Artigo de método

Um modelo de camundongo exclusivo para avaliação quantitativa da formação de biofilme em implantes cirúrgicos em abscesso subcutâneo

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DOI:

10.3791/68067

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6 de junho de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute (OTI), University of California, San Francisco (UCSF), 2Rosies Base, LLC, 3Department of Neurological Surgery, Weill Institute for Neurosciences, Brain and Spinal Injury Center (BASIC), University of California, San Francisco (UCSF)

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um modelo experimental único de infecções relacionadas a implantes que permite a incubação simultânea de dois implantes com bactérias sob condições idênticas em um único camundongo. Também permite uma avaliação precisa da formação de biofilme nas superfícies dos implantes usando métodos analíticos comparativos otimizados, demonstrando técnicas avançadas para avaliar as propriedades antimicrobianas dos biomateriais.

Resumo

Para desenvolver um novo biomaterial com propriedades antibacterianas para procedimentos cirúrgicos ortopédicos, é crucial estabelecer um modelo animal experimental de infecções relacionadas a implantes que mimetize de perto o estado patológico. Além disso, uma comparação quantitativa com amostras de controle é necessária para avaliar a formação de biofilme nos materiais. No entanto, os modelos animais atuais, que envolvem o implante de cada indivíduo com um único material, podem produzir resultados inconsistentes devido à heterogeneidade do estado de infecção entre os indivíduos. Além disso, quantificar com precisão a formação de biofilme em materiais in vivo continua sendo um desafio, e os resultados podem não ser confiáveis. Para resolver esses problemas, este estudo demonstrou um modelo único de infecção relacionada ao implante em camundongos que permite a incubação simultânea de dois implantes com bactérias em um ambiente fechado dentro de um único camundongo, formando um abscesso subcutâneo encapsulado. Uma bolsa de ar madura foi inicialmente criada sob a pele das costas. Dois fios de aço inoxidável foram conectados e colocados na bolsa, seguidos da inoculação de Xen 36, uma cepa bioluminescente de Staphylococcus aureus. Aos 14 dias após a inoculação, um abscesso subcutâneo se formou ao redor dos fios. O biofilme foi completamente removido da superfície de cada fio e as suspensões bacterianas dissolvidas foram medidas com precisão usando métodos otimizados para avaliar a formação de biofilme no implante, determinar unidades formadoras de colônias e realizar análises quantitativas de reação em cadeia da polimerase. Aproveitando o operon lux das bactérias bioluminescentes, os níveis de expressão relativa de luxA e 16S rRNA foram usados para determinar a carga bacteriana dentro do biofilme em cada fio. Essa abordagem analítica comparativa otimizada permite avaliações precisas da formação de biofilme em dois fios sob condições uniformes de infecção em um único modelo de camundongo e pode facilitar o avanço de biomateriais com propriedades antibacterianas.

Introdução

As infecções relacionadas ao implante continuam sendo um desafio significativo em ambientes clínicos, pois podem causar altas taxas de morbidade e mortalidade na cirurgia ortopédica, apesar dos avanços na técnica cirúrgica e no design do implante1. Embora a incidência de infecções associadas a implantes cirúrgicos tenha diminuído significativamente devido aos padrões modernos de controle asséptico no ambiente da sala de cirurgia e protocolos apropriados para profilaxia antibiótica perioperatória, a incidência de infecções relacionadas ao implante na cirurgia primária permanece de 2% a 5%2.

O principal mecanismo subjacente das infecções relacionadas ao implante é a formação de um biofilme nas superfícies do implante, que protege os microrganismos dos antibióticos e do sistema imunológico, dificultando a erradicação da infecção 3,4. Como a adesão bacteriana na superfície do implante é crucial durante o primeiro estágio da formação do biofilme, minimizar a adesão bacteriana e a subsequente formação do biofilme é uma estratégia essencial para reduzir o risco de infecções relacionadas ao implante. Apesar das propriedades antibacterianas de várias tecnologias de implantes, estas não têm sido amplamente utilizadas clinicamente devido a eventos adversos, como toxicidade celular e alergias 5,6,7,8. Portanto, ainda há uma necessidade clínica não atendida de implantes antibacterianos que harmonizem segurança, eficácia, estabilidade e durabilidade para reduzir o risco de infecções relacionadas ao implante. A pesquisa e o desenvolvimento de implantes com propriedades antibacterianas podem avançar a tecnologia cirúrgica para superar esses problemas.

