada derivados de colágeno (AGEs) está consistentemente ligado a doenças dolorosas, incluindo osteoartrite, neuropatia diabética e distúrbios neurodegenerativos. Os neurônios sensoriais humanos diferenciados da linhagem celular SH-SY5Y ganham funções pró-nociceptivas quando expostos a AGEs, liberando a substância P e regulando positivamente a expressão do potencial receptor transitório vanilóide 1 (TRPV1). Aqui, investigamos se esse receptor era funcionalmente ativo e se o processo de glicação sensibiliza os neurônios sensoriais à excitação da capsaicina. Células neuronais sensoriais foram obtidas a partir da diferenciação de células SH-SY5Y com ácido all-trans-retinóico e fator neurotrófico derivado do cérebro. A incubação com matriz extracelular de colágeno glicado (ECM-GC) simulou um estímulo pró-nociceptivo. As células controle foram incubadas com uma matriz de colágeno extracelular não glicada (ECM-NC). O Fluo-8 Calcium Flux Assay Kit foi usado para avaliar o influxo de cálcio, que foi estimulado pela capsaicina. Os resultados mostram que a glicação aumenta o influxo de cálcio em comparação com as células tratadas com colágeno normal, sugerindo que os neurônios sensoriais expressam canais TRPV1 funcionais e que a glicação aumenta a excitação da capsaicina. Esses dados indicam células neuronais sensoriais hipersensíveis aos AGEs, desencadeando sinalização pró-nociceptiva. Juntos, nossos resultados sugerem que estabelecemos um modelo funcional responsivo à capsaicina que pode ser útil para a triagem de candidatos ao tratamento de condições dolorosas.
Introdução
A glicação é um processo não enzimático, irreversível e espontâneo no qual proteínas, como o colágeno, se ligam a moléculas de açúcar redutor, resultando em produtos finais de glicação avançada (AGEs). Os AGEs podem ativar receptores de membrana celular, desencadeando a ativação de vias intracelulares, como proteína quinase regulada por sinal extracelular (ERK) 1/2, proteína quinase ativada por mitógeno p38 (MAPK) e quinases n-terminais c-jun (JNKs), rho-GTPases, fosfoinositol-3-quinase (PI3K), Janus quinase/transdutor de sinal e ativador de transcrição (JAK/STAT) e proteína quinase C (PKC), aumentando a liberação de moléculas pró-inf....
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Protocolo
Cultura e diferenciação de 1. SH-SY5Y em células neuronais sensoriais
NOTA 1: Todas as etapas presentes nesta seção precisam ser feitas sob uma capela de fluxo laminar e todas as soluções e suprimentos precisam ser estéreis.
- Primeiro, prepare um frasco de cultura (25 cm2) adicionando 5 mL de meio de cultura.
NOTA: Para descongelamento, expansão e manutenção deste tipo de célula, use uma mistura de meio de cultura: Dulbecco Modified Eagle's and Ham's Medium F12 (DMEM/F12) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor e 1% de penicilina-estreptomicina. - Em seguida, remova o cr....
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Resultados
Diferenciação de células SH-SY5Y em neurônios sensoriais
Imagens de triagem de alto conteúdo demonstram que o protocolo de diferenciação neuronal altera a morfologia das células SH-SY5Y. As células neuronais sensoriais (células diferenciadas) exibem um corpo celular arredondado que projeta uma extensa rede de neurofilamentos. Eles formam ramos de projeções de neuritos mais alongadas conectando os neurônios circundantes, o que é consistente com as características dos neurônios maduros (
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Discussão
Os nociceptores são subconjuntos especializados de neurônios sensoriais que medeiam a dor. Essas células expressam canais iônicos dependentes de voltagem e ligantes, como o TRPV1, cuja ativação leva ao influxo de cálcio e à liberação de neuropeptídeos e neurotransmissores que regulam a transmissão nociceptiva. Aqui, descrevemos um protocolo para diferenciar SH-SY5Y em células neuronais sensoriais para avaliar o influxo de cálcio induzido por capsaicina 8,9
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Divulgações
O MCB, o AMCT e o VOZ possuem uma patente sobre o processo de identificação de entidades moleculares envolvidas na dor da osteoartrite (BR102018008561-1).
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Fundação Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FAPESP Processo nº 2015/50040-4 e 2020/13139-0, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo e GlaxoSmithKline, FAPESP 2022/08417-7 e 2024/04023-0.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido all-trans retinóico | Tocris | 695 | |
| BDNF | Tocris | TOCR-2837 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 | |
| Borboleta tipo 23GA estéril | Beckton Dickinson Asepto | 38833814 | Conjunto de veias do couro cabeludo |
| Capsaicina | Sigma-Aldrich | M2028 | |
| D-glicose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| DMEM / F12 | Gibco | 12500062 | meio basal |
| D-ribose | Sigma-Aldrich | R7500 | |
| D-threose | Sigma-Aldrich | T7392 | |
| Fluo-8 Kit de ensaio de fluxo de cálcio | Abcam | ab112129 | Sem lavagem |
| Soro bovino fetal inativado por calor | Gibco | A5670801 | |
| alto teor Exibição | Molecular Devices | ||
| Software LASX | Leica Microsystems | Software de microscopia | |
| Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | Microscópio confocal |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140130 placa de | |
| Petri (35/10 mm) | Greiner bio-one | 627965 | |
| Cauda de rato tipo I colágeno | Corning | ||
| SH-SY5Y | Merck | 94030304-1VL | Linha celular de neuroblastoma |
Referências
- Bierhaus, A., et al. Understanding RAGE, the receptor for advanced glycation end products. J Mol Med. 83 (11), 876-886 (2005).
- Hudson, B. I., et al. Blockade of receptor f....
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Reimpressões e permissões
