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Desenvolvimento de um modelo de lesão pulmonar aguda em leitões neonatais recriando o ambiente inicial de pulmões de bebês prematuros

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DOI:

10.3791/68058

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31 de outubro de 2025

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1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2Division of Neonatology, Karolinska University Hospital, 3Division of Neonatology, Children's Hospital of Eastern Ontario, 4Department of Obstetrics, Gynecology and Newborn Care, University of Ottawa, 5Faculty of Medicine, University of Ottawa

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de leitões neonatais de lesão pulmonar aguda que modela eventos patogênicos precoces que ocorrem no pulmão prematuro, incluindo quantidade de surfactante subadequada, hiperóxia, ventilação de alta pressão e inflamação, para facilitar a compreensão dos gatilhos moleculares da displasia broncopulmonar e melhorar a tradução terapêutica.

Resumo

O parto prematuro é uma das principais causas de morbidade e mortalidade pediátrica. A displasia broncopulmonar (DBP) é uma consequência grave da prematuridade extrema, levando a alterações no crescimento pulmonar e efeitos duradouros no desenvolvimento. A patogênese do TPB é multifatorial, incluindo ventilação mecânica, hiperóxia e inflamação como os principais impulsionadores de seu desenvolvimento. Atualmente, não há tratamento para DBP. Neste estudo, é apresentado um novo modelo de leitões neonatais viáveis e reprodutíveis de lesão pulmonar aguda (LPA), mimetizando os estímulos clínicos enfrentados pelo pulmão humano pré-termo. O modelo de leitão neonatal ALI multi-hit - combinando depleção de surfactante, hiperóxia, ventilação de alta pressão e administração de lipopolissacarídeo intratraqueal (LPS) resulta em oxigenação prejudicada, função pulmonar perturbada, inflamação com infiltração de neutrófilos e lesão pulmonar histológica. Suas principais vantagens são o uso de estímulos nocivos conhecidos por impulsionar a patogênese do TPB e sua baixa manutenção. Ele gera ALI de alta fidelidade, atendendo aos critérios ALI da American Thoracic Society. Modelos animais de grande porte, como este modelo de leitão, são essenciais para entender os fatores patogênicos precoces, identificar alvos terapêuticos e facilitar a tradução clínica para os pacientes.

Introdução

A prematuridade extrema é uma das principais causas de morte em crianças antes dos cinco anos de idade1. A complicação grave mais comum da prematuridade é a displasia broncopulmonar (DBP), uma doença pulmonar crônica, com contribuintes multifatoriais, incluindo inflamação, estresse oxidativo por hiperóxia e trauma induzido por ventilaçãomecânica 2. Esse microambiente leva ao comprometimento do crescimento pulmonar, o que pode ter um impacto duradouro no crescimento e desenvolvimento de bebês prematuros3. Atualmente, não há tratamento para DBP.

Uma revisão sistemática recente sobre o uso de células estromais mesenquimais como um tratamento potencial para DBP descobriu que os dados pré-clínicos estavam apenas em roedores4. Esse fenômeno é comum dada a ampla disponibilidade, facilidade de uso e manutenção dos modelos de roedores. No entanto, a reprodução de estudos em modelos animais de grande porte é fundamental para garantir o sucesso nos esforços translacionais para terapias novas e futuras para bebês prematuros. Muitos ensaios clínicos falham devido a estudos pré-clínicos inadequados5, retardando o desenvolvimento do tratamento para os pacientes. Embora o uso de um modelo de primata não humano seja um modelo pré-clínico preferido para estabelecer as bases para ensaios clínicos em humanos, é trabalhoso, caro e não é facilmente acessível. O modelo de leitões neonatais é vantajoso, com o uso de medicamentos e equipamentos semelhantes aos cuidados neonatais, mimetizando o ambiente clínico de terapia intensiva neonatal, levando a uma maior viabilidade para a tradução clínica. Além disso, o sistema imunológico dos pulmões suínos se assemelha muito ao dos humanos 6,7,8,9, compartilhando mais de 80% da variância genética do receptor toll-like 410, com macrófagos reagindo a lipopolissacarídeos (LPS) 11 , 12 e produção de óxido nítrico13 - potenciais contribuintes de inflamação no pulmão humano14. Além disso, o surfactante pulmonar derivado de suínos é um tratamento clinicamente estabelecido usado para doença pulmonar aguda em bebês nascidos prematuros15.

Este protocolo apresenta a geração de um novo modelo de lesão pulmonar aguda (LPA) de um dia em leitões recém-nascidos com resultados consistentes, padronizados e traduzíveis de acordo com os critérios de LPA da American Thoracic Society 16,17,18. Lavagens pulmonares repetidas com solução salina para depleção de surfactante com ventilação de alta pressão e subsequente LPS ou outra exposição tóxica têm sido usadas em porcos adultos para induzir lesão pulmonar18. No entanto, modelos semelhantes disponíveis em leitões recém-nascidos são escassos19,20. Este protocolo descreve como induzir lesão pulmonar com um protocolo adaptado de lavagem pulmonar de depleção de surfactante 21,22,23 sob ventilação hiperóxica e de alta pressão, seguida de um gatilho inflamatório usando LPS instilado diretamente no pulmão. Este modelo está preparado para a administração de um tratamento de escolha localmente (intratraqueal - TI) ou sistemicamente (intravenoso - IV) após a lesão pulmonar induzida, com monitoramento de seu efeito ao longo de 5 h. A estrutura geral imita de perto a condição dos pulmões de bebês prematuros. A depleção do surfactante recria a síndrome do desconforto respiratório, marcada pela falta de surfactante no nascimento. Esta doença pode estar associada a barotrauma, atelectotrauma e problemas de oxigenação que requerem altos níveis de oxigênio e ventilação mecânica. Por fim, a maioria dos bebês prematuros nasce em um ambiente inflamatório devido à corioamnionite ou infecção, características que foram tentadas a serem replicadas pela administração de LPS neste modelo de leitão. Este modelo multi-hit de LPA cria estímulos clínicos semelhantes enfrentados pelo pulmão prematuro humano que oferecerá informações valiosas sobre os processos patogênicos iniciais da DBP e a potencial otimização da administração da terapia para uma tradução clínica eficaz24.

Protocolo

Todos os experimentos são realizados por pessoal certificado de acordo com os regulamentos nacionais e institucionais (https://ccac.ca/en/guidelines-and-policies/) após aprovação pelo Comitê Regional de Cuidados com Animais e pelo Serviço Veterinário e de Cuidados com Animais (protocolo OHRIe-3731). Leitões recém-nascidos de ambos os sexos, de 0 a 3 dias de idade, com raças mistas Yorkshire, Landrace e Duroc foram usados para este modelo. Descrição detalhada das etapas (número da etapa identificado entre parênteses) para preparação, anestesia, gerenciamento e monitoramento de fluidos e medicamentos usados durante toda a duração do experimento (1-3), procedimentos cirúrgicos (4) incluindo um período de estabilização (5) antes de induzir a lesão pulmonar multi-hit (7), com observação pós-lesão e ventilação de manutenção (6, 8) terminando com eutanásia e conclusão do experimento (10) são fornecidos. Um procedimento padronizado opcional para tratamento intratraqueal (9) também é apresentado. O tempo total da fazenda até o final do experimento e coleta de amostras é de aproximadamente 12-15 h. Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação experimental