Avaliar as propriedades antibacterianas de vários biomateriais usando modelos de pequenos animais é essencial antes de prosseguir para modelos animais maiores e ensaios clínicos9. Numerosos estudos mostraram modelos de camundongos aplicáveis de infecções relacionadas a implantes usando uma bactéria bioluminescente, que contém o operon luxABCDE 10,11,12,13,14,15. Embora esses modelos acelerem a pesquisa no desenvolvimento de implantes ou tecnologias antibacterianas, eles têm certas limitações. Primeiro, conhecimentos avançados e equipamentos especializados, como raios-X ou sistemas de imagem dedicados, são frequentemente necessários para avaliar a carga bacteriana nos implantes colocados em modelos de camundongos de forma direta e precisa. Em segundo lugar, embora os implantes coletados normalmente avaliem um implante solitário em um único local de infecção por animal, as condições de infecção e as respostas imunológicas podem variar entre os indivíduos, potencialmente levando à variabilidade nos resultados das avaliações comparativas. Portanto, ao comparar os efeitos antibacterianos de vários biomateriais in vivo, implantá-los e inoculá-los com bactérias em ambientes uniformes é mais benéfico para resolver esses problemas. Além disso, é essencial otimizar a metodologia atual e realizar avaliações quantitativas com reprodutibilidade e precisão, explorando as características do modelo animal e das bactérias utilizadas.

Este estudo apresenta uma nova abordagem experimental para infecções relacionadas a implantes in vivo que permite medições precisas para avaliar a formação de biofilme nas superfícies de dois implantes em um único modelo de camundongo por meio de métodos analíticos comparativos inter e intraindividuais. O biofilme em cada implante pode ser quantificado usando métodos otimizados para visualizar o biofilme no implante, determinar as unidades formadoras de colônias (UFC) e análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase (qPCR) de uma cepa bioluminescente de Staphylococcus aureus, Xen 36. O estudo anterior mostrou que um novo implante metálico possui eficácia antibacteriana in vivo promissora contra Staphylococcus aureus usando essa abordagem abrangente16. Essa metodologia pode ser facilmente implementada em um ambiente de laboratório padrão e pode acelerar a pesquisa no desenvolvimento de biomateriais antibacterianos.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia em São Francisco (UCSF) e são realizados em uma instalação BSL2 após consulta e aprovação do Programa de Riscos de Biossegurança da UCSF, administrado pela UCSF Environmental Health and Safety. Foram utilizados camundongos C57BL/6 machos e fêmeas (12-16 semanas de idade, 25-50 mg). Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de bactérias

  1. Use o Staphylococcus aureus Xen36 bioluminescente (ATCC49525) como patógeno.
    NOTA: Esta cepa é obtida da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e utiliza exclusivamente um operon luxABCDE , que é otimizado e integrado ao plasmídeo nativo do hospedeiro. Xen36 também usa o gene de resistência à canamicina ligado ao operon lux .
  2. Adicione uma pequena quantidade de estoque de glicerol congelado de Xen 36 e adicione os pedaços a 5 mL de meio de caldo de soja tríptico (TSB) contendo 200 μg / mL de canamicina.
  3. Incubar a cultura durante a noite a 37 °C numa incubadora agitada (200 rpm).
  4. Risque Xen36 em placas de ágar TSB (TSB em ágar 1,5%) contendo 200 μg / mL de canamicina e incube durante a noite a 37 ° C.
  5. Isolar colônias únicas de Xen36 e cultivar em 5 mL de TSB contendo 200 μg / mL de canamicina durante a noite a 37 ° C em uma incubadora agitada (200 rpm).
  6. Medir a absorvância da cultura resultante a 630 nm.
  7. Diluir a cultura e fazer uma cultura Xen36 de 1,0 x 108 UFC/ml com base na absorvância a 630 nm.
    NOTA: Uma medição de absorbância a 630 nm (contra um branco TSB) de 0,5 é aproximadamente equivalente a 1,0 x 108 UFC/ml de Xen36.
  8. Diluir a cultura e fazer uma cultura Xen36 de 1,0 x 105 UFC/ml.

