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Artigo de método

Desenvolvimento de um modelo pré-clínico de inalação para testar destilados de cannabis vaporizados

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DOI:

10.3791/68094

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30 de maio de 2025

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1Meakins-Christie Laboratories, 2Translational Research in Respiratory Diseases Program at the Research Institute of the McGill University Health Centre, McGill University, 3Department of Pathology, McGill University, 4Department of Bioresource Engineering, McGill University, 5Department of Medicine, McGill University, 6Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University

Neste artigo

Resumo

Os cartuchos vape destilados de cannabis são dispositivos alimentados por bateria que aerossolizam extratos contendo altas concentrações de canabinóides. A ausência de modelos pré-clínicos estabelecidos para esses produtos cria desafios no estudo de seus efeitos fisiológicos. Para resolver essa lacuna, foi desenvolvido um modelo murino de inalação pré-clínico padronizado para destilados de cannabis vaporizados.

Resumo

Apesar de sua crescente popularidade, os produtos vape de cannabis permanecem pouco estudados. Os cartuchos vape de cannabis são usados com dispositivos alimentados por bateria que aerossolizam extratos de flores de cannabis contendo altas concentrações de canabinóides, como o THC. Esses tipos de produtos são comumente conhecidos como destilados de cannabis. A potência desses produtos apresenta desafios no estabelecimento de uma dosagem eficaz para estudos pré-clínicos. Atualmente, não existem modelos pré-clínicos estabelecidos e padronizados para testar a segurança e a eficácia desses produtos de maneira análoga aos padrões de uso humano. Assim, o regime de exposição ao destilado de cannabis in vivo necessário para atingir doses fisiologicamente relevantes em comparação com o que é alcançado em humanos permanece indeterminado. Para resolver essa lacuna, um modelo murino pré-clínico padronizado para inalação de destilados de cannabis vaporizados foi desenvolvido usando um sistema de entrega controlado por computador. Este protocolo detalha os procedimentos para administrar destilados de vape de cannabis usando uma topografia regimentada a camundongos por uma torre de exposição apenas de nariz. Métodos para monitorar os resultados comportamentais do camundongo pós-exposição e a utilização de um ELISA semiquantitativo para confirmar a entrega de THC na circulação sistêmica também são fornecidos. Este protocolo permitirá a investigação das respostas pulmonares e sistêmicas aos produtos destilados de cannabis por pesquisadores interessados em explorar o impacto do vaping de cannabis usando protocolos de entrega do mundo real, proporcionando assim uma oportunidade para uma rigorosa avaliação terapêutica e de segurança.

Introdução

Com a legalização da cannabis ocorrendo em todo o mundo, o uso de cannabis está aumentando. Mudanças significativas no mercado de varejo de cannabis não estão apenas aumentando a acessibilidade, mas também estão impulsionando o desenvolvimento e a produção de novos tipos de produtos de cannabis para consumo1. Os vaporizadores, que aquecem os produtos de cannabis sem combustão, estão se tornando um método de consumo cada vez mais popular 2,3. Os vaporizadores incluem cartuchos de vape de cannabis que utilizam a tecnologia de cigarro eletrônico para aquecer e aerossolizar destilados de cannabis. Esses destilados são extraídos da flor de Cannabis sativa para produzir um líquido viscoso com altas concentrações de canabinóides, como o Δ 9-tetrahidrocanabinol (THC), o principal componente psicoativo da cannabis4. Esses dispositivos são fáceis de usar e ocultar, tornando-os atraentes para usuários iniciantes5. No Canadá, onde a cannabis foi legalizada para fins recreativos em 2018, os dados da pesquisa obtidos mostram um aumento na aceitabilidade social percebida da cannabis vaping, bem como aumentos significativos no uso de caneta/cartucho vape de cannabis6.