  1. Ligue e calibre os monitores e o ventilador antes da chegada do leitão. Certifique-se de que os cartões de memória estejam inseridos no monitor para gravação contínua de dados durante o experimento.
  2. Ajuste o ventilador com pressão inspiratória de pico (PIP) de 15 cmH2O, pressão expiratória final positiva (PEEP) de 6 cmH2O, fluxo inspiratório de 8 L/min, frequência respiratória (FR) de 30/min, tempo inspiratório (Tinsp) de 0,4 s, fração inspirada de oxigênio (FiO2) de 1,0 e, conecte um novo circuito de ventilação e umidificador.
  3. Prepare pacotes cirúrgicos estéreis, cortinas, consumíveis (incluindo medicamentos - consulte a Tabela de Materiais), cateteres e o CRF impresso. Aumente a temperatura da sala cirúrgica para 25 °C ou mais, conforme considerado necessário pela equipe de pesquisa. Ligue o cobertor de aquecimento/colchão de água a 39 °C. Prepare um sistema de aquecimento de ar forçado que esteja pronto para uso se for necessária uma regulação adicional da temperatura.
  4. Coloque 1 saco de L de solução salina normal em banho-maria morna (39 °C) para preparar as lavagens pulmonares.
  5. Configure bombas de infusão de medicamentos (cetamina e propofol) e adicione novos sacos de Lactato Ringers e Dextrose à temperatura ambiente às bombas de fluido.
  6. O leitão fica com a porca na fazenda local e tem livre acesso a ela até que seja recolhida por um membro da equipe de pesquisa. Observe o sexo, idade, tamanho da ninhada e hora do nascimento.
    NOTA: Em um veículo de transporte universitário aprovado com motorista qualificado, um membro experiente da equipe está presente durante todo o transporte. O leitão é colocado em um grande transportador macio fechado, que permite que o leitão se mova com segurança, liberdade e deite de maneira irrestrita (com uma almofada térmica de borracha de água quente envolta em cobertores, se necessário). Isso garante que o leitão permaneça calmo (muitas vezes adormecendo) neste ambiente relaxante. A caixa de transporte que contém o leitão é fixada no lugar com o cinto de segurança. O membro da equipe tem o papel de acalmar suavemente o leitão e evitar ruídos altos para manter o nível de estresse do leitão no mínimo.
  7. Ao chegar à instituição de pesquisa, mantenha o ruído ao mínimo e segure suavemente o leitão enquanto coloca o cone do nariz de anestesia em seu rosto.

2. Preparação animal

NOTA: Esta seção inclui a indução e manutenção da anestesia (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente).

  1. Inicie o fluxo de O2 sem isoflurano ao colocar o cone nasal no lugar. Quando o leitão estiver calmo, inicie o isoflurano e aumente até que o isoflurano a 3% seja administrado (aproximadamente 60 s). Monitore a respiração cuidadosamente e ajuste o isoflurano de acordo.
  2. Verifique a falta de resposta do leitão por meio de uma pitada dura no dedo do pé.
  3. Quando o leitão não responder, pese e meça-o para a dosagem adequada do medicamento.
  4. Injete buprenorfina HCL (0,04 mg / kg) por via intramuscular (IM) com uma agulha 25 G na perna traseira para analgesia.
  5. Conecte o oxímetro de pulso ao casco superior direito (pré-ductal), manguito de pressão arterial não invasivo (até que a artéria femoral seja canulada) e derivações de ECG.
  6. Insira 24 G de angiocateteres em ambos os ouvidos. Anexe conjuntos de extensão de 6" com lavagem salina com torneiras de 4 vias. Apoie a orelha com um abaixador de língua para evitar obstrução posicional.
  7. Obtenha sangue do cateter de ouvido inserido para medição de glicose no sangue (BG) com um glicosímetro calibrado de acordo com as instruções do fabricante.
  8. Inicie a infusão de D5W por via intravenosa (IV) a 5 mL / kg / h e ajuste de acordo com os níveis de glicose no sangue para atingir um nível de BG de 4-5 mmol / L.
  9. Administre injeções em bolus de analgesia / anestesia na segunda veia da orelha.
    NOTA: A compreensão crítica das propriedades e efeitos colaterais desses medicamentos é necessária para seu uso ideal e seguro.
    1. Administre um bolus de 2 mg / kg IV de cetamina diluída (10 mg / mL) e um bolus de 5 mg / kg IV de propofol (10 mg / mL, 1%) administrados em vários bolus de menor volume. Cuidado com a possibilidade de ocorrência de apneia após um bolo de propofol. Continue a administração cuidadosa de bolus de propofol (para um total de 5 mg / kg) até que o leitão não responda ao teste de pinça do dedo duro e a infusão contínua de propofol seja estabelecida.
    2. Interrompa o isoflurano (assim que a infusão IV de propofol for iniciada) e continue com a anestesia IV contínua durante o restante do experimento.
  10. Inicie a infusão contínua do seguinte regime anestésico com titulação cuidadosa com base na frequência cardíaca e pressão arterial, incluindo reflexo de retirada para atingir a profundidade cirúrgica estável da anestesia:
    1. Propofol (10 mg / mL) na taxa de 10-30 mg / kg / h (equivalente a 1-3 mL / kg / h) IV.
    2. Cetamina (100 mg / mL) na taxa de 5-10 mg / kg / h (equivalente a 0,05-0,1 mL / kg / h) IV.
      NOTA: As linhas de infusão de analgesia/anestesia são conectadas ao cateter de ouvido contralateral da infusão D5W. Pode ser necessário ajustar a ingestão total de líquidos e a temperatura ambiente para garantir suporte e homeostase adequados.

3. Fluidos, medicamentos e monitoramento

NOTA: Esta seção fornece informações sobre como manter a hidratação, suprimento de glicose, analgesia/anestesia e garantir a revisão adequada de dados experimentais, preocupações ou problemas.

  1. Certifique-se de que a taxa de infusão intravenosa de fluido combinado total (LRS e D5W) para homeostase seja geralmente de 5-8 mL / kg / h.
    1. Administre D5W ao cateter venoso da orelha a 5-10 mL / h (ajustado de hora em hora com base nos valores de glicose arterial (BG) - alvo 4-5 mmol / L).
    2. Administre LRS através do cateter venoso femoral a uma taxa de 1-6 mL / kg / h para manter a homeostase do fluido. Para evitar a coagulação do acesso arterial e venoso, conecte uma bolsa de infusão de NS heparinizada sob pressão ao transdutor e mantenha a pressão entre 250-300 psi.
    3. Garantir a profundidade e analgesia adequadas da anestesia geral durante toda a cirurgia e antes de iniciar o período de estabilização (etapa 5.1) e induzir o relaxamento muscular.
  2. Monitoramento dos diferentes parâmetros (trabalho em tempo integral para uma pessoa durante todo o experimento).
    NOTA: Monitoramento e documentação de sinais vitais, configurações do ventilador, intervenções, amostras coletadas, medicamentos, com doses e horários, em um CFR impresso pré-fabricado (ver Arquivo suplementar 1) durante todo o experimento. Os dados contínuos registrados do monitor de pressão e do ventilador são salvos no final do experimento para análise posterior.
    1. Monitore a saturação de oxigênio (SpO2) - garanta o sinal do oxímetro de pulso pré-ductal (casco superior direito).
    2. Monitore a frequência cardíaca (FC) - conecte os eletrodos de ECG ao leitão.
    3. Para monitorar a temperatura, insira o termômetro retal lubrificado com 3-4 cm de profundidade e prenda-o na cauda com fita adesiva. Mantenha a temperatura retal do leitão em 38-39 °C ajustando a almofada de aquecimento e a temperatura ambiente ambiente (25 °C). Se estiver usando uma fonte de aquecimento elétrico, certifique-se de que um cobertor extra seja colocado entre o leitão e a esteira de aquecimento para evitar queimaduras.
      NOTA: Use uma fonte de aquecimento adicional, como um sistema de aquecimento de ar forçado (como um cobertor sobreposto acima do leitão) se a homeostase da temperatura não for alcançada adequadamente.
    4. Para a pressão arterial, realize monitoramento não invasivo com um manguito de tamanho adequado até depois da cirurgia, depois determine a pressão arterial invasiva, incluindo pressão arterial média (PAM) e pressão venosa central (PVC), e documente na IRC.
      NOTA: Certifique-se de que as cúpulas dos transdutores arteriais e venosos sejam colocadas e zeradas no nível do coração para leituras precisas.
    5. Realize amostragem de sangue em pontos de tempo pré-especificados por meio de cateter arterial ou venoso central. Realize a gasometria de 0,1 mL de sangue arterial heparinizado usando um analisador de sangue portátil (um dispositivo que pode avaliar em pH mínimo, PCO2, PO2, HCO3, BE, BG, lactato, creatinina, Na, K, Cl - a ser observado na CRF) para gerenciar a ventilação e o controle metabólico durante todo o experimento.
    6. Realizar amostragem biológica para experimentação e análise futuras: coletar sangue total, plasma e urina em pontos relevantes durante o protocolo experimental, conforme os objetivos do estudo. Colete também amostras de desfechos, incluindo fluido de lavagem broncoalveolar (BALF), tecido pulmonar e outros tecidos16,17, conforme relevante para os objetivos do estudo.
      1. Limite a anemia iatrogênica e a hipovolemia:
        1. Retire lentamente (equivalente a três vezes o volume do espaço morto) sangue em uma seringa, reserve e retire volume suficiente para futuras análises experimentais (0,4-1,5 mL)25 , como marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo. Adapte os volumes da amostra ao peso corporal, nível de hemoglobina e estabilidade do leitão.
          NOTA: O sangue do espaço morto é devolvido ao animal e a linha é lavada com solução salina com pelo menos o volume equivalente que foi coletado para amostragem de sangue (gasometria ± sangue para experimentação futura) para limpar a linha de sangue, limitando a possível oclusão devido ao coágulo sanguíneo.
    7. Registre todos os sinais vitais e parâmetros ventilatórios na IRC em intervalos regulares a cada 15-30 minutos, com mais frequência durante a indução da anestesia e cirurgia, ou se o leitão estiver instável.
    8. Observe as mudanças nos medicamentos desde o início da anestesia ao longo do experimento, observando o horário de início e término, bem como as modificações da dose.
    9. Avalie a profundidade da anestesia avaliando a pinça do dedo do pé/banda coronária para reflexo de retirada inicialmente em uma frequência regular. Uma vez alcançado o relaxamento muscular completo, monitore a frequência cardíaca e a pressão arterial para avaliação contínua da profundidade da anestesia.
    10. Apontar para o seguinte, se nada mais declarado, ao longo do experimento: FC: 120-180 bpm, PAM: 50-80 mmHg, PVC: 3-10 cmH2O, Temperatura corporal: 38-39 °C, BG: 4-5 mmol / L, PaCO2: 35-45 mmHg, ajustar RR (máx. 60 respiração / min), Volume corrente (VT): 7 mL / kg, ajustar o PIP.

