Este protocolo descreve o xenoenxerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) B e T derivadas do paciente, que ocorre 4 dias após a injeção.
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Artigo de método
In Ovo Xenoenxerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-LLA)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este estudo apresenta um método rápido, econômico e eficiente para xenoenxerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes, abrangendo linhagens de células B e T. Usando embriões de galinha fertilizados, injetamos células B-ALL e T-ALL derivadas de pacientes na vasculatura dos embriões 11 dias após a fertilização (11dpf). Notavelmente, quatro dias após a injeção, as células de leucemia humana enxertadas exibiram sobrevivência, proliferação e colonização vascular significativas dentro do embrião de galinha em desenvolvimento. Aos 15dpf, detectamos um aumento notável nas células LLA B-ALL CD10 / CD19 + e LLA T-CD4 / CD8 + em amostras de sangue da vasculatura do embrião, confirmando o enxerto bem-sucedido. Este sistema facilita a avaliação eficiente e reprodutível do comportamento das células de leucemia em um organismo vivo sem os custos consideráveis e restrições éticas associadas a outros modelos animais. Essa abordagem rápida fornece uma plataforma in vivo de alto rendimento e biologicamente relevante para avaliar potenciais compostos terapêuticos. O sistema de xenoenxerto derivado de paciente in ovo (PDX)-LLA apresentado aqui oferece uma ferramenta promissora para triagem pré-clínica de drogas, estudos mecanicistas e, potencialmente, para abordagens de medicina personalizada na pesquisa de leucemia.
Introdução
A membrana corioalantóide do pintinho (CAM) começa a tomar forma no dia 7 após a fertilização após a incubação e está completa no dia 12. O CAM é o centro das atenções como um modelo in vivo adequado para angiogênese1 e enxerto de células cancerígenas 2,3,4,5,6,7,8,9,10, particularmente células cancerígenas relacionadas ao sangue 11, pois é inerentemente imunodeficiente e tem vascularização bem desenvolvida. Além disso, o CAM também é um sistema desejável para investigar invasão tumoral e metástase, pois carrega uma série de proteínas da matriz extracelular, incluindo colágeno, integrina αVβ3, fibronectina, laminina e metaloproteinase-2 da matriz (MMP-2)10.
A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é um câncer da medula óssea e do sangue que se caracteriza pelo rápido aumento de linfócitos B e T imaturos. É o câncer pediátrico mais difundido e a principal causa de morte por câncer entre crianças. A LLA é curável em >85% das crianças afetadas, mas adultos e lactentes têm taxas de cura consideravelmente mais baixas, e a LLA recidivante/refratária tem uma sobrevida de 5 anos de <10%12. Assim, o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento para prevenir ou interromper a LLA recidivante ou refratária é urgentemente necessário. Embora vários modelos de xenoenxerto, como camundongos e ratos13, tenham sido desenvolvidos, esses métodos são demorados (por exemplo, meses) e caros, e exigem regulamentações éticas abrangentes. Para atender a uma necessidade clínica não atendida de uma nova terapia para LLA, é imperativo desenvolver um modelo animal reprodutível, econômico e de tempo adequado para estender o trabalho básico in vitro .
Neste estudo, relatamos o estabelecimento bem-sucedido de um protocolo de xenoenxerto in ovo que produz de forma confiável colonização vascular 3D de células LLA B e T do paciente, que é potencialmente usado para o projeto de uma nova terapia que pode interromper a progressão da LLA e para o desenvolvimento de uma ferramenta preditiva para o resultado e os riscos do tratamento da LLA.
