Este protocolo descreve o xenoenxerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) B e T derivadas do paciente, que ocorre 4 dias após a injeção.
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Artigo de método
In Ovo Xenoenxerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-LLA)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este estudo apresenta um método rápido, econômico e eficiente para xenoenxerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes, abrangendo linhagens de células B e T. Usando embriões de galinha fertilizados, injetamos células B-ALL e T-ALL derivadas de pacientes na vasculatura dos embriões 11 dias após a fertilização (11dpf). Notavelmente, quatro dias após a injeção, as células de leucemia humana enxertadas exibiram sobrevivência, proliferação e colonização vascular significativas dentro do embrião de galinha em desenvolvimento. Aos 15dpf, detectamos um aumento notável nas células LLA B-ALL CD10 / CD19 + e LLA T-CD4 / CD8 + em amostras de sangue da vasculatura do embrião, confirmando o enxerto bem-sucedido. Este sistema facilita a avaliação eficiente e reprodutível do comportamento das células de leucemia em um organismo vivo sem os custos consideráveis e restrições éticas associadas a outros modelos animais. Essa abordagem rápida fornece uma plataforma in vivo de alto rendimento e biologicamente relevante para avaliar potenciais compostos terapêuticos. O sistema de xenoenxerto derivado de paciente in ovo (PDX)-LLA apresentado aqui oferece uma ferramenta promissora para triagem pré-clínica de drogas, estudos mecanicistas e, potencialmente, para abordagens de medicina personalizada na pesquisa de leucemia.
Introdução
A membrana corioalantóide do pintinho (CAM) começa a tomar forma no dia 7 após a fertilização após a incubação e está completa no dia 12. O CAM é o centro das atenções como um modelo in vivo adequado para angiogênese1 e enxerto de células cancerígenas 2,3,4,5,6,7,8,9,10, particularmente células cancerígenas relacionadas ao sangue
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Protocolo
Os experimentos foram realizados com base no protocolo aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Calgary (REB15-1143; onde o consentimento informado foi obtido de TODOS os indivíduos) e pelo Comitê de Câncer do Conselho de Ética em Pesquisa em Saúde de Alberta (HREBA. CC-17-0108_REN8). Pacientes com LLA no momento do diagnóstico (antes de iniciar qualquer terapia), que apresentavam blastos circulantes (blastos não apenas na medula, mas também no sangue), foram incluídos no estudo. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Incubação de o....
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Resultados
Para determinar se o enxerto de células LLA humanas em embriões de galinha em desenvolvimento foi bem-sucedido, lentivírus incompetentes de replicação de2ª geração portadores de mCherry foram amplificados e usados para marcar linhas celulares B- e T-ALL, SEM e MOLT316,17, respectivamente. Conforme mostrado na Figura 1A, ~ 50% das células B- (dois painéis superiores esquerdos) e T- (dois painéis superiores direitos) ALL for.......
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Discussão
Três etapas críticas durante o xenoenxertoin ovo foram identificadas para evitar a contaminação microbiana e maximizar a sobrevivência dos embriões de galinha: ou seja, (1) esterilizar a superfície da casca do ovo com etanol a 70% antes de fazer a janela e (2) vedação hermética da janela da casca do ovo com fita adesiva para evitar a evaporação do conteúdo do embrião de galinha durante a incubação, e (3) o uso da agulha fina (por exemplo, 34 G) e injeção de células LLA em um vo.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Andrew Kung, da Universidade de Columbia, por fornecer FUW-Luc-mCherry-puro. Este trabalho foi apoiado por doações do CIHR (PJT-174983) para KYL e da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF; RS-2023-00284121) para KYL e M-YJ.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulhas de 34 G | BD Perisafe | ||
| Citômetro de fluxo Attune NxT | Thermo Fisher | ||
| Seringa BD Perisafe (32 G) | BD Perisafe | ||
| Albumina de soro bovino (BSA) | Millipore Sigma | Rolamento A9647 | |
| Meio de congelamento de células | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12648010 | |
| Centrífuga (Centrífuga Allegra X-22R) | Beckman Coulter | ||
| Luvas descartáveis | Luvas de Exame de Nitrilo Royal Touch300 | ||
| Microscópio de dissecação | Leica MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Incubadora de ovos, Incubadora rolante Vevitts 120 | Vixest Trading Co. | ||
| Álcool etílico (95%) | VWR Internacional | BDH1158-4LP | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Solução Ficoll (Ficoll?? Paque Plus) | MilliporeSigma | GE17-1440-02 | |
| anticorpo FITC-CD10 | Santa Cruz Biotech | sc-46656 FITC | |
| anticorpo FITC-CD4 | Santa Cruz Biotech | sc-19641 FITC | |
| Microscópio de Fluorescência | Leica Microsystems | ||
| Furadeira manual (Dremel3000) | Bosch | ||
| HEK293T | ATCC, VA, EUA | CRL-3216 | |
| Hemocitômetro | VWR internacional, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Sal de heparina sódica da mucosa intestinal suína | Millipore Sigma | H3149 | |
| Tubos de ensaio heparinizados | BD Vacutainer | BD 366480 | |
| Lipofectamina 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| Kit de titulação de lentivírus multiplex (kit de titulação de lentivírus qPCR) | Abm | LV900 | |
| NH4Cl (chloride_ de amônio | Millipore Sigma | A9434 | |
| Microscópio invertido Olympus IX71 | Olimpo | ||
| Anticorpo PE-CD19 | Santa Cruz Biotech | PE sc-19650 | |
| anticorpo PE-CD8 | Santa Cruz Biotech | sc-1177 PE | |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma | Pág. 3813 | |
| Pipetas (volume ajustável) | Eppendorf | ||
| Puromicina | Gibco, ThermoFisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fita de Celótipo Escocês | 3M | ||
| Placas estéreis de 6 poços | VWR internacional, Corning | 22250-140 | |
| Tubos de centrífuga estéreis | Axygen Inc, Corning | AXYMCT-150-C-S | |
| Frascos de cultura estéreis (75T) | VWR Internacional | 10062-872 | |
| Tubos Falcon estéreis (15 mL) | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Tubos Falcon estéreis (50 mL) | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| Filtro estéril (0,45 µ filtro m) | VWR Internacional | 76778-974 | |
| Pinça estéril | VWR Internacional | 82027-404 | |
| Lâminas de vidro estéreis | VWR internacional | 48300-031 | |
| Ponteiras de pipeta estéreis | VWR Internacional | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Seringas estéreis | Seringa BD | 309628? | |
| Azul Trypan | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | T10282 |
Referências
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82 (1), 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sc....
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Reimpressões e permissões