4. Procedimento cirúrgico (tempo: ~ 30-40 min)

  1. Mantenha a ventilação durante a cirurgia.
    1. Manter FR de 30 ciclos/min, direcionar o VT expiratório em 10 mL/kg ajustado por PIP, PEEP constante de 6 cmH2O, Tinsp de 0,4 s e FiO2 em 1,0.
  2. Estabeleça um campo estéril realizando uma esfoliação asséptica preferida da pele no pescoço para traqueostomia e virilha para acesso ao vaso femoral usando técnicas de lavagem padrão.
    1. Faça a incisão no pescoço.
      1. Realizar incisão cutânea no pescoço com bisturi entre a cartilagem cricóide e a incisura esternal (tamanho aproximado de 10 cm). Use dissecção romba para isolar a traqueia.
      2. Passe dois laços umbilicais de 12 polegadas embaixo da traqueia.
      3. Faça uma incisão de 5 mm entre os anéis traqueais e a porção mais anterior da traqueia, logo abaixo da cartilagem cricoide. Insira o tubo endotraqueal (TET). Dê o primeiro nó no topo da traqueia mais próximo da incisão.
      4. Encha o manguito TET, retraia suavemente o ETT até que o manguito seja parado pela gravata. Aperte a primeira braçadeira e prenda uma segunda braçadeira no ETT. Este método garante que a ponta esteja acima da carina, confirmada pela ausculta de murmúrios vesiculares simétricos e bilaterais.
        NOTA: O brônquio do lobo direito cranial surge proximal à bifurcação da traqueia. Tenha cuidado com o bloqueio deste brônquio se o TET for colocado muito profundamente. Se ocorrerem problemas com ventilação ou mudanças repentinas, considere ajustar o tubo. O tronco vagosimpático e os nervos laríngeos encontram-se nesta área do pescoço. Deve-se tomar cuidado para evitar estimulação ou lesão desses nervos.
    2. Faça a incisão na virilha.
      1. Palpe a artéria femoral, faça uma incisão superficial na pele na virilha direita com um bisturi (aproximadamente 8-10 cm).
      2. Use dissecção romba para isolar a artéria e a veia femoral.
      3. Passe duas suturas (seda 3.0) sob cada uma das artérias e veias femorais para isolá-las26. Prepare os cateteres a serem inseridos.
        1. Para o cateterismo da veia femoral direita, levante ambas as suturas para ocupar qualquer fluxo sanguíneo. Amarre a veia femoral distal ao local de inserção proposto.
          1. Insira o cateter totalmente, puxando ligeiramente o estilete para trás e amarrando a braçadeira distal para prender o cateter no lugar. Remova o estilete e prenda o conjunto de extensão de 6 polegadas com uma torneira de três vias que foi preparada com solução salina.
          2. Antes de prender o cateter, retire uma pequena quantidade de sangue para garantir a permeabilidade. Prenda o cateter no vaso usando a cinta de sutura proximal, evitando que o cateter escorregue.
          3. Conecte a porta secundária para a administração de fluido de manutenção e a infusão de medicamentos. Conecte a porta primária para pressão venosa central.
        2. Para o cateterismo arterial femoral direito, use os mesmos passos na artéria femoral que para a veia descritos nas etapas 4.2.2.3.1.1 a 4.2.2.3.1.3.
          1. Conecte a primeira porta da torneira de 3 vias para monitoramento invasivo da pressão arterial e perca as incisões na virilha e no pescoço com grampos cirúrgicos.
    3. Realize a inserção do cateter vesical suprapúbico para acesso urinário.
      1. A bexiga está localizada superficialmente na parte inferior do abdômen, ligeiramente à esquerda da linha sagital média. Limpe o abdômen usando técnica asséptica.
      2. Insira um angiocateter estéril de 18 G (2") paralelo à parede abdominal, cranial ao par mais baixo de mamilos (5-6 cm abaixo do umbigo), apontado para o umbigo e, com uma mão, coloque uma leve pressão em ambos os lados da bexiga para estabilizar e aumentar um pouco (protocolo opcional para aspiração suprapúbica pode ser encontrado em outro lugar27).
      3. Assim que o fluxo de urina for confirmado, prenda o cateter no abdômen para garantir sua posição. Conecte um conjunto de extensão de grande diâmetro ao cateter. Coloque a extremidade distal em um tubo de 50 mL colocado abaixo do animal.

5. Estabilização e recrutamento pulmonar pós-operatório padronizado (Tempo: ~ 30-60 min)

NOTA: A estabilização começa quando todos os procedimentos cirúrgicos são concluídos. Analgesia/profundidade anestésica suficiente é essencial antes do relaxamento muscular, pois garante que os sinais vitais, como PAM e FC, estejam dentro da normalidade e a ausência de reflexos de abstinência. A PAM e a FC serão monitoradas continuamente durante todo o protocolo para garantir a profundidade anestésica adequada.