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Protocolo
Os experimentos foram realizados com base no protocolo aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Calgary (REB15-1143; onde o consentimento informado foi obtido de TODOS os indivíduos) e pelo Comitê de Câncer do Conselho de Ética em Pesquisa em Saúde de Alberta (HREBA. CC-17-0108_REN8). Pacientes com LLA no momento do diagnóstico (antes de iniciar qualquer terapia), que apresentavam blastos circulantes (blastos não apenas na medula, mas também no sangue), foram incluídos no estudo. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Incubação de ovos
- Adquira ovos de galinha fertilizados. Obtenha ~ 10% mais ovos do que o necessário para considerar o número de ovos danificados durante o transporte ou o procedimento de quebra.
- Armazene os ovos fertilizados por até duas semanas a 12 °C sem perder a viabilidade.
- Transfira os ovos para uma incubadora de rolamento umidificada (~ 50% -60%) a 39 ° C.
- Incube os ovos na incubadora por 10dpf. Observe que o dia 1 começa quando os ovos são transferidos para a incubadora.
2. Isolamento de células de leucemia linfoblástica aguda a partir de amostras de sangue de pacientes com LLA
- Isole as células conforme descrito anteriormente 14,15.
- Colete 10 mL de sangue periférico (ou medula) de pacientes com LLA B e T em tubos de ensaio heparinizados.
- Transfira as amostras de sangue para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL e dilua três vezes com 2 volumes de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 e 1,8 mM de KH2PO4.
- Sobreponha 1 volume das amostras de sangue diluídas em 1 volume de meio de gradiente de densidade e centrifugue à temperatura ambiente sem freio a 300 x g por 30 min.
- Colete a camada de revestimento leucocitário de células mononucleares (MNCs) da interface e transfira-a para um novo tubo estéril de 15 mL usando uma pipeta estéril.
- Adicione 10 mL de 1x PBS e centrifugue a 300 x g por 5 min para remover quaisquer componentes restantes do soro (repita esta etapa duas vezes).
- Adicione 2 mL de 0,8% NH4Cl ao pellet celular, vortex suavemente, incube em temperatura ambiente por 5 min e gire a 300 x g por 5 min para lisar os glóbulos vermelhos (se necessário, repita esta etapa).
- Lave as células em 1x PBS conforme descrito na etapa 2.6.
- Ressuspenda as células em RPMI 1640 contendo 10% de FBS e conte o número de células usando um hemocitômetro.
- Avalie a viabilidade celular usando o ensaio de exclusão de azul de tripano.
- Ressuspenda as células no meio de congelamento (10% de DMSO em FBS), congele-as a -80 °C e armazene-as em nitrogênio líquido.
3. Amplificação de lentivírus incompetente de replicação de2ª geração portador de mCherry
- Sementes HEK293T células renais embrionárias humanas em ~ 60% -70% de confluência em uma placa de 6 poços contendo DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
- Cotransfectar as células (1,5 x 106) com transferência FUW-Luc-mCherry-puro, embalagem pCMVΔr8,91 e vetores de envelope pVSV-G na proporção de 3:2:1 usando Lipofectamine 3000 por 2 dias.
- Colha o sobrenadante contendo lentivírus e filtre com um filtro de 0,45 μm.
- Transferir o sobrenadante viral eliminado para tubos de centrifugação, centrifugar a 20.000 x g durante 2 h a 4 °C, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 μL de PBS ou meio isento de soro.
- Meça a multiplicidade de infecção (MOI) usando o kit qPCR Lentivirus Titre.
4. Marcação de linhagens celulares LLA em crescimento contínuo e células LLA derivadas de pacientes com mCherry
- Placa1 x 106 células/mL de linhagens celulares B-(SEM) e T-ALL (MOLT3)16,17 e células B- ou T-ALL derivadas de pacientes em placas de 6 poços contendo RPMI 1640 + 10% FBS.
- Infecte as células com 300 μL de preparação lentiviral com um título viral de 3,47 x 106 UI / mL para obter MOI de 1 para 1 x 106 células, misture suavemente e incube a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 dias.
- Adicione 1 μg/mL de puromicina ao meio de cultura para selecionar células transduzidas de forma estável por 2 dias.