2. Preparação de implantes conectados

  1. Use dois fios em forma de haste compostos de aço inoxidável de grau cirúrgico (SUS316L) disponível comercialmente, cada um medindo 8 mm de comprimento e 0,5 mm de diâmetro.
  2. Conecte os dois fios verticalmente inserindo-os em ambas as extremidades de uma ponta de pipeta de 20 μL cortada em um comprimento de aproximadamente 3 mm.
    NOTA: Insira os fios conectados verticalmente na ponta da agulha de 18 G (Figura 1). Certifique-se de que os fios estejam firmemente presos pela ponta da pipeta para evitar a desconexão.
  3. Autoclave os fios antes de implantá-los cirurgicamente nos camundongos.

3. Criação de uma bolsa subcutânea madura

NOTA: 7 dias antes da inoculação bacteriana, crie a bolsa de ar da seguinte forma:

  1. Anestesiar o camundongo (C57BL/6) com isoflurano a 2% por inalação (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
    NOTA: Avalie o nível apropriado de anestesia observando a frequência respiratória, tônus muscular, pinça do dedo do pé, reflexo da córnea e cor das membranas mucosas. Use pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
  2. Transfira o camundongo anestesiado para a cama cirúrgica e raspe a região dorsal cervical / torácica do camundongo.
  3. Esfregue e esterilize toda a região com etanol 70% e iodopovidona.
  4. Encha uma seringa de 10 ml com ar estéril e coloque uma agulha de 27 G na saída.
  5. Aperte e eleve suavemente a base do pescoço do mouse para criar espaço entre o tecido subcutâneo e a fáscia.
  6. Coloque a agulha na linha média entre as escápulas do camundongo e injete 3 mL de ar estéril por via subcutânea para criar a bolsa de ar (Figura 2).
    NOTA: Ao injetar ar, segure os dois lados das costas com a mão oposta para garantir que o ar se espalhe para o centro das costas, criando uma bolsa no meio.
  7. Retorne o mouse a uma gaiola aquecida com uma almofada térmica e monitore-o de perto até que ele se recupere da anestesia.
  8. Injete 3 mL de ar estéril conforme descrito acima para manter a inflação da cavidade e criar uma bolsa madura a cada 2 dias.
    NOTA: Antes de cada inflação, aspire o ar da bolsa para confirmar o posicionamento adequado da ponta da agulha. Remova cuidadosamente a seringa da agulha, deixando a ponta da agulha na bolsa. Volte a inflar a bolsa com 3 mL de ar estéril.

4. Implantação de fios conectados e inoculação bacteriana

  1. 7 dias após a primeira injeção de ar, anestesiar o rato conforme descrito no passo 3.1.
    NOTA: Durante o procedimento cirúrgico, verifique constantemente se o mouse está respirando e anestesiado. Todo o procedimento cirúrgico geralmente leva de 10 a 15 minutos quando realizado por um cirurgião treinado. A anestesia é mantida com a colocação de um tubo que fornece isoflurano a 2% misturado com oxigênio adjacente ao focinho do camundongo.
  2. Esfregue e esterilize toda a região com etanol 70% e iodopovidona.
  3. Injete bupivacaína por via subcutânea imediatamente antes da cirurgia.
  4. Faça uma incisão longitudinal na linha média de 3 mm na parte superior da bolsa.
  5. Insira uma agulha de 18 G contendo os fios conectados na bolsa através do orifício e empurre os fios para fora usando uma seringa interna de uma agulha espinhal de 25 G (Figura 3A, B).
  6. Deixando a ponta da agulha de 18 G dentro da bolsa, remova suavemente o cilindro interno e injete 3 mL de cultura de Xen36 1,0 x10 5 UFC/mL usando a seringa (Figura 3C,D).
  7. Remova cuidadosamente todas as agulhas, feche a pele usando um clipe de ferida e sele com adesivo tópico para a pele (Figura 3E, F).
  8. Certifique-se de que não haja vazamento, retorne o mouse para a gaiola individual aquecida com uma almofada térmica e monitore como antes.