  1. Administrar rocurônio (0,3 mg/kg) bolus IV (via acesso D5W da veia da orelha) e iniciar uma infusão contínua de rocurônio (5,5 mg/kg/h) para relaxamento muscular antes da manobra de recrutamento pulmonar. Esta infusão continuará durante o experimento para padronizar o procedimento de lavagem e evitar assincronia com o ventilador.
  2. Realize uma manobra padronizada de recrutamento pulmonar.
    1. Aumento gradual da PEEP: comece na PEEP 6 cmH2O, subindo 1 cmH2O a cada minuto até que a PEEP 10 cmH2O seja alcançada. Ajuste o PIP para manter o VT de 10 mL / kg.
    2. Permaneça em PEEP 10 cmH2O por 2 min antes de retornar a PEEP 6 cmH2O de maneira inversa (como na etapa 5.2.1), mantendo VT 10 mL / kg.
    3. Quando estável em LV 10 mL / kg em uma PEEP 6 cmH2O, registre as configurações respiratórias, parâmetros fisiológicos e tome uma gasometria arterial (ponto de tempo VT 10 mL / kg em CRF).
      1. Certifique-se de que a PaO2 seja >400 mmHg (resposta esperada à hiperóxia em um animal com pulmões saudáveis). FiO2 1.0 é usado durante as fases iniciais do experimento para garantir uma resposta apropriada à hiperóxia como critério de inclusão.
      2. Se isso não for alcançado:
        1. Verifique a posição do tubo endotraqueal, as configurações do ventilador, o fornecimento de oxigênio e a técnica adequada de coleta de sangue. Repita a manobra de recrutamento pulmonar uma vez para garantir o recrutamento adequado.
        2. Se ainda não melhorar, exclua o animal e eutanasia-o imediatamente (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) devido ao potencial problema intrínseco do pulmão (pulmão insalubre devido a exposição não experimental anterior - ou seja, na fazenda).
      3. Ajuste o RR para manter a PaCO2 entre 35-45 mmHg.
      4. Abaixar a PIP para atingir VT 7 mL/kg, mantendo FiO2 1,0 e PEEP 6 cmH2O.
      5. Após a estabilização, registre as leituras basais do ponto de tempo para VT 7 mL/kg na folha CRF com parâmetros fisiológicos e amostras, incluindo gasometria arterial e venosa. A estabilização inclui sinais vitais, como nas etapas 3.2.10, e valores de gasometria de: PaO2: 400-500 mmHg, PaCO2: 35-45 mmHg, pH: 7,35-7,45, BG: 4-5 mmol / L.

6. Ventilação para animais de controle

  1. Use ventilação controlada por volume com volume corrente de 7 mL/kg, PEEP de 6 cmH2O e FiO2 de 1,0. Não induza lesão pulmonar em animais de controle (ou seja, não realize depleção de surfactante ou instilação de endotoxina).
  2. Continue a ventilação por aproximadamente 90 minutos para corresponder à duração média necessária para induzir lesão pulmonar em animais experimentais (ver etapa 7 e Figura 1). Após esse período, prossiga diretamente para a etapa 10.

7. Indução de lesão pulmonar aguda (modelo multi-hit)

  1. Realize a depleção do surfactante (Tempo: 1-2 h)
    1. Antes de iniciar a lavagem pulmonar, ligue o aparelho de sucção e certifique-se de que esteja pronto para uso. Coloque o balde de coleta de lavagem na posição. Posicione as almofadas absorventes sob a cabeça do animal e abaixo da mesa cirúrgica para capturar todo o fluido vazado e recuperado durante a lavagem.
      1. Pese as almofadas antes e depois da lavagem. Defina o ventilador para PEEP 5 cmH2O, PIP 25 cmH2O, RR 25/min e FiO2 1.0. Mantenha essas configurações ventilatórias controladas por pressão durante todo o procedimento de lavagem. Espere que o VT diminua em aproximadamente 35% a 45% durante a lavagem completa.
    2. Desconecte o circuito ventilatório do TET e conecte o aparelho do funil de lavagem (consulte o Arquivo Suplementar 1).
    3. Instilar 30 mL / kg de solução salina isotônica quente (NS) nos pulmões, despejando suavemente o NS no funil mantido aproximadamente 30 cm acima do leitão.
    4. Massageie a caixa torácica pressionando bilateralmente o aspecto lateral para fornecer um "aperto" mecânico. Ajude a mover a solução salina para os pulmões e circulá-la dentro do aparelho de lavagem. Permita 2-3 s entre as massagens.
      NOTA: Evite massagear muito rapidamente ou muito lentamente para evitar a remoção inadequada do surfactante ou o retorno venoso prejudicado. Não exceda 30 s por rodada de lavagem.
      1. Remova o fluido de lavagem abaixando o funil abaixo do leitão. Desconecte levemente o funil do ETT para permitir que o fluido escorra para o balde de coleta no chão.
      2. Execute a sucção ativa por no máximo 10 s. Insira o cateter de sucção no TET enquanto continua a massagem na caixa torácica para facilitar a drenagem de fluidos. Monitore a PAM e a FC e recoloque a ventilação antecipadamente se um dos parâmetros cair significativamente.
      3. Reconecte o circuito ventilatório. Se o excesso de líquido permanecer no TET, faça uma segunda sucção.
    5. Deixe o leitão se recuperar por pelo menos 3 minutos entre as rodadas de lavagem para reduzir o estresse e o risco de intolerância.
    6. Comece a próxima rodada de lavagem assim que o SpO2 retornar a 100%. Se a SpO2 não retornar a 100%, verifique a PaO2por meio da gasometria assim que a SpO2 estiver estabilizada
      1. Se PaO2 >100 mmHg - repita as lavagens pulmonares (etapas 7.1.2-7.1.6).
      2. Se PaO2 <100 mmHg - aguarde 15 min enquanto mantém as configurações de ventilação da lavagem e, em seguida, repita a gasometria.
      3. Se PaO2 >100 mmHg - continue a lavagem e prossiga para a etapa 7.1.6 para reavaliar a extensão da lesão.
    7. Confirme se a lesão por depleção do surfactante é alcançada quando a PaO2 permanece <100 mmHg por 15 min. Pare a lavagem e prossiga para a próxima etapa.
  2. Instilar endotoxina intratraqueal (Tempo: 15 min)
    1. Prepare o lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli (1,5 mg / kg) diluindo em NS até um volume total de 2 mL em uma seringa de 3 mL.
      NOTA: Selecione a cepa e a dose conforme apropriado, reconhecendo a variação potencial dos efeitos dependentes da cepa.
    2. Aguarde 15 minutos após a lavagem pulmonar final e, em seguida, instile LPS por via intratraqueal (IT) com o leitão em decúbito dorsal.
    3. Melhore a distribuição homogênea do LPS no pulmão atelectásico usando as seguintes etapas:
      1. Substitua a extremidade padrão do TET por um adaptador de porta Y para permitir a ventilação simultânea e a administração de LPS por meio de um cateter através da porta lateral valvulada.
      2. Aplicar PEEP de 10 cmH2O por 1 min. Ajuste a PIP para manter o VT em 7 mL/kg e defina a FR para 40 respirações/min.
      3. Insira um cateter através da porta lateral no TET até uma profundidade pré-medida para que a ponta se estenda 1-2 mm além do TET.
      4. Injete o LPS através do cateter. Lave o cateter com 1 mL NS seguido por um bolus de ar de 9 mL para garantir a entrega completa.
      5. Remova o cateter e feche a porta lateral.
      6. Continue a ventilação com PEEP 10 cmH2O (ajuste o PIP para manter o VT 7 mL / kg) por 3 min após a administração de LPS.
      7. Desconecte o circuito do ventilador do TET por 30 s para reverter qualquer recrutamento não intencional de tecido pulmonar.
      8. Durante a desconexão, ajuste as configurações do ventilador para FiO2 0.5, PEEP 6 cmH2O, PIP para manter o VT 7 mL/kg e aumente a FR para 40-60 respirações/min para atingir PaCO2 de 35-45 mmHg.
      9. Uma vez que o VT esteja estabilizado em 7 mL / kg, registre as medições fisiológicas de 0 horas e preencha a folha de CRF. Ajuste a FR com base na PaCO2 da gasometria.

8. Ventilação durante o período de observação (Tempo: ~6 h)

  1. Mude para ventilação controlada por volume com FiO2 a 0.5 e PEEP a 6 cmH2O. Ajuste o PIP conforme necessário para manter o VT em 7 mL / kg (não defina um PIP máximo). Ajuste a FR, até um máximo de 60 respirações/min, para manter a PaCO2 normal.
  2. Use medições de gases sanguíneos de hora em hora para orientar os ajustes de RR durante o restante do experimento. Ajuste continuamente o PIP para manter o VT em 7 mL / kg.
  3. Aplicar estes parâmetros de ventilação uniformemente aos animais de controlo e multi-hit durante todo o período de observação de 6 horas (ver figura 1).