- Visualize células marcadas com mCherry com um microscópio de fluorescência.
5. Enxerto in ovo xeno
- No dia 10 (veja acima a seção de incubação de ovos), examine a vasculatura dos embriões de pintinho sob luz para avaliar a viabilidade do embrião. Em seguida, lave os ovos suavemente com etanol 70% para esterilizar a superfície.
- Perfure a célula de ar dos ovos para criar uma pequena janela (~ 2,0 cm de diâmetro) usando uma furadeira manual.
- Sele com fita adesiva transparente e retorne a uma incubadora de CO5% 2 .
- No dia 11, injete 1 x 10células LLA marcadas com 7 mCherry nos vasos sanguíneos dos embriões em desenvolvimento usando agulhas 34 G. Observe que acabou sendo difícil confirmar se TODAS as células foram injetadas em locais idênticos em diferentes embriões, porque abrir a janela nos mesmos locais não é garantido.
- Sele as janelas com fita adesiva transparente, retorne à incubadora de CO5% 2 e monitore a viabilidade do embrião diariamente.
- No dia 15, disseque os vasos sanguíneos dos embriões, coloque-os em lâminas de vidro e fotografe xenoenxertos bem-sucedidos usando um microscópio de dissecação equipado com recursos de fluorescência.
NOTA: Além de 15dpf (como as penas cobrem todo o corpo e o albúmen está quase desaparecido), a imuno-histoquímica precisa ser realizada para avaliar as mudanças na proliferação e colonização de células LLA na vasculatura do embrião de pintinho.
6. Citometria de fluxo
- No dia 15, colete sangue da vasculatura do embrião de galinha usando uma seringa estéril com uma agulha de 32 G, transfira-o para um tubo estéril de 1,5 mL contendo heparina e centrifugue a 226 x g por 10 min a 4 ° C.
- Remova o sobrenadante (plasma) e ressuspenda o pellet celular em 1x PBS contendo 1% de BSA (albumina de soro bovino).
- Execute as etapas 2.7 e 2.8 para lisar os glóbulos vermelhos.
- Marcar as células B-ALL com anticorpos FITC-CD10 humano e PE-CD19 humano e as células LLA-T com anticorpos FITC-CD4 humano e PE-CD8 humano, respetivamente, a 4 °C no escuro durante 30 min.
- Lave as células marcadas duas vezes com PBS contendo 1% de BSA, centrifugue a 226 x g por 5 min a 4 ° C, ressuspenda em 1x PBS e analise por citometria de fluxo.
- Defina as tensões de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) em 400 V e 360 V, respectivamente. Ajuste os ganhos do detector para os canais FITC e PE para 450-500 V e 400-450 V, respectivamente.
NOTA: Estratégia de gating: (a) gating de dispersão de luz (FSC vs. SSC): use FSC-A vs. SSC-A para identificar uma população com dispersão direta intermediária (tamanho) e baixa dispersão lateral (granularidade), que corresponde à região linfoblástica. Observe que esta etapa ajuda a excluir detritos e células mais granulares, como monócitos ou granulócitos; (b) seleção singleto (FSC-H vs. FSC-A): realizar discriminação dupla por gating em FSC-H vs. FSC-A, garantindo que apenas eventos unicelulares sejam analisados18. - Quantifique as células CD10 / CD19 + B-ALL e CD4 / CD8 + T-ALL contando eventos no quadrante 2 (Q2; FITC/PE+) de FITC vs. Parcelas de PE18. Presente significa ± EPM de três experimentos independentes (n = 3).
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Resultados
Para determinar se o enxerto de células LLA humanas em embriões de galinha em desenvolvimento foi bem-sucedido, lentivírus incompetentes de replicação de2ª geração portadores de mCherry foram amplificados e usados para marcar linhas celulares B- e T-ALL, SEM e MOLT316,17, respectivamente. Conforme mostrado na Figura 1A, ~ 50% das células B- (dois painéis superiores esquerdos) e T- (dois painéis superiores direitos) ALL for...
