Este protocolo tem como objetivo testar se o amarelo de hidroxisafflor A (HSYA) atenua a neurotoxicidade induzida por LPS em peixe-zebra. A função motora foi avaliada usando um sistema Visual Vision. A lesão do nervo dopaminérgico foi examinada por imuno-histoquímica. As moléculas envolvidas na via TLR4/NF-κB foram analisadas usando Western blot.
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Artigo de investigação
O hidroxisafflor amarelo A atenua a toxicidade induzida por LPS em neurônios dopaminérgicos de peixe-zebra, regulando a via de sinalização TLR4 / NF-ĸB
Neste artigo
Resumo
Resumo
A inflamação induzida por lipopolissacarídeo (LPS) desempenha um papel crucial no desencadeamento e perpetuação de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP). O amarelo de hidroxisafflor A (HSYA) é o principal componente de Carthamus tinctorius L.. Este estudo tem como objetivo observar se o HSYA poderia melhorar a toxicidade induzida por LPS em neurônios dopaminérgicos de peixe-zebra. O peixe-zebra foi exposto ao LPS e depois tratado com HSYA. Testes de comportamento foram realizados para avaliar a função motora do peixe-zebra. A lesão neuronal dopaminérgica e o nível de dopamina foram examinados. TLR4, NF-κB, IL-1β e TNF-α também foram medidos. Ele demonstrou que o LPS (60 μg/mL, concentração final) induziu toxicidade no peixe-zebra e causou disfunção motora e danos aos neurônios positivos para tirosina hidroxilase (TH). A exposição ao LPS não apenas diminuiu o conteúdo de dopamina, mas também aumentou os níveis de IL-1β, TNF-α e expressão de TLR4 e NF-κB. A HSYA melhorou a disfunção motora induzida por LPS. Além disso, o HSYA atenuou a perda de neurônios TH-positivos, que foi acompanhada por um aumento no conteúdo de dopamina. O tratamento com HSYA também inibiu a expressão de TLR4, NF-κB e a produção de IL-1β, TNF-α. Em conclusão, este estudo demonstra que o HSYA atenua a lesão induzida por inflamação em neurônios dopaminérgicos de peixe-zebra, regulando a via TLR4 / NF-κB, que fornece uma base experimental para a prevenção de lesão inflamatória na DP.
Introdução
A patogênese da doença de Parkinson (DP) é a deterioração da atividade motora devido à lesão de neurônios dopaminérgicos no cérebro. As manifestações da DP incluem disfunção motora, incluindo tremor em repouso, bradicinesia, instabilidade postural e tônus muscular. A inflamação é uma característica patológica proeminente da DP. Os níveis de citocinas no líquido cefalorraquidiano e nas regiões cerebrais nigroestriatais post-mortem de indivíduos com DP são elevados em comparação com controles saudáveis pareados por idade1. Os mecanismos pelos quais a lesão neuronal dopaminérgica é causada pela inflamação foram bem estabelecidos. Na DP, os neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo são sensíveis a citocinas, como o fator de necrose tumoral (TNF)-ɑ2. O lipopolissacarídeo (LPS) é um componente das bactérias. O LPS é identificado como um ligante do receptor Toll-like 4 (TLR-4). Uma vez ligado ao TLR-4, o LPS leva a uma resposta inflamatória e mostra toxicidade ao tecido. O TLR-4 está localizado na microglia do sistema nervoso central. O LPS ativa o TLR-4 e, portanto, produz TNF-α e IL-1β. A exposição central ou periférica ao LPS induzirá toxicidade ao sistema nervoso central. Há evidências que demonstram que a toxicidade induzida por LPS desempenha um papel no desencadeamento e perpetuação de doenças neurodegenerativas, incluindo DP 3,4,5.
Recentemente, o peixe-zebra tem sido comumente usado como modelo para estudar doenças do sistema nervoso. O peixe-zebra e os humanos têm 80% de homologia genética. E o peixe-zebra tem quase o mesmo número de cromossomos que os humanos. Além disso, a estrutura principal do cérebro do peixe-zebra e suas vias de sinalização são semelhantes às dos mamíferos. O peixe-zebra também pode produzir um grande número de embriões transparentes, desenvolve-se rapidamente e é propenso à manipulação genética6. Essas vantagens tornam o peixe-zebra um excelente modelo para investigar a patogênese da DP e desenvolver a triagem de medicamentos de alto rendimento na DP.
O amarelo de hidroxisafflor A (HSYA) é um ingrediente principal de Carthamus tinctorius L. Estudos anteriores mostraram que o HSYA tem propriedades anti-inflamatórias. Nas culturas mesencefálicas primárias, a HSYA de 20 μM a 640 μM não apresentou toxicidade. E a concentração de HSYA variando de 40 μM a 640 μM reduziu o dano neuronal dopaminérgico induzido por LPS7. Camundongos C57BL / 6J foram expostos à 6-hidroxidopamina para induzir um modelo de DP. O HSYA não apenas atenua a função neurológica prejudicada, mas também protege os neurônios dopaminérgicos no cérebro. Além disso, a HSYA reduziu a expressão de ciclooxigenase-2, óxido nítrico sintase induzível e NF-κB na substância negra8.