9. Procedimento de tratamento - opcional (Tempo: ~ 10-20 min)

  1. Para possíveis estudos de intervenção, administre o agente terapêutico por uma via clinicamente relevante, como intratraqueal (IT), intravenosa (IV), subcutânea, intramuscular ou intranasal. Selecione o momento do tratamento com base no desenho experimental. Se nenhum tratamento for administrado, pule para a etapa 10. Um exemplo de administração de TI é fornecido abaixo:
    1. Posicione o leitão em decúbito lateral direito.
    2. Mantenha a PEEP a 6 cmH2O. Ajuste a PIP para atingir um VT de 7 mL / kg.
    3. Insira o cateter na porta lateral valvulada no comprimento predeterminado (conforme descrito na etapa 7.2.3.3). Instilar metade da dose ou volume pretendido da intervenção. Siga com um bolus de 1 mL NS e 9 mL de ar. Limite o volume total a 2,5 mL/kg para minimizar o risco de oclusão da ventilação após a injeção em bolus.
    4. Vede a porta lateral valvulada com a tampa para evitar vazamento de ventilação.
    5. Reposicione o leitão em decúbito lateral esquerdo e repita as etapas 9.1.3-9.1.4.
    6. Retorne o leitão para a posição supina. Ajuste o PIP para manter o VT em 7 mL / kg.
    7. Continue a ventilação conforme descrito na etapa 8.

10. Eutanásia e conclusão do experimento

  1. Realizar os registros fisiológicos finais e coletas de amostras após 6 h de ventilação durante o período de observação (etapa 8).
  2. Eutanasiar o animal com 120 mg/kg de Pentobarbital Sódico IV (240 mg/mL) administrado em bolus (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
  3. Garantir a morte de um animal com ausência de sinais vitais (batimentos cardíacos, pressão arterial e respiração). Auscultar para a ausência de frequência cardíaca e murmúrios vesiculares com um estetoscópio para confirmação de morte. A morte é confirmada com uma coleção de tecido terminal do coração e do pulmão.
  4. Colete as amostras de tecido e fluidos corporais para posterior análise bioquímica, molecular e / ou histológica14,17 para experimentos futuros.
  5. Salve todos os dados no equipamento de monitoramento e no ventilador, certifique-se de que as cópias de backup sejam carregadas na unidade local e na unidade compartilhada e desligue todos os equipamentos.
  6. Descarte todos os materiais perfurocortantes/de risco biológico conforme indicado pelas políticas locais.
  7. Limpe todas as superfícies com o produto anti-séptico preferido.
  8. Lave todos os instrumentos e deixe secar durante a noite.

Resultados

Os desfechos desse modelo estão alinhados com os critérios da American Thoracic Society para LPA (mínimo 3 de 4), que incluem alterações fisiológicas, histológicas, inflamatórias e da barreira alvéolo-capilar16,17. Outros desfechos podem ser incluídos dependendo do estudo e a critério de cada grupo de pesquisa que deseja implementar este modelo. A lesão pulmonar moderada é definida como uma razão entre a fração parcial de oxigênio no sangue arterial e a fração inspirada de oxigênio (PaO2/FiO2, também conhecida como relação P/F) < 200 mmHg, e a < grave de 100 mmHg17. O índice de oxigênio (IO) é calculado usando a seguinte fórmula: OI = (pressão média nas vias aéreas (mAWP) * %O2)/PaO2, e valores entre 8-16 são classificados como lesão moderada28. Em comparação com os animais controle, os animais multi-hit apresentaram lesão pulmonar grave a moderada devido ao índice de oxigenação prejudicado, relação P/F e diminuição da complacência do sistema respiratório (Figura 2). Sinais claros de lesão histológica estavam presentes usando um escore de lesão pulmonar histológica de 5 modalidades16,17 (Figura 3), com influxo de neutrófilos no espaço alveolar e intersticial, debris proteicos preenchendo os espaços aéreos e espessamento dos septos alveolares. O influxo de neutrófilos no LBA fornece uma indicação de processos inflamatórios juntamente com o aumento da citocina IL-6 no tecido pulmonar (Figura 4).

figure-results-1
Figura 1: Fluxograma de lesão pulmonar aguda em leitões neonatais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Observa-se LPA moderada a grave seguindo a lesão multi-hit apresentada neste protocolo. (A,B) O aumento do índice de oxigenação (entre 8-12) e a baixa relação PaO2/FiO2 (P/F) são obtidos no modelo multi-hit aqui apresentado (linha vermelha) em comparação com o controle (linha azul), em consonância com a lesão pulmonar moderada a grave. (C) A função pulmonar é prejudicada em animais multi-hit, aqui mostrada como >50% de diminuição na complacência do sistema respiratório. Número de animais (N): controle (N = 5) e multi-hit (cepa LPS O55:B5, 1,5 mg/kg) (N = 3). Todos os valores usados significam ± DP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: O modelo ALI multi-hit exibe uma lesão histológica heterogênea. (A,B) Observa-se evidência macroscópica de lesão pulmonar irregular afetando preferencialmente a face central posterior do pulmão multi-hit. (C, D) Imagens representativas (100x) de cortes pulmonares corados com hematoxilina e eosina (H&E) mostrando influxo neutrofílico no espaço alveolar e intersticial, com espessamento alveolar e septal no pulmão multi-hit. (E, F) Imagens representativas (400x) de cortes pulmonares corados com H & E destacam comprometimento da integridade estrutural, infiltração neutrofílica e deposição de detritos no espaço alveolar do pulmão multi-hit. Os quadrados azuis representam a área ampliada em (E,F). A barra de escala preta representa 100 mm (C,D) e 50 mm (E,F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: O modelo multi-hit mostra uma resposta inflamatória após LPA. (A) Influxo de neutrófilos com neutrófilos atingindo mais de 75% da fração do total de células no lavado broncoalveolar (BALF) 6 h após lesão pulmonar induzida (multi-hit) em comparação com animais controle. (B) A citocina pró-inflamatória IL-6 está elevada no líquido de lavagem broncoalveolar (LBA) e (C) no tecido pulmonar 6 h após a LPA induzida. O número de animais (N) varia em função do material disponível no momento da análise. Para o LBA (B), foi utilizado um ensaio imunoenzimático, enquanto para o tecido pulmonar (C), foi realizada a tecnologia de esferas a laser multiplex. Todos os valores são mostrados como média ± DP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Formulário de monitoramento de caso para modelo de lesão pulmonar aguda em leitões neonatais. Clique aqui para baixar este fle.

Discussão

O modelo ALI de leitões neonatais consiste em um modelo multi-hit com lavagem pulmonar para remoção de surfactante (mimetizando a síndrome do desconforto respiratório levando ao atelectotrauma), alta exposição ao oxigênio (levando a espécies reativas de oxigênio), ventilação mecânica (baro/volu-trauma), bem como administração IT de LPS como estímulo inflamatório, espelhando os vários componentes que se acredita estarem envolvidos na patogênese da DBP em bebês prematuros2. Durante o processo de depleção do surfactante, há um aumento proposital da pressão e do oxigênio para contribuir para a lesão. A exposição à hiperóxia com FiO2 1.0 é de aproximadamente 3 h, e alta pressão é adicionada por cerca de 90 min durante a fase de lesão pulmonar induzida (depleção de surfactante, lavagem e instalação de endotoxina). Altos níveis inspirados de oxigênio durante a ressuscitação (FiO2 0,9 vs.FiO 2 0,3) em bebês nascidos prematuros extremos resultaram em maior estresse oxidativo e inflamação, com exposição à hiperóxia inferior a 1 h29. Após a depleção do surfactante no modelo de leitão, os pulmões entrarão em colapso/resultando em atelectasia, e a capacidade de manter a permeabilidade alveolar será reduzida para ventilação e oxigenação adequadas. Como tal, mesmo que as configurações sejam reduzidas no período de observação, a remoção do surfactante resultará na necessidade de maior pressão para atingir um volume corrente de 7 mL / kg. Os pulmões serão capazes de produzir surfactante com o passar do tempo, e a extensão do processo prejudicial em andamento pode diminuir com o tempo. No entanto, este novo modelo de leitões neonatais de LPA mostra pouca recuperação (Figura 2) da função pulmonar (complacência) e oxigenação (relação FP) durante o período de observação por 6 h após a lesão pulmonar induzida. Este modelo se assemelha muito às circunstâncias pós-natais iniciais mais comuns que os bebês extremamente prematuros enfrentam, tornando-o altamente relevante para os esforços translacionais. O modelo cria uma lesão pulmonar aguda moderada (100-200 mmHg) a grave (<100 mmHg) definida pela relação P/F28. O efeito do LPS com inflamação atinge o pico em uma a 2 h após a lesão30. Este modelo pode ser usado como um andaime que pode ser manipulado por outros grupos, alterando a duração da observação ou tratamento usado para se adequar ao seu programa de pesquisa.