5. Extração dos implantes do abscesso subcutâneo

  1. Após a eutanásia por overdose de isofluorano, raspe a região dorsal cervical, torácica e lombar do camundongo e esfregue e esterilize toda a região com etanol a 70% e iodopovidona (Figura 4A).
    NOTA: A eutanásia foi conduzida de acordo com as Diretrizes da American Veterinary Medical Association (AVMA) para a Eutanásia de Animais.
  2. Faça uma incisão na linha média de 2 cm na região lombar e esfolie cuidadosamente o tecido subcutâneo usando uma tesoura.
  3. Estenda a incisão e a dissecção subcutânea proximalmente e separe o tecido aderente ao redor do abscesso (Figura 4B - D).
  4. Extirpar todo o abscesso subcutâneo (Figura 4E).
  5. Corte o abscesso e extraia cuidadosamente o fio de dentro do abscesso (Figura 4F).

6. Quantificação do biofilme formado nas superfícies do implante

  1. Ensaio de cristal violeta
    1. Coloque os fios extraídos do abscesso em poços individuais de uma placa de 24 poços contendo 1 mL de água deionizada (DI).
    2. Transfira os fios para novos poços contendo 1 mL de água DI para remover qualquer bactéria frouxamente aderente da superfície dos fios.
    3. Fixe o biofilme nos fios com etanol 100% por 1 min e deixe secar.
    4. Transfira os fios para novos poços contendo 1 mL de reagente violeta cristalino a 0,1%.
    5. Após 15 min de coloração, lave suavemente os fios duas vezes com água DI para remover o excesso de corante.
    6. Coloque o implante em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 250 μL de ácido acético a 33% por 15 min; Solubilizar o cristal violeta aderente ao biofilme sobre o implante, seguido de vórtice por 1 min.
    7. Transferir 200 μL da suspensão para uma placa de 96 poços e medir a absorvância a630 nm de diâmetro externo utilizando um leitor de microplacas. Todas as medições são realizadas em triplicado.
  2. Contagem de unidades formadoras de colônias (UFC)
    1. Remova qualquer bactéria frouxamente aderente da superfície dos fios, conforme descrito na etapa 6.1.2.
    2. Coloque o implante em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 200 μL de tripsina 10x e incube a 37 ° C por 1 h.
    3. Vórtice por 1 min e sonicar em banho-maria a 100 W por 5 min, seguido de vórtice adicional por 30 s para destacar o biofilme na suspensão.
    4. Inocular 10 μL da suspensão diluída em série nas placas de ágar TSB (TSB em ágar 1,5%) com 200 μg / mL de canamicina.
      NOTA: Execute este procedimento em triplicado para cada solução.
    5. Depois de incubar as placas a 37 °C durante 24 h, contar as colónias nas placas e calcular o número de células bacterianas na cultura de origem utilizando a contagem média de colónias17.
      NOTA: Para garantir que todas as bactérias sejam removidas dos fios, o que é crucial para uma medição precisa, manche os fios com cristal violeta e observe-os após aplicar a suspensão nas placas. Nos experimentos preliminares, a combinação da dissociação mecânica e química acima removeu com sucesso todos os biofilmes Xen36 das superfícies do fio de aço inoxidável convencional (Figura 5).
  3. Análise quantitativa de reação em cadeia da polimerase (qPCR)
    1. Remova qualquer bactéria frouxamente aderente da superfície dos fios, conforme descrito na etapa 6.1.2.
    2. Coloque o implante em um microtubo de 1,5 mL contendo 600 μL de TSB.
    3. Extrair ADN utilizando o sistema de lise alcalina modificado sem sedimentos16.
      NOTA: O volume final do DNA eluído é de 20 μL.
    4. Diluir o ADN 1:10 e conservá-lo a -20 °C.
    5. Realize qPCR para os genes luxA e 16S rRNA 16.
      NOTA: Todas as reações de qPCR são realizadas em triplicata. O volume total da mistura de reação é de 10 μL, contendo 3 μL de molde de DNA, 5 μl de SYBR Green, 1 μL de água livre de nuclease e 0,5 μL de cada primer. Os primers para o gene luxA são 5'- GAGCATCATTTCACGGAGTTTG -3' e 5'- ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'. Os primers para o gene 16S rRNA são 5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT - 3' e 5'- CACTGGTGTTCCTCCATATCTC - 3'. As condições de PCR são as seguintes: desnaturação inicial por 2 min a 94 ° C, seguida por 40 ciclos de 15 s a 94 ° C, 30 s a 60 ° C e 30 s a 72 ° C e uma extensão final a 72 ° C por 5 min.
    6. Plotar a média dos valores de limiar de três ciclos (Ct) é plotada em relação a uma curva de calibração gerada com DNA purificado diretamente de culturas de Xen36 puro diluídas em série para estimar a carga bacteriana no implante (Figura 6).