Os consumidores de cannabis podem acreditar que vaporizar destilados de cannabis é mais seguro do que fumar a flor seca na forma de um baseado, contribuindo para sua crescente popularidade2. Apesar da possível redução na exposição a produtos de combustão inalada ao usar destilados vape de cannabis, esses produtos podem não ser isentos de riscos. Uma preocupação é a exposição a altas doses de canabinóides presentes em cartuchos de vape comerciais. A flor de cannabis seca pode ser comprada com até 36% de THC, enquanto a concentração de THC em cartuchos de destilado de cannabis pode chegar a 96%7. Os aerossóis dos cartuchos de destilado de cannabis contêm aproximadamente o dobro das concentrações de THC em comparação com a fumaça de cannabis 8,9. Ainda não se sabe quais efeitos essas concentrações elevadas de THC têm no trato respiratório. Além disso, as altas concentrações de THC oferecem desafios no estabelecimento de uma dosagem eficaz para estudos murinos pré-clínicos, pois a exposição excessiva ao THC em si pode ter efeitos adversos em camundongos10. É essencial começar com níveis mínimos de exposição e aumentar gradualmente até que doses fisiologicamente relevantes sejam alcançadas para garantir que essas exposições sejam relevantes.

Até o momento, não há estudos examinando os efeitos potenciais dos destilados de cannabis vaporizados inalados. Isso se deve, em parte, à falta de modelos pré-clínicos padronizados existentes. Os desafios de pesquisa são agravados em regiões onde esses produtos permanecem ilegais, levando os pesquisadores a produzir destilados internos que podem não refletir com precisão os produtos comerciais11. Além disso, a ampla gama de produtos disponíveis complica a padronização. Para preencher essa lacuna, este estudo foi iniciado usando produtos legais e comercialmente disponíveis acessíveis aos consumidores canadenses. Os produtos e dispositivos listados como mais vendidos na Ontario Cannabis Store foram selecionados para uso. O objetivo deste protocolo é estabelecer um regime de exposição murina fácil de usar que forneça doses de THC comparáveis aos níveis humanos fisiologicamente relevantes, criando uma base para os pesquisadores realizarem estudos adicionais sobre os efeitos respiratórios e sistêmicos dos destilados de cannabis vaporizados.

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Protocolo

Os procedimentos abaixo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais da Universidade McGill (Protocolo Número 8087) de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC).

1. Preparação do equipamento

NOTA: O protocolo a seguir se aplica ao sistema SCIREQ inExpose suportado pelo software flexiWare 8.

  1. Garanta a montagem correta de todos os componentes do sistema para se parecer com o example mostrado na Figura 1A. Certifique-se de que haja um tubo fechado inserido na câmara tampão da bomba de sopro para evitar vazamento do sistema, conforme mostrado na Figura 1B.
  2. Ligue o sistema e inicie o software. Selecione o módulo Sessões de Experimentação .
  3. Selecione Novo estudo e defina os grupos experimentais e os sujeitos a serem estudados. Selecione o modelo experimental que corresponde ao regime de exposição desejado.
  4. Na janela Propriedades da sessão, preencha a seção Operador para rastrear o uso do equipamento.
  5. Para realizar a calibração, selecione o canal desejado e siga as etapas descritas no software operacional.
  6. (Etapa crítica) Para realizar o teste de fluxo do sistema, selecione a bomba desejada e siga as etapas descritas no software operacional. Verifique se o fluxo do sistema está direcionado para o rotâmetro. Esta calibração é para garantir que não haja vazamento no sistema. Se o sistema não passar no teste de fluxo, limpe os componentes e a tubulação antes de tentar novamente o teste.
  7. Cancele os prompts para iniciar a gravação de dados, a menos que esteja pronto para iniciar o experimento.

2. Criação de perfis Puff

  1. Crie um perfil de fluxo de polarização de 2 L/min para garantir a aeração adequada dos sujeitos durante todo o experimento. Para fazer isso, consulte a Technote 037: Um guia para criar perfis em um documento externo disponível no fabricante.
  2. Crie um puff para perfis de cigarro eletrônico. Para fazer isso, consulte a Technote 037. No protocolo aqui descrito, a nota técnica foi modificada para fornecer um volume de sopro de 78 mL, com duração de sopro de 2,4 s e 1, 2 ou 4 sopros / min, conforme publicado anteriormente 12,13,14,15,16,17.