Etapas críticas no protocolo

Apesar da priorização da acessibilidade, esse modelo animal de grande porte permanece complexo, exigindo uma equipe altamente qualificada para trabalhar de forma colaborativa para concluir esse experimento. Existem etapas críticas no protocolo que exigem cuidado extra. Essas considerações são críticas para garantir o sucesso dessa estrutura experimental complexa.

Transporte do animal

Espera-se que o desapego precoce da mãe seja um momento extremamente estressante para o animal, o que potencialmente leva à incapacidade de manter a estabilidade cardiovascular e à possível morte durante o transporte. No entanto, o protocolo de transporte (ver passo 3) aqui apresentado permitiu animais muito calmos (alguns até adormecendo), permitindo a experimentação completa. Embora seja difícil fazer recomendações claras sobre a duração máxima do transporte, os leitões foram capazes de suportar confortavelmente um transporte de aproximadamente 60 minutos em nossa experiência.

Otimização da ventilação

O ventilador precisa ser ajustado para compensar a conformidade do circuito para garantir que todo o volume corrente seja entregue aos pulmões. Isso é particularmente importante durante a depleção do surfactante, pois o leitão pode se tornar hemodinamicamente instável se o volume corrente for perdido no circuito. Os pesquisadores precisam confirmar se o ventilador disponível permitirá a entrega adequada do volume corrente para um recém-nascido. Os ventiladores para adultos muitas vezes não serão capazes de atingir volumes correntes neonatais adequados. A PIP é usada para manter os valores do volume corrente expiratório (7 mL/kg usados neste protocolo, conforme descrito anteriormente por outros 14,19,20,21,31,32, exceto durante a lavagem pulmonar - ver a próxima seção). O uso padronizado do adaptador do tubo endotraqueal com uma porta lateral valvulada durante a administração do LPS, ou para qualquer tratamento IT, permite manter a pressão das vias aéreas, evitando a desconexão do circuito ventilatório.

Estratégia padronizada de recrutamento pulmonar após a cirurgia

A atelectasia pode se desenvolver nos pulmões dos leitões durante os estágios preparatórios e cirúrgicos. Uma manobra de "recrutamento pulmonar" após o relaxamento muscular foi administrada33 para garantir a aeração pulmonar adequada. Após a manobra de recrutamento, espera-se que a pressão parcial de oxigênio no sangue arterial seja superior a 400 mmHg, dada a resposta hiperóxica normal em pulmões abertos saudáveis. Se isso não for alcançado, o pesquisador precisa considerar se os pulmões não foram recrutados adequadamente devido a condições experimentais não otimizadas ou se o leitão pode ter uma condição pré-existente (por exemplo, se o leitão for obtido de uma fazenda onde podem ocorrer exposições desconhecidas). O protocolo permite que a explicação anterior seja testada com o reinício da manobra de recrutamento uma vez para ver se esse objetivo pode ser alcançado. Se houver falha em atingir 400 mmHg de PaO2 uma segunda vez, considere a exclusão do animal, como uma condição pré-existente que poderia existir, o que influenciaria inadequadamente os resultados experimentais.

A homeostase hidrográfica e metabólica suficiente é de extrema importância

Isso limitará importantes efeitos de confusão ligados à má hidratação e controle metabólico. Esses leitões recém-nascidos a termo, geralmente nascidos em uma grande ninhada, nem todos terão uma oportunidade semelhante de amamentar. Como tal, eles podem ser expostos a algum nível de desidratação pós-natal antes de serem usados no experimento. Fornecer uma ingestão total de líquidos de 5-8 mL/kg/h é suficiente para manter um bom volume intravascular 14,34. A garantia do controle metabólico ocorre com a manutenção de um nível de glicose no sangue entre 4-5 mmol / L (faixa fisiológica normal para leitões recém-nascidos35,36). O lactato sanguíneo elevado é outra referência usada para refletir o fornecimento de oxigênio deficiente e pode possivelmente refletir o baixo estado do fluido intravascular antes da hipóxia. Um regime de fluidos suficiente e um animal bem hidratado resistem à depleção de surfactante com estabilidade cardiovascular e não geram acidose grave. Os valores de referência da hemoglobina e outros parâmetros bioquímicos variam de acordo com a idade e a espécie37,38. A hemoglobina mais baixa pode impactar na oxigenação, o que requer coleta de sangue otimizada e conservadora39,40. Cada coleta de sangue é compensada com um volume igual de NS. Eletrólitos sanguíneos, ureia e níveis de creatinina foram usados para seguir um regime de fluidos suficiente.

Permitir tempo de recuperação suficiente durante o procedimento de lavagem pulmonar

Durante a lavagem pulmonar, é necessária uma importante janela de recuperação de pelo menos 3-5 minutos entre cada lavagem para permitir o retorno venoso adequado para evitar congestão hepática perigosa41, hemorragia hepática e insuficiência cardíaca direita. Esse fenômeno foi observado em alguns animais da coorte experimental. O gerenciamento adequado e proativo de fluidos é fundamental para a manutenção da estabilidade clínica. Ao recriar um pequeno ambiente de terapia intensiva para este modelo de leitão, é essencial a importância de ter um clínico, neonatologista ou técnico veterinário sênior que possa facilitar a tradução do conhecimento entre os membros da equipe para reconhecer situações importantes e seus planos de contingência associados.

Solução de problemas recomendada

O leitão ficará sob anestesia geral e analgesia durante todo o tempo cirúrgico e experimental. Uma pessoa se dedica a monitorar o leitão durante todo o experimento. Cada animal é diferente em sua sensibilidade e resposta aos anestésicos. Monitorar a condição do animal imediatamente após a indução da anestesia com sinais vitais e gases sanguíneos de hora em hora é fundamental. Ele fornecerá informações sobre o nível de anestesia e estabilidade metabólica, além da avaliação física conforme necessário. Há uma variabilidade no número de lavagens pulmonares (de 6 a 20) e, portanto, no tempo (de 28 a 115 min) necessário para atingir a depleção do surfactante.

Possíveis problemas e soluções durante a indução, estabilização e cirurgia da anestesia: (1) Se a apneia se desenvolver, o gás anestésico deve ser desligado e a respiração precisa ser apoiada com ventilação bolsa-máscara até que a respiração espontânea retorne. (2) Se houver sinais de hipovolemia por meio de FC alta, PAM baixa ou PVC baixa, um bolus de fluido de 10 mL/kg de SN precisa ser administrado e uma taxa aumentada de fluido de manutenção deve ser considerada. (3) Quando a hipotensão com diminuição da PAM para 30-40 mmHg, que não é resolvida com o bolus de fluido, as bombas de anestesia devem ser diminuídas/interrompidas, e os sinais de perfusão e hipotensão são reavaliados após 10-15 min. Análise de gases sanguíneos para níveis de hemoglobina para avaliar possíveis hemorragias internas. (4) Se os sintomas respiratórios indicarem pneumotórax (dessaturação aguda ou bradicardia >20%), o leitão é sacrificado imediatamente.

