A imagem in vivo das articulações é uma técnica valiosa para descobrir o comportamento migratório dos leucócitos e a dinâmica molecular dentro das articulações inflamadas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para imagens in vivo das articulações usando um modelo murino da artrite induzida por colágeno tipo II (CIA).
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Artigo de método
In vivo Imagens revelam o comportamento migratório dos leucócitos dentro das articulações
Neste artigo
Resumo
Resumo
Leucócitos são células transmitidas pelo sangue derivadas da medula óssea que precisam migrar para os tecidos para mediar a inflamação. Controlar essa migração, portanto, representa um ponto crítico para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para atenuar a inflamação. Estudos tradicionais de endpoint não nos permitiram dissecar completamente o comportamento migratório dos leucócitos in vivo. No entanto, avanços recentes na tecnologia de imagem forneceram insights sem precedentes sobre a migração de células imunes em animais vivos, ampliando muito nossa compreensão da regulação molecular do tráfico celular imunológico.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para imagens in vivo das articulações usando um modelo murino de artrite induzida por colágeno tipo II (CIA). Os camundongos são imunizados com colágeno tipo II emulsionado no adjuvante de Freund completo, e a progressão da artrite é monitorada por meio de pontuação clínica e medições da espessura das patas. No auge da artrite, os leucócitos são visualizados in vivo usando microscopia confocal em camundongos transgênicos que expressam proteínas fluorescentes ou em camundongos do tipo selvagem após injeção intravenosa de anticorpos marcados fluorescente e Dextrano de alto peso molecular para coloração vascular. A exposição cirúrgica cuidadosa da articulação, a aplicação de agarose e o posicionamento correto da perna permitem uma imagem estável a longo prazo, normalmente com duração de várias horas. Essa abordagem permite a análise em tempo real da parada de leucócitos, rastejamento e migração transendotelial dentro de articulações inflamadas.
Esse protocolo será valioso para grupos de pesquisa que investigam o tráfico de leucócitos na artrite e outras doenças inflamatórias. Também pode servir como plataforma para avaliação pré-clínica de terapias direcionadas à migração de células imunes.
Introdução
Como os leucócitos são células transmitidas pelo sangue derivadas da medula óssea, eles precisam entrar no tecido para causarinflamação 1. O controle desse processo representa um ponto-chave em que novas terapias podem ser desenvolvidas para atenuar ainflamação 2. Em geral, o tráfego de leucócitos para tecido inflamado ocorre em vênulas pós-capilares e segue a cascata de adesão, começando com a captura de leucócitos em fluxo livre pela parede do vaso. Além disso, o processo é seguido por leucócitos rolando ao longo da parede do vaso na direção do fluxo, parada dos leucócitos no endotélio, liberação da adesão e rastejamento em todas as direções na superfície do vaso para localizar um local receptivo para migração transendotelial (TEM) em um local específico dentro do tecido 1,3.
Esses passos distintos são regulados por uma combinação de sinais moleculares, incluindo as selectinas (para rolamento), integrinas (para parada, rastejamento) e quimioatrativos (CAs) (para parada, possivelmente rastejando e TEM)3. As CAs ativam leucócitos por meio de sete receptores quimioatrativos acoplados à proteína G transmembrana (CARs), e desempenham papéis críticos na cascata de aderências ao aumentar a afinidade da integrina (levando à parada) e induzir o TEM. No entanto, os mecanismos exatos da TEM não são totalmente compreendidos. Estudos tradicionais de endpoint e experimentos in vitro não forneceram insights sobre como a sinalização CA-CAR regula dinamicamente o comportamento migratório de leucócitos in vivo.
Avanços recentes na tecnologia de imagem proporcionaram visões sem precedentes sobre a migração das células imunes em animais vivos, ampliando muito nossa compreensão da regulação molecular do tráfico celular imune in vivo 4,5,6.Por exemplo, essa tecnologia elucidou o controle molecular do tráfego de neutrófilos para locais de inflamação tecidual, como lesão hepáticatérmica 7 e lesão cutâneaa laser 8. Portanto, solicitamos a investigação dos mecanismos moleculares que controlam o tráfego de neutrófilos para locais de inflamaçãoarticular 9. A imagem articular in vivo descrita aqui revelou que o receptor C5a 1 (C5aR1) do componente do complemento é crucial para iniciar a adesão dos neutrófilos ao endotélio articular, provocando inflamação nas articulações. C5aR1 facilitou a parada e disseminação de neutrófilos dependentes de integrina, seguida por TEM mediada pelo receptor leucotrieno B4, e um rastejamento impulsionado pelo receptor de quimiocina CC 1 (CCR1). O receptor de quimioquina CXC 2 (CXCR2) desempenhou um papel nos estágios finais do TEM neutrófilo nas articulaçõesinflamadas 10. Além disso, a imagem articular in vivo revelou um novo paradigma nas reações de hipersensibilidade tipo III dentro da articulação, onde o C5a atua como iniciador da inflamação, enquanto as células residentes no tecido desempenham papéis mais significativos na inflamação no paradigma atual das reações de hipersensibilidade tipoIII 10,11.