3. Preparação do animal

  1. Use camundongos C57BL/6 machos e fêmeas, com idade entre 10 e 12 semanas e pesando aproximadamente 20 a 30 g para este protocolo. Aclimate os ratos ao sistema gradualmente ao longo de 3 dias.
    1. Comece a aclimatação com a colocação dos camundongos dentro da contenção macia e, em seguida, inicie o fluxo de polarização a 2 L / min com ar ambiente durante um período que corresponda à duração de sua exposição experimental. Use um período de aclimatação de 10 min, 20 min ou 30 min para corresponder às exposições experimentais descritas aqui. Essas medidas foram tomadas para minimizar quaisquer impactos induzidos pelo estresse nos resultados de interesse.
    2. Para colocar os animais em restrições suaves, retraia totalmente o componente de malha, segure toda a restrição na frente do animal e espere que o animal se mova para o componente do êmbolo.
    3. Verifique se o nariz do animal está visível no componente do êmbolo da contenção e, em seguida, prenda um clipe de fichário logo atrás do animal para evitar qualquer movimento para fora da contenção.
      NOTA: Animais mais jovens e menores podem manobrar mais facilmente dentro da contenção, por isso é essencial verificar se o nariz permanece visível fora do componente do êmbolo.
  2. Ao trabalhar com camundongos de diferentes sexos ou genótipos, considere o uso de clipes de fichário codificados por cores para distinguir entre os animais.

4. Exposição dos animais

  1. Coloque seis animais contidos na torre do sistema de exposição apenas para o nariz e inicie o fluxo de polarização a 2 L/min com ar ambiente para garantir fluxo de ar suficiente.
  2. Na área de tarefas no lado direito da tela, clique com o botão direito do mouse no Perfil de cigarro eletrônico criado e selecione Propriedades da tarefa.
  3. Em Frequência de sopro, insira a frequência desejada para iniciar um sopro. Por exemplo, um regime de 2 puffs/min requer uma entrada de 30 s. Clique em OK e, em seguida, em Sim quando o software solicitar a confirmação dessa alteração. Para salvar esse regime de puff para uso futuro, no final da sessão, siga as instruções para salvá-lo como um modelo.
  4. Quando estiver pronto para realizar a exposição, clique duas vezes no perfil de cigarro eletrônico criado e agora modificado. Certifique-se de iniciar um cronômetro para rastrear a duração da exposição.
  5. Para avaliar a dose em comprimentos de exposição crescentes, execute exposições de 10 min, 20 min e 30 min a 1 baforada/min. Em seguida, para avaliar o aumento da intensidade da exposição, mantenha uma duração de exposição de 10 minutos e aumente a frequência de inalação para 1 inalação/min, 2 inalações/min e 4 inalações/min.
  6. Após a conclusão da exposição, reiniciar o fluxo de polarização enquanto os animais regressam às suas gaiolas.
  7. Para remover os animais das restrições, solte o clipe de fichário e retraia totalmente a malha para o êmbolo, permitindo que o animal saia da contenção por conta própria. Se o animal permanecer na contenção, puxe suavemente sua cauda para sinalizar que ele está livre para se mover para trás para fora da contenção.