Limitações

O modelo aqui representado uma LPA neonatal de curto prazo (6 h) em um modelo animal de grande porte. A cronicidade da lesão que leva ao TPB é um fator importante a ser considerado. Este modelo pode não capturar totalmente esse aspecto da patogênese, e os dados que informam o progresso da lesão pulmonar além de 6 h permanecem indeterminados. No entanto, a consistência deste modelo permanece como uma base sólida para construir (estendendo o protocolo de comprimento/modificação), permitindo versatilidade aos grupos de pesquisa que irão implementá-lo. Apesar da ênfase colocada na acessibilidade e viabilidade deste grande modelo animal durante sua concepção, conjuntos de habilidades específicas são necessários para a execução tranquila do experimento. A experiência clínica com uma base sólida em fisiologia e conhecimento para gerenciar mudanças / deteriorações rápidas por meio de medicamentos / infusão / etc. é necessária para a implementação e conclusão bem-sucedida nas fases iniciais. Esse conjunto de habilidades pode ser transferido para os membros da equipe para manutenção contínua do modelo ao longo do tempo. Além disso, uma equipe composta por um técnico veterinário, técnicos de laboratório e alunos de pós-graduação seniores com os quais uma forte comunicação e colaboração foram estabelecidas pode garantir a cobertura adequada de todos os componentes de cada experimento. Espera-se que pelo menos três membros da equipe sejam necessários para realizar o experimento do início ao fim quando o fluxo de trabalho for otimizado.

Significado e sua aplicação potencial

A tradução clínica depende de estudos fundamentais sólidos no nível pré-clínico. No entanto, muitos ensaios clínicos falham devido à incompatibilidade entre o modelo pré-clínico e a fisiologia humana, destacando a importância de modelos animais de grande porte intimamente relacionados para fortalecer o potencial de tradução. A geração de um novo modelo de lesão pulmonar em leitões neonatais é fundamental para entender melhor os eventos patogênicos precoces, promovendo um ambiente propício para o desenvolvimento de DBP no pulmão humano pré-termo. O modelo aqui apresentado recria aspectos importantes de um ambiente de terapia intensiva (hiperóxia, ventilação de alta pressão e falta de surfactante) para bebês prematuros durante os primeiros dias de vida, que é modelado de perto. Este novo e versátil modelo multi-hit de leitões neonatais oferecerá informações valiosas sobre os processos patogênicos iniciais do TPB, conhecimento avançado sobre candidatos terapêuticos, bem como sua otimização de entrega terapêutica para uma tradução clínica eficaz. Ele atuará como um excelente vetor para colaborações, promovendo uma estrutura de teste de hipóteses para estudos de prova de conceito que variam de segurança a eficácia e geração de conhecimento. Servindo como base para estudos futuros, este modelo avançará significativamente os esforços de tradução clínica para lesão pulmonar aguda observada em bebês prematuros.

Divulgações

Todos os outros autores não têm interesses conflitantes a declarar.

Agradecimentos

Somos gratos ao Dr. Martin Post, Hospital for SickKids, Toronto, que generosamente nos emprestou um ventilador neonatal que foi usado ao longo deste projeto. Também agradecemos a Dan DeVette e sua equipe do serviço veterinário e de cuidados com animais do Instituto do Coração da Universidade de Ottawa, por toda a assistência durante o desenvolvimento deste modelo. Este trabalho foi apoiado pelo fundo de inovação CHAMO da CHEO, a Rede de Células-Tronco, a associação da Princesa Lovisa [HKH Kronprinsessan Lovisas förening], a Fundação David e Astrid Hagelén e a Fundação Sueco Heart Lung

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lâmina do bisturi #10Incisão de pele
1 ml de seringaBectonDicksonBD309659Dica de deslize 
Seringas de 10 mlBectonDicksonBD302995Lave seringas para linhas arteriais e venosas
18 G de angiocatheter InsyteCanulação da bexiga
Seringas de 20 mlBectonDicksonBD302830Bolus fluido, se necessário
Agulhas hipodérmicas de 22 GBectonDicksonSeringa de recarga
24 G angiocatetersInsyte160465Acesso intravenoso no ouvido e artéria e veia do femur
Agulhas hipodérmicas de 25 GBectonDicksoninjeção intramuscular (IM) de bupenorfina
Seringas de 3 mlBectonDicksonInjeção de medicamentos e monitoramento de remoção de espaços mortos de linha
Gravatas de seda 3-0EthiconA304HUsado para fixar cateteres arteriais e venosos
Torneiras de 4 viasDiscofix, BraunD500456020acoplados a fluidos e linhas de monitoramento para lavagem e amostragem
Conjunto de extensões de 6"Tecnologias de Infusão SAIExt-6acoplado a cateterías/vías intravenosas 
Conjunto de extensão de 60"BBV6223Linhas de infusão de medicamentos
Adaptador de acesso AirLife Neo-Verso Y para Tubos EndotraqueaisVyaireCSC300Usado para administrar material intratraquealmente
Bupenorfina, 0,3 mg/mLCDMV128140Bolus intramuscular como analgésico
Dextrose, 5%BaxterJB0063Manutenção da glicose no sangue
Cortinas descartáveis3M3M1050Cortinas de campo estéreis
Eletrodos de ECG3M220790eletrodos de uso único para ECG
Cateter de administração do tubo endotraqueal (ETT)
Tubo endotraqueal 3,5 Teleflex5-10107Usado para traqueostomia
Epinefrina, 1 mg/mLHospira07541L01Diluído com soro fisiológico normal estéril a 0,1 mg/mL para reanimação, se necessário
Analisador de gases sanguíneos EPOC  Siemens10736398Sistema de análise de sangue epoc com hospedeiro NXS
Cartões de exemplo EpocSiemensBD309659Cartuchos de gás sanguíneo
Formalina, 10% tamponadoFisher ScientificSF100-4Fixação pulmonar
Bolsa térmicaKent ScientificTPZ-814EAManto circulante de água
Bombas de infusão intravenosa (IV) x 3Sigma AldrichZ401358Infusão de cetamina/propofol e rocurônio
Cetamina, 10 mg/mLVetoquinol112170Infusão contínua (diluída com soro fisiológico normal estéril) na bomba de seringa para manutenção anestesiática  
Cetamina, 100 mg/mLVetoquinol112170Usado como bolus para indução de anestesia geral e bomba de seringa para manutenção da anestesia & nbsp;
Anilheiros LactadosBaxterJB2323Manutenção do volume sanguíneo
Equipamento de lavagem: funil, conector de três vias, conector ETT, tubo de 4 pésN/AN/ATubos caseiros para lavagem
Lipopolissacarídeo, LPS (O55:B5), 100 mgSigma-AldrichL2880-100mgSegunda lesão pulmonar atingida
Umidificador respiratório MR850Fisher e PaykelMR850JXX*
Sódio Pentobarbital (Eutanil), 240 mg/mLVetoquinol381Bolus IV para eutanásia humanitária
Transdutor de pressãoSuprimentos Veterinários McCarthyV6402para pressões arterial/venosa no Surgivet
Propofol, 10 mg/mLUsado como bolus para indução de anestesia geral e bomba de seringa para manutenção da anestesia & nbsp;
Oxímetro de pulsoMaismoNEOPT-500
Rocurônio, 10 mg/mLAuropharma2498820Usado após a cirurgia e antes do início da indução da lesão pulmonar, seguida de infusão contínua
Soro salino, 0,9%BaxterJB1324Lavagem da linha de sangue e ressuscitação do volume sanguíneo
Água estérilN/AN/Apara umidificador ventilador
cateter de sucção 10 CH/25 cmMediplast608810251Usado para lavagem bronqueoalveolar do lobo pulmonar
cateter de sucção 6 CH/40 cmMediplast60880640remova o excesso de soro salino durante a lavagem
Instrumentos cirúrgicos: cabo de bisturi, pinça mosquito, pinça de polegar, tesoura metzenbaum, grampos, tesoura cirúrgica, retratores, gaze, tigela de aço inoxidávelN/AN/APacote cirúrgico autoclavado
Surgivet: manguito NIBP, sonda de temperatura e nbsp; 2x invasivo da pressão, ECG, oxímetro de pulsoSuprimentos Veterinários McCarthyv9203contém: braço de pressão arterial não invasivo (NIBP), termômetro, pressão arterial (BP) 2x invasiva, eletrocardiografia (ECG) e oxímetro de pulso
Bombas de seringa x 3Bombas de anestesia
FitaFixação das linhas de IV no ouvido
Fita umblicalEthiconSegura o tubo endotraqueal dentro da traqueia
Ventilador (Servo-I)Getingeprecisa ter configurações neonatais para um volume de maré adequado
Circuito ventilatórioFisher e PaykelRT265com umidificador
Grampo de oclusão de tubo VorseN/AN/AOclude o tubo durante lavagem