Além disso, aplicamos imagens in vivo da articulação para estudar a dinâmica molecular do C5a dentro da articulação. C5a carregado no tecido articular em camundongos selvagens foi rapidamente transportado para o lúmen vascular, enquanto em camundongos deficientes em C5aR2, C5a permaneceu inteiramente dentro do tecidosinovial 12. Esses dados demonstram que o C5aR2, expresso no endotélio articular, transporta o C5a para o lúmen do vaso, um processo necessário para a adesão dos neutrófilos dependentes de C5aR1 nasarticulações 13.
A imagem in vivo das articulações é aplicável a todos os modelos de artrite inflamatória e permite observação a longo prazo (geralmente algumas horas), embora a visualização do tecido profundo (>1 mm) possa ser limitada dependendo do microscópio utilizado. Em conjunto, essa técnica fornece uma ferramenta poderosa para investigar o comportamento migratório dos leucócitos e a dinâmica molecular dentro das articulações inflamadas. Estamos compartilhando este protocolo para imagem articular in vivo para apoiar grupos de pesquisa que estudam esse processo em articulações inflamadas.
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Faculdade de Medicina da Universidade St. Marianna (Aprovação nº TG240926-2 e TG250801-2) e conduzidas de acordo com diretrizes institucionais e nacionais.
1. Preparação de modelo de camundongo para artrite
NOTA: Modelos animais de artrite forneceram ferramentas valiosas para entender a patogênese da doença e para o desenvolvimento de novasterapias 14. Embora vários modelos de artrite em camundongos tenham vantagens e limitações únicas, a artrite induzida por colágeno tipo II (CIA) tem sido amplamente utilizada em estudos sobre a patogênese da artrite reumatoide (AR)14. Nesta seção, descrevemos o protocolo dos modelos da CIA para artrite (suprimentos e instrumentos são mostrados na Figura 1).
- Prepare uma diluição de colágeno bovino tipo II em 0,05 M ácido acético (concentração final 4 mg/mL) agitando durante a noite a 4 °C.
- Para criar a emulsão, misture a diluição de colágeno (4 mg/mL em 0,05 M ácido acético) com o adjuvante de Freund completo (CFA) em uma proporção 1:1 em uma seringa de vidro. Isso resulta em uma concentração final de colágeno de 2 mg/mL na emulsão. Misture vigorosamente à mão por aproximadamente 20 minutos. Esse processo gera calor, então resfrie a seringa de vidro contendo a emulsão sobre gelo. Use um béquer para verificar a consistência da emulsão durante a preparação.
NOTA. Armazene qualquer diluição restante de colágeno a -80 °C. Isso pode ser usado para a segunda imunização. - Transfira a emulsão para uma seringa de vidro de 1 mL equipada com uma agulha de 26 x 1/2 G, e mantenha-a no gelo até a imunização.
- Anestesiar camundongos DBA1/J de 8 semanas (macho ou mulher) com injeções intraperitoneais de medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) e vetorphale (5 mg/kg).
NOTA. Os camundongos transgênicos frequentemente possuem um fundo C57BL6. O colágeno de galinha é tipicamente usado para CIA em camundongos C57BL6; no entanto, a incidência e a gravidade da CIA em camundongos C57BL6 são menores do que em camundongos DBA/1J. Se estiver usando camundongos transgênicos com fundo C57BL6, considere realizar um estudo piloto para avaliar a incidência e a gravidade da CIA. - Raspe os pelos ao redor do rabo usando um aparador para preparar a imunização.
- Injete lentamente 100 μL de volume da emulsão (contendo 200 μg de colágeno) no espaço subcutâneo ao longo do dorso caudal (próximo à base da cauda) (Figura 2).
- Repita os passos de 1,2 a 1,6 no dia 21 para a segunda imunização (Figura 2).
2. Avaliação da pontuação clínica de artrite e medição da espessura das patas
NOTA: A pontuação clínica da artrite e a medição da espessura das patas são essenciais para avaliar a atividade da doença. Normalmente, a avaliação clínica da artrite e as medições da espessura das patas são feitas a cada 1 a 3 dias após a primeira imunização.
- Pontuação clínica da artrite: Registre a soma das pontuações das quatro patas de cada rato. Use o seguinte sistema de pontuação:
0 = Normal
1 = Eritema e inchaço de um dedo
2 = Eritema e inchaço de dois dígitos ou eritema e inchaço da articulação do tornozelo
3 = Eritema e inchaço de mais de três dedos ou inchaço de dois dedos e tornozelo
4 = Eritema e inchaço severo do tornozelo, pé e dedos com deformidade.