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Discussão
Três etapas críticas durante o xenoenxertoin ovo foram identificadas para evitar a contaminação microbiana e maximizar a sobrevivência dos embriões de galinha: ou seja, (1) esterilizar a superfície da casca do ovo com etanol a 70% antes de fazer a janela e (2) vedação hermética da janela da casca do ovo com fita adesiva para evitar a evaporação do conteúdo do embrião de galinha durante a incubação, e (3) o uso da agulha fina (por exemplo, 34 G) e injeção de células LLA em um vo...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Andrew Kung, da Universidade de Columbia, por fornecer FUW-Luc-mCherry-puro. Este trabalho foi apoiado por doações do CIHR (PJT-174983) para KYL e da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF; RS-2023-00284121) para KYL e M-YJ.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulhas de 34 G | BD Perisafe | ||
| Citômetro de fluxo Attune NxT | Thermo Fisher | ||
| Seringa BD Perisafe (32 G) | BD Perisafe | ||
| Albumina de soro bovino (BSA) | Millipore Sigma | Rolamento A9647 | |
| Meio de congelamento de células | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12648010 | |
| Centrífuga (Centrífuga Allegra X-22R) | Beckman Coulter | ||
| Luvas descartáveis | Luvas de Exame de Nitrilo Royal Touch300 | ||
| Microscópio de dissecação | Leica MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Incubadora de ovos, Incubadora rolante Vevitts 120 | Vixest Trading Co. | ||
| Álcool etílico (95%) | VWR Internacional | BDH1158-4LP | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Solução Ficoll (Ficoll?? Paque Plus) | MilliporeSigma | GE17-1440-02 | |
| anticorpo FITC-CD10 | Santa Cruz Biotech | sc-46656 FITC | |
| anticorpo FITC-CD4 | Santa Cruz Biotech | sc-19641 FITC | |
| Microscópio de Fluorescência | Leica Microsystems | ||
| Furadeira manual (Dremel3000) | Bosch | ||
| HEK293T | ATCC, VA, EUA | CRL-3216 | |
| Hemocitômetro | VWR internacional, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Sal de heparina sódica da mucosa intestinal suína | Millipore Sigma | H3149 | |
| Tubos de ensaio heparinizados | BD Vacutainer | BD 366480 | |
| Lipofectamina 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| Kit de titulação de lentivírus multiplex (kit de titulação de lentivírus qPCR) | Abm | LV900 | |
| NH4Cl (chloride_ de amônio | Millipore Sigma | A9434 | |
| Microscópio invertido Olympus IX71 | Olimpo | ||
| Anticorpo PE-CD19 | Santa Cruz Biotech | PE sc-19650 | |
| anticorpo PE-CD8 | Santa Cruz Biotech | sc-1177 PE | |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma | Pág. 3813 | |
| Pipetas (volume ajustável) | Eppendorf | ||
| Puromicina | Gibco, ThermoFisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fita de Celótipo Escocês | 3M | ||
| Placas estéreis de 6 poços | VWR internacional, Corning | 22250-140 | |
| Tubos de centrífuga estéreis | Axygen Inc, Corning | AXYMCT-150-C-S | |
| Frascos de cultura estéreis (75T) | VWR Internacional | 10062-872 | |
| Tubos Falcon estéreis (15 mL) | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Tubos Falcon estéreis (50 mL) | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| Filtro estéril (0,45 µ filtro m) | VWR Internacional | 76778-974 | |
| Pinça estéril | VWR Internacional | 82027-404 | |
| Lâminas de vidro estéreis | VWR internacional | 48300-031 | |
| Ponteiras de pipeta estéreis | VWR Internacional | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Seringas estéreis | Seringa BD | 309628? | |
| Azul Trypan | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | T10282 |
Referências
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Reimpressões e permissões