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Resultados

Este estudo avaliou a confiabilidade de uma abordagem abrangente usando um novo modelo de camundongo de infecção relacionada ao implante com avaliações quantitativas otimizadas da formação de biofilme nas superfícies dos implantes, que foi usado no estudo anterior16. Os dois implantes idênticos foram utilizados para examinar o biofilme formado em suas superfícies, com o objetivo de verificar se ambos os implantes poderiam ser incubados simultaneamente em condições ...

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Discussão

Este estudo demonstrou uma abordagem abrangente para avaliações quantitativas precisas da formação de biofilme em múltiplos implantes, aproveitando um novo modelo de camundongo e técnicas de análise otimizadas para infecção relacionada ao implante. Para garantir que dois implantes fossem incubados sob condições de infecção idênticas no mesmo sujeito, uma bolsa subcutânea madura foi criada dentro de um único camundongo por meio de repetidas injeções de ar. Este modelo forneceu um ambiente...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi parcialmente financiada por um Programa de Pesquisa Cooperativa da Indústria / Universidade da NSF chamado Centro de Inovações Musculoesqueléticas Disruptivas (IIP-1916629), Komatsuseiki Kosakusho Co., Ltd. e Rosies Base, LLC.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido acéticoTHOMAS CIENTÍFICO12-16-15-00
Leitor de Absorbância Agilent BioTek 800 TSAgilentBT800TS
Agulhas hipodérmicas estéreis Air-Tite, calibre da agulha: 18 gFISHER CIENTÍFICO14817151 (CS)
Agulhas espinhais BD: 25 gFISHER CIENTÍFICO22043805
Agitador de incubadora de bancadaFISHER CIENTÍFICO
Banho Ultrassônico Branson, 115 Vac, 60 HzFISHER CIENTÍFICO2489500
Ultrassom Branson 2510R-MTH (Sonicador)Rolamento RPI-T48500-500.0
Centrífuga sorvall picoFISHER CIENTÍFICO
Sistema qPCR do módulo do sistema ótico do tempo real CFX96BIO-RAD
Esterilizador compacto, 30LTHOMAS SCIENTIFIC LLC22A00N096 (EA/1)
Cristal Violeta, 1%, Solução SCI_EDFISHER CIENTÍFICO10114-58-6
Placa de cultura de células Falcon de 24 poçosFISHER CIENTÍFICO877125
Placa de cultura de células Falcon de 96 poçosFISHER CIENTÍFICO8771001
Mixer de vórtice digital FisherbrandCIENTISTAS DE FISHER
CanamicinaTHOMAS SCIENTIFIC LLC 15160054
Ágar Sal Manitol 
FISHER SCIENTIFIC 
Incubadora MicirobiológicaThermo CientíficoRolamento 51028063H
PBS, solução salina tamponada com fosfato
Staphylococcus aureus ATCC 49525 (Xen36)Perkin Elmer119243
SYBR Green I Mancha de Gel de Ácido NucleicoFISHER CIENTÍFICO
Tripsina 10x (2,5%)FISHER CIENTÍFICO15090046
Caldo de Soja TrípticoNETA SCIENTIFIC INC 
Zyppy Plasmídeo Miniprep KiFISHER CIENTÍFICO501977785Sistema de lise alcalina modificado sem pellets

Referências

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