NOTA. Uma articulação do tornozelo inchada é definida como uma espessura da pata maior que 4 mm. - Medição da espessura da pata: Meça a espessura de cada pata usando pinças digitais de deslizamento. Use a espessura média das patas em todas as quatro patas de cada rato.
3. Imagem in vivo das articulações
NOTA: Imagens in vivo das articulações nos permitem observar a migração de leucócitos para dentro das articulações e analisar seu comportamento dentro do tecido em camundongos vivos. Para visualizar células, são usados camundongos transgênicos geneticamente modificados para expressar proteínas fluorescentes em células específicas, assim como camundongos injetados intravenosamente com anticorpos marcadores anticelulares. Os suprimentos usados são mostrados na Figura 3.
- Anestesiar camundongos artritônicos intraperitonealmente com medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) e vetorphale (5 mg/kg).
- Raspe a perna do rato com uma máquina de cortar e use creme depilatória (<60 s) para remover qualquer pelo restante. Evite aplicação prolongada para evitar irritação na pele.
- Remova o creme com gaze úmida (Figura 4A). Certifique-se de remover todos os pelos para evitar autofluorescência indesejada na área de imagem. Repita se necessário.
- Aplicar lubrificante corneano estéril em ambos os olhos durante a anestesia para evitar dessecação ou ulceração corneana.
- Sob um endoscópio cirúrgico, faça uma incisão de 1 cm ao longo da pele usando microtesoura (Figura 4B).
NOTA. Essa etapa é fundamental. A cirurgia pode desencadear o recrutamento de leucócitos (especialmente neutrófilos). Evite qualquer dano que possa causar artefatos. Devido à angiogênese nas articulações artríticas, essas articulações são propensas a sangramento. Múltiplas sessões de prática podem ser necessárias para o sucesso da cirurgia. - Posicione as articulações artríticas na placa plástica (Figura 4C).
NOTA. O adesivo de tecido pode ser usado para ajudar a fixar a perna do rato no lugar. Este estudo utiliza argila para fixar uma lâmina de vidro em uma placa plástica. - Cubra a área de imagem com aproximadamente 1 mL de agarose 1,5% com soro salino tamponado com fosfato (PBS) (Figura 4D).
NOTA. Certifique-se de que a agarose tenha resfriado para evitar lesões tecidulares, que podem promover o recrutamento de leucócitos para a área de imagem. - Prepare o palco no microscópio.
NOTA. Use uma almofada térmica para manter a temperatura corporal do rato durante sessões prolongadas de imagem. - Ajuste as configurações do microscópio confocal (potência do laser, ganho, deslocamento, localização, etc). Aqui, realize imagens em um microscópio confocal com uma lente objetiva de imersão em água 25, NA 1.1. Ajuste a excitação do laser para 488 nm, 561 nm e 640 nm, e colete a emissão em 488,0 nm, 561,6 nm e 638,5 nm.
- Verifique a taxa de varredura do microscópio. Use uma resolução de pixels de 512 x 512, com 5 seções ópticas, uma pilha Z de 4 μm e um tempo de ciclo de 15 s para permitir a análise de células móveis individuais ao longo do tempo suficiente para obter dados significativos.
- Uma vez identificada uma localização adequada, inicie a aquisição da imagem.
NOTA. Se estiver usando anticorpos marcadores anticelulares para marcar leucócitos, injete os anticorpos por via intravenosa 3 minutos antes do início das imagens. Para visualização de vasos sanguíneos, injete Qdots, anticorpos CD31 ou Dextrano simultaneamente. Por exemplo, injetar aproximadamente 2 μg de anticorpos por camundongo de Ly6G para neutrófilos e CD4 para células T, junto com aproximadamente 80 μg de 680-250k Dextrano por camundongo para coloração dos vasos sanguíneos. Anticorpos e Dextrano geralmente são dissolvidos em 100 μL de PBS estéril. Esteja ciente de que alguns anticorpos podem esgotar os leucócitos, então verifique se os anticorpos selecionados não reduzem a contagem de leucócitos. - Processe as imagens do arquivo ND2 adquiridas com o microscópio confocal usando o módulo General Analysis 3 (GA3) do software de análise de imagens NIS-Elements (versão 6.20.00). Realize a extração das regiões vasculares e a subtração de fundo. Após o processamento de todos os períodos de tempo, exporte as imagens como vídeo.
NOTA. Como parte da análise, conte o número de células aderentes e extravasadas. - Após a conclusão da imagem de imagem, permita que o animal se recupere como procedimento de sobrevivência ou o eutanasia de forma humana, dependendo do desenho experimental. Se houver a intenção de sobrevivência, feche suavemente o local cirúrgico e ofereça o cuidado pós-operatório adequado de acordo com as diretrizes institucionais de cuidado animal.