Referências

  1. Perin, J., et al. regional, and national causes of under-5 mortality in 2000-19: An updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet Child Adolesc Health. 6 (2), 106-115 (2022).
  2. Thebaud, B., et al. Bronchopulmonary dysplasia. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 78(2019).
  3. Demauro, S. B., et al. Early motor development in infants with moderate or severe bronchopulmonary dysplasia. J Neonatal Perinatal Med. 15 (1), 55-62 (2022).
  4. Augustine, S., et al. Mesenchymal stromal cell therapy in bronchopulmonary dysplasia: Systematic review and meta-analysis of preclinical studies. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2079-2093 (2017).
  5. Contopoulos-Ioannidis, D. G., Ntzani, E., Ioannidis, J. P. Translation of highly promising basic science research into clinical applications. Am J Med. 114 (6), 477-484 (2003).
  6. Haworth, S. G., Hislop, A. A. Adaptation of the pulmonary circulation to extra-uterine life in the pig and its relevance to the human infant. Cardiovasc Res. 15 (2), 108-119 (1981).
  7. Rendas, A., Branthwaite, M., Reid, L. Growth of pulmonary circulation in normal pig--structural analysis and cardiopulmonary function. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 45 (5), 806-817 (1978).
  8. Starbaek, S. M. R., et al. Animal models for influenza a virus infection incorporating the involvement of innate host defenses: Enhanced translational value of the porcine model. ILAR J. 59 (3), 323-337 (2018).
  9. Schneberger, D., Aharonson-Raz, K., Singh, B. Pulmonary intravascular macrophages and lung health: What are we missing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (6), L498-L503 (2012).
  10. Thomas, A. V., Broers, A. D., Vandegaart, H. F., Desmecht, D. J. Genomic structure, promoter analysis and expression of the porcine (sus scrofa) TLR4 gene. Mol Immunol. 43 (6), 653-659 (2006).
  11. Islam, M. A., et al. Age-related changes in phagocytic activity and production of pro-inflammatory cytokines by lipopolysaccharide stimulated porcine alveolar macrophages. Cytokine. 60 (3), 707-717 (2012).
  12. Kapetanovic, R., et al. The impact of breed and tissue compartment on the response of pig macrophages to lipopolysaccharide. BMC Genomics. 14, 581(2013).
  13. Chen, L., He, H., Fernandez Mondejar, E., Hedenstierna, G. Cyclooxygenase inhibitor blocks rebound response after no inhalation in an endotoxin model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284 (1), H290-H298 (2003).
  14. Spengler, D., Rintz, N., Krause, M. F. An unsettled promise: The newborn piglet model of neonatal acute respiratory distress syndrome (nards). Physiologic data and systematic review. Front Physiol. 10, 1345(2019).
  15. Tridente, A., De Martino, L., De Luca, D. Porcine vs. bovine surfactant therapy for preterm neonates with RDS: Systematic review with biological plausibility and pragmatic meta-analysis of respiratory outcomes. Respir Res. 20 (1), 28(2019).
  16. Kulkarni, H. S., et al. Update on the features and measurements of experimental acute lung injury in animals: An official American Thoracic Society workshop report. Am J Respir Cell Mol Biol. 66 (2), e1-e14 (2022).
  17. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: Features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol. 44 (5), 725-738 (2011).
  18. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (3), L379-L399 (2008).
  19. Preuss, S., et al. Inositol-trisphosphate reduces alveolar apoptosis and pulmonary edema in neonatal lung injury. Am J Respir Cell Mol Biol. 47 (2), 158-169 (2012).
  20. Spengler, D., et al. Novel therapeutic roles for surfactant-inositols and -phosphatidylglycerols in a neonatal piglet ARDS model: A translational study. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 314 (1), L32-L53 (2018).
  21. Von Bismarck, P., et al. Improved pulmonary function by acid sphingomyelinase inhibition in a newborn piglet lavage model. Am J Respir Crit Care Med. 177 (11), 1233-1241 (2008).
  22. Van Kaam, A. H., et al. Response to exogenous surfactant is different during open lung and conventional ventilation. Crit Care Med. 32 (3), 774-780 (2004).
  23. Lachmann, B., Robertson, B., Vogel, J. In vivo lung lavage as an experimental model of the respiratory distress syndrome. Acta Anaesthesiol Scand. 24 (3), 231-236 (1980).
  24. Thebaud, B., et al. Benefits and obstacles to cell therapy in neonates: The incubator (innovative neonatal cellular therapy for bronchopulmonary dysplasia: Accelerating translation of research). Stem Cells Transl Med. 10 (7), 968-975 (2021).
  25. Davies, M. W., Mehr, S., Morley, C. J. The effect of draw-up volume on the accuracy of electrolyte measurements from neonatal arterial lines. J Paediatr Child Health. 36 (2), 122-124 (2000).
  26. Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the Gottingen minipig: Intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. J Vis Exp. (52), e2652(2011).
  27. Stenersen, E. O., et al. A piglet perinatal asphyxia model to study cardiac injury and hemodynamics after cardiac arrest, resuscitation, and the return of spontaneous circulation. J Vis Exp. (191), e64788(2023).
  28. Force, A. D. T., et al. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
  29. Vento, M., et al. Preterm resuscitation with low oxygen causes less oxidative stress, inflammation, and chronic lung disease. Pediatrics. 124 (3), e439-e449 (2009).
  30. Vincent, D., et al. Intratracheal E. coli lipopolysaccharide induces platelet-dependent bronchial hyperreactivity. J Appl Physiol (1985). 74 (3), 1027-1038 (1993).
  31. Preuss, S., et al. 18:1/18:1-dioleoyl-phosphatidylglycerol prevents alveolar epithelial apoptosis and profibrotic stimulus in a neonatal piglet model of acute respiratory distress syndrome. Pulm Pharmacol Ther. 28 (1), 25-34 (2014).
  32. Von Bismarck, P., et al. Surfactant "fortification" by topical inhibition of nuclear factor-kappa b activity in a newborn piglet lavage model. Crit Care Med. 35 (10), 2309-2318 (2007).
  33. Pape, A., et al. Neuromuscular blockade with rocuronium bromide increases the tolerance of acute normovolemic anemia in anesthetized pigs. Eur Surg Res. 48 (1), 16-25 (2012).
  34. Gasthuys, E., et al. Repetitive urine and blood sampling in neonatal and weaned piglets for pharmacokinetic and pharmacodynamic modelling in drug discovery: A pilot study. Lab Anim. 51 (5), 498-508 (2017).
  35. Noblet, J., Dourmad, J. Y., Etienne, M., Le Dividich, J. Energy metabolism in pregnant sows and newborn pigs. J Anim Sci. 75 (10), 2708-2714 (1997).
  36. Keibl, C., Kerbl, M., Schlimp, C. J. Comparison of Ringer's solution with 0.4% glucose or without in intraoperative infusion regimens for the prevention of hypoglycemia in juvenile pigs. Lab Anim. 48 (2), 170-176 (2014).
  37. Perri, A. M., O'sullivan, T. L., Harding, J. C., Wood, R. D., Friendship, R. M. Hematology and biochemistry reference intervals for Ontario commercial nursing pigs close to the time of weaning. Can Vet J. 58 (4), 371-376 (2017).
  38. Egeli, A. K., Framstad, T., Morberg, H. Clinical biochemistry, haematology and body weight in piglets. Acta Vet Scand. 39 (3), 381-393 (1998).
  39. Linderkamp, O., et al. Blood volume in newborn piglets: Effects of time of natural cord rupture, intra-uterine growth retardation, asphyxia, and prostaglandin-induced prematurity. Pediatr Res. 15 (1), 53-57 (1981).
  40. Talbot, R. B., Swenson, M. J. Blood volume of pigs from birth through 6 weeks of age. Am J Physiol. 218 (4), 1141-1144 (1970).
  41. Berger, D., et al. Effect of PEEP, blood volume, and inspiratory hold maneuvers on venous return. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 311 (3), H794-H806 (2016).

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