Até o momento, não há relatos demonstrando a propriedade do HSYA de reduzir a toxicidade do LPS in vivo. Mostrou que o HSYA atenuou a toxicidade induzida por LPS in vitro7. No entanto, a avaliação baseada em células não representa todas as etapas do complexo processo de neurotoxicidade. O peixe-zebra é particularmente valioso para desvendar o mecanismo de toxicidade. Nos últimos anos, também foi demonstrado que a HSYA é capaz de inibir a ativação da via inflamatória NF-κB, diminuindo a expressão da proteína quinase B, melhorando assim a resposta inflamatória, e que a HSYA também inibe a via de sinalização inflamatória associada à proteína ativadora 1, que afeta a proliferação celular e a lesão inflamatória induzida pelo fator de necrose tumoral α9, 10. Agosto Este estudo tem como objetivo investigar se o HYSA pode melhorar a toxicidade induzida por LPS em neurônios dopaminérgicos de peixe-zebra.
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Protocolo
Os experimentos foram conduzidos de acordo com as Diretrizes do National Institutes of Health para o Uso de Animais de Laboratório (Publicação 86-23, revisada em 1986). E este estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yantai (YTDX20220623). Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Manutenção do peixe-zebra
O peixe-zebra da linhagem AB (Danio rerio) foi mantido em sistema de recirculação de água a uma temperatura da água de 27-28,5 °C (pH 7,0), em um ciclo claro/escuro de 14/10 h. O peixe-zebra foi alimentado duas vezes ao dia com camarão. Após o acasalamento natural, os embriões fertilizados foram coletados em placas de Petri contendo meio E3 com água deionizada, KCl, NaCl, MgSO4·7H2O e CaCl2.
2. Toxicidade induzida por LPS em peixe-zebra
Embriões de peixe-zebra às 24 h pós-fertilização (hpf) foram colhidos e distribuídos nos grupos controle e LPS, com 60 embriões em cada grupo. O pó de LPS foi pesado e adicionado a uma certa quantidade de solução de PBS (pH = 7,4) para dissolução, preparada como uma solução estoque de LPS 2 mg / mL, colocada a -20 ° C para armazenamento e espera. Durante o experimento, a solução de reserva de LPS foi diluída para 30 μg/mL, 60 μg/mL e 90 μg/mL de solução de LPS. A solução de LPS na concentração final de 30 μg/mL, 60 μg/mL ou 90 μg/mL foi adicionada a placas de Petri contendo 24 embriões de peixe-zebra hpf; o volume de solução para cada poço experimental foi de 3 mL. No grupo controle, embriões de peixe-zebra foram cultivados em meio E3 sem LPS. As placas de Petri foram colocadas em uma câmara de incubação de temperatura constante a 28 °C. A exposição ao LPS foi repetida seguindo o mesmo procedimento mencionado acima por cinco dias consecutivos.
3. Efeito do inibidor de TLR4 na toxicidade induzida por LPS em peixe-zebra
Embriões de peixe-zebra com 24 hpf foram designados para os grupos controle, LPS e TAK-242. Vários estudos têm sido realizados para validar o efeito regulatório do TAK-242 na concentração final de 1 μM na regulação da via de sinalização do TLR4, dentre os quais alguns estudos mostraram que o TAK-242, ao inibir a proliferação celular induzida pelo LPS e a liberação de fatores inflamatórios, proporciona uma nova forma de resolver os problemas relacionados à redução do glaucoma no pós-operatório11. No grupo TAK-242, o TAK-242 (1 μM, concentração final) foi adicionado a uma placa de Petri contendo 24 embriões de peixe-zebra hpf; o volume de solução para cada poço experimental foi de 3 mL. Após 30 min, LPS (60 μg/mL, concentração final) foi adicionado para induzir toxicidade, e as concentrações de LPS não causaram mortalidade de zebrafish. Os embriões do grupo controle foram mantidos apenas em meio E3. As placas de Petri foram colocadas em uma câmara de incubação de temperatura constante a 28 °C. O procedimento acima foi repetido por cinco dias consecutivos.
4. Efeito do HSYA na toxicidade induzida por LPS em peixe-zebra
Embriões de peixe-zebra com 24 hpf foram designados para grupos controle, LPS e HSYA. HSYA em uma concentração final de 20 μM, 40 μM ou 80 μM foi adicionado a placas de Petri contendo 24 embriões de peixe-zebra hpf; o volume de solução para cada poço experimental foi de 3 mL. Após 30 min, foi adicionado LPS (60 μg/mL, concentração final). Os embriões do grupo controle foram mantidos apenas em meio E3. As placas de Petri foram colocadas em uma câmara de incubação de temperatura constante a 28 °C. O procedimento acima foi repetido por cinco dias consecutivos.
5. Avaliação comportamental
O peixe-zebra foi transferido para os 60 poços médios de uma placa de 96 poços, com uma larva de peixe-zebra por poço. O meio de cultura E3 (250 μL) foi adicionado a cada poço para permitir a natação livre. A atividade locomotora foi registrada usando um sistema de visão. Água pura foi adicionada à caixa escura (30 cm × 40 cm × 60 cm), que foi ajustada para um estado de aquecimento com a temperatura ajustada para 28 °C.