NOTA: Neste estudo, todos os animais foram eutanasiados humanamente imediatamente após a imagem, em conformidade com as diretrizes institucionais e nacionais.
4. Análise estatística
- Apresente os dados como média ± erro padrão da média (SEM). Realize análise estatística usando o teste t de Student para comparações entre dois grupos ou ANOVA unidirecional para múltiplos grupos, seguida pelo teste post hoc de Tukey. Considere um valor-p < 0,05 como estatisticamente significativo.
NOTA: Toda a análise foi realizada usando o GraphPad Prism versão 10.
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Resultados
Aqui, camundongos machos DBA/1J de 8 semanas são imunizados com uma emulsão contendo colágeno bovino tipo II e CFA em proporção 1:1 no dia 0 e no dia 21. A pontuação clínica da artrite e as medições da espessura das patas são realizadas a cada 1 a 3 dias entre o dia 0 e o 42. Normalmente, o início da artrite é observado por volta do dia 28, com o escore clínico da artrite e a espessura das patas atingindo o pico por volta do dia 35 (Figura 5A-C
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Discussão
A imagem in vivo das articulações, ao contrário dos estudos tradicionais de endpoint, oferece insights sem precedentes sobre processos biológicos dinâmicos em camundongos vivos. Por exemplo, essa técnica nos permite entender como quatro diferentes receptores quimioatrativos - C5aR1, BLT1, CCR1 e CXCR2 - colaboram para iniciar o recrutamento de neutrófilos em articulações inflamadas na artrite10,11. Além disso, a imagem <...
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Divulgações
Y.M. recebeu apoio/bolsa da Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
Agradecimentos
O trabalho da Y.M. é apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) KAKENHI [bolsa número JP22K08531, JP25K02574]; Agência Japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED) [Número de Bolsa 25bm1423033]; a Fundação Memorial Mochida para Pesquisa Médica e Farmacêutica; A Bolsa JCR para Promoção da Pesquisa para a FRONTIER e a Fundação Mitsubishi.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 29 G x 1/2" | Terumo | SS-10M2913 | |
| 0,1 M ácido acético | Fujifilm | 016-18835 | |
| Seringa plástica de 1 mL | INÍCIO | 19531 | |
| Seringa de 1 mm para graxa | Terumo | SS-01T | |
| 18 G x 1 1/2" | Terumo | NN-1838R | |
| 26 G x 1/2" | Terumo | NN-2613S | |
| 680-250 kDa dextrano | Biotium | 80135 | |
| Agarose | invitrogen | 16520-100 | |
| Colágeno tipo II bovino | Centro de Pesquisa de Colágeno | K42 | |
| Argila | Debika | 93186 | |
| Completamente freund' s adjuvante (CFA) | Chondrex | 7001 | |
| Microscópio confocal | Nikon | A1 | |
| Vidro de cobertura | Matsunami Glass IND., Ltd | C024401 | |
| Pinça digital do ferrolho | Mitsutoyo | 500-180-30 | |
| Tubo Falcon (15 mL) | Corning | NA | |
| Tubo Falcon (50 mL) | Corning | NA | |
| Anticorpo anti-camundongo conjugado com FITC | Biolenda | 127606 | |
| Pinças | Roboz | RS-5070 | |
| Pinças | NAPOX | MA-48-2 | |
| Seringa e conector de vidro | Tsubasa Industry Co., Ltd | S7P | |
| Graxa | Toray Dow Corning Silicone | NA | |
| Aparador de cabelo | Wahl | WA5109 | |
| Aparador de cabelo | Wahl | 9966 | |
| Depilação crè Eu | Kracie | N/A | |
| Medetomidina | Meiji | N/A | |
| Microtesoura | Roboz | RS-5610 | |
| Microtesoura | Roboz | RS-5630 | |
| Midazolam | Sandoz | N/A | |
| Gaze úmida | Nippon Paper Crecia Co., Ltd | S-200 | |
| Análise de imagens NIS-Elements 6.20.00 | Nikon | NA | |
| PBS em tubo Falcon (50 mL) | Shimadzu Diagnostics Corporation | 5913 | |
| Anticorpo anti-camundongo conjugado com PE | Biolenda | 100408 | |
| Placa plástica | Corning | 351029 | |
| Prisma 10.3.1 | GraphPad | NA | |
| Vidro deslizante | Muto Pure Chemicals Co., Ltd | 5115 | |
| Escopo cirúrgico | Olympus | VMZ | |
| Ligação tecidular | 3M | 1469SB | |
| Vetorphale | Meiji | N/A |
Referências
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Reimpressões e permissões