5. Teste de hipolocomoção

  1. Imediatamente após a exposição, transfira os animais para um conjunto de testes comportamentais para realizar um teste de campo aberto usando o software ANY-Maze. Para realizar registros de linha de base do comportamento animal, certifique-se de que eles sejam expostos apenas ao fluxo de viés.
  2. Certifique-se de que a sala esteja bem iluminada e minimize os níveis de ruído para evitar estresse desnecessário nos animais, pois isso pode influenciar seu comportamento.
  3. Abra o software e selecione Novo experimento vazio. Na guia Protocolo na parte superior da tela, selecione Adicionar item e clique em Nova fonte de vídeo na lista suspensa para adicionar a fonte da câmera a ser usada para o experimento.
  4. No menu do lado esquerdo da tela, na seção Rastreamento, selecione Aparelho para definir o campo aberto em que o animal será colocado.
  5. Na guia Protocolo, selecione a ferramenta Retângulo para desenhar a área de campo aberto e inserir suas dimensões no software.
  6. No menu do lado esquerdo da tela, na seção Rastreamento, selecione Cor do animal para especificar se o animal é mais claro ou mais escuro que o plano de fundo. Essas informações ajudam o software a rastrear com precisão o movimento do animal.
  7. No menu à esquerda, na seção Teste, selecione Estágios para especificar a duração do teste para o experimento. Insira uma duração de teste de 60 s.
  8. Na guia Experimento, defina o tratamento experimental e o número de animais por tratamento.
  9. Agora, para realizar o teste, clique na aba Testes . Coloque o animal no campo aberto e clique no botão verde Play acima da gravação do campo aberto para iniciar o teste.
  10. Após a conclusão do teste, no menu à esquerda, na seção Análise e Resultados, selecione Resultados, Relatórios e Dados e selecione Distância Total percorrida para incluir essas informações no relatório.
  11. Para gerar o relatório, clique na guia Resultados e exporte os dados no formato desejado.

6. Coleta de amostras de soro

  1. Aos 30 minutos após a exposição, anestesiar os animais com uma injeção intraperitoneal de 250 mg/kg de Avertin (2,2,2-tribromoetanol). Para garantir a anestesia adequada, estimule o reflexo de retirada do pedal beliscando a pele entre os dedos dos pés usando uma pinça romba. Uma vez que o reflexo tenha desaparecido completamente, o animal é anestesiado profundamente o suficiente para ser sacrificado por exsanguinação por punção cardíaca. O ponto de tempo de 30 minutos é selecionado para atingir as concentrações séricas máximas de THC-COOH pós-exposição18.
  2. Colete sangue por punção cardíaca em tubos de coleta de sangue e, em seguida, centrifugue a 10.000 x g por 10 min para separar o soro.
  3. Use amostras de soro para realizar um ELISA forense de THC para quantificar os níveis de THC-COOH de acordo com as instruções do fabricante e conforme publicado anteriormente19.

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Resultados

O objetivo inicial era determinar um regime de exposição que pudesse fornecer níveis fisiologicamente relevantes de THC ao sangue em comparação com os humanos. Assim, um componente-chave para selecionar os parâmetros de exposição foi usar características que imitassem os padrões de uso humano20,21. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas foram expostos a um Pineapple Express Pax Era Pod contendo ~85% de THC por 10 min, 20 min e 30 min...

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Discussão

Os produtos vape destilados de cannabis contêm altas concentrações de canabinóides, incluindo até 85% de THC para o produto utilizado neste protocolo. Como a flor de cannabis atualmente atinge apenas 36% de THC7, a potência dos produtos vape destilados de cannabis oferece desafios ao desenvolver um modelo de exposição por inalação. O objetivo era determinar um regime de exposição que pudesse efetivamente fornecer doses relevantes de canabinóides a camundongos sem ...

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Divulgações

Os autores declaram não ter conflitos de interesse relacionados a este trabalho a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant 162273. O CJB foi apoiado pelo Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2,2,2-TribromoetanolSigma-AldrichT48402-5GAvertin
inExposeSCIREQsales@scireq.comwww.scireq.com
Tubos Separadores de Soro MicrotainerBD365967
Pax Era Vape PenPAXComprado na Loja de Cannabis de Ontário
Pineapple Express Pax PodBom FornecimentoComprado na Loja de Cannabis de Ontário
SoftRestraintsSCIREQIX-XN1-SR-ALwww.scireq.com
Kit ELISA Forense THCNeogen131019

Referências

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