Quando a temperatura da caixa escura atingiu 28 ° C, a placa de 96 poços contendo peixe-zebra foi colocada dentro e o sistema Visual Vision foi ativado para registrar a atividade locomotora. Uma nova pasta foi criada para armazenar os dados. O arquivo de vídeo caseiro foi selecionado como fonte de vídeo para entrar na interface de configurações experimentais. Na seção Configurações do experimento , o número de zonas de observação foi definido como 60, permitindo a observação simultânea de 60 peixes-zebra. Em Arena Settings, a imagem da placa de 96 poços capturada pela lente apareceu na tela, junto com os círculos de posicionamento. Os módulos na interface Arrange Arenas foram ajustados para que a área de captura da lente se alinhe com cada poço. No Mapeamento de Hardware da Arena, a luz da caixa escura foi definida como Luz acesa.
Em Configurações de Controle de Ensaio, um novo programa foi criado com um período de preparação de 10 minutos e um período de detecção de 10 minutos, que foi então aplicado a todos os experimentos paralelos. As configurações de detecção foram usadas para confirmar que a função de captura da lente estava funcionando normalmente. Na Lista de Testes, foram exibidos dados de 60 peixes-zebra em cada grupo. O número de tentativas na barra de ferramentas foi usado para gerar uma tabela de dados contendo todos os grupos experimentais, garantindo a integridade dos dados.
Todas as configurações foram confirmadas e a temperatura da caixa escura foi mantida em 28 °C. Depois de verificar que cada poço continha um peixe-zebra com sinais vitais, o experimento foi iniciado. Durante o experimento, a lente do instrumento comportamental registrou a trajetória do movimento, a duração e os parâmetros relacionados. Após 20 minutos da primeira gravação, o sistema foi encerrado automaticamente e preparado para a próxima tentativa. A caixa escura foi aberta e a placa de 96 poços foi substituída por uma nova contendo peixe-zebra para o experimento subsequente.
No final do experimento, Resultados foi selecionado no módulo Análise . Parâmetros experimentais como velocidade média, distância, aceleração máxima e ângulo de direção absoluto foram extraídos do módulo de resultados e exportados. Os dados foram então compilados para análise de diferenças comportamentais entre os grupos de peixe-zebra12.
6. Medição de citocinas pró-inflamatórias
Peixes-zebra foram coletados. Os espécimes foram pesados e PBS (0,01 M, pH = 7,4) foi adicionado a uma razão gravimétrica de 1:9 e homogeneizado (5000 r/min, 30 s) a 4 °C. Os homogeneizados foram centrifugados a 4 °C, 5000 x g, 20 min, e os sobrenadantes foram colhidos. IL-1β e TNF-α foram testados com kits de ELISA de peixe de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.
7. Imuno-histoquímica
Os peixes-zebra foram fixados com 5 mL de paraformaldeído a 4% (v/v). Embebido em parafina e corte em seções de 5 μm de espessura. Os cortes foram incubados com tampão citrato (200 μL) no micro-ondas por 10 min. Eles foram incubados em solução de peróxido de hidrogênio e metanol a 0,3% por 30 min para bloquear as peroxidases endógenas. Lavado com PBS 3 vezes, 5 min de cada vez. O soro não imune foi incubado por 30 min a 37 ºC. O anticorpo anti-TH primário (1:100) foi incubado por 30 min a 37 ºC. Lavado 3 vezes com PBS. Incubado com anticorpo secundário ligado à peroxidase de rábano (1:200) a 37 ºC por 30 min. Em seguida, foi adicionada 3,3'-diaminodbenzidina. As seções foram fotografadas usando um microscópio de campo claro.
8. Neurotransmissores
HPLC-ECD foi empregado para testar o nível de dopamina. O cloridrato de dopamina foi dissolvido em ácido perclórico 0,1 M (HClO4) para obter uma solução de gradiente de concentração a 3,90625 ng/mL, 7,8125 ng/mL, 15,625 ng/mL, 31,25 ng/mL, 62,5 ng/mL e 125 ng/mL. Uma série de soluções padrão de dopamina foi analisada por HPLC-ECD. A regressão linear foi realizada usando a concentração de dopamina e a área do pico de dopamina. Uma curva padrão foi plotada. Os tecidos do peixe-zebra foram homogeneizados com HClO 0,1 M413. Os homogeneizados foram centrifugados a 4 °C, 20.000 x g, 15 min. Em seguida, as amostras foram separadas em uma coluna ODS2 (E2118047; 4,6 × 250 mm, 5 μm). O tampão foi preparado: acetato de sódio 25 mmol/L, ácido cítrico 25 mmol/L, sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético 0,01 mmol/L, 1-octanossulfonato de sódio 1 mmol/L e ácido acético, pH ajustado para 3,35. A fase móvel foi acetonitrila: tampão (1:9, v/v). Após filtração a vácuo com uma membrana filtrante de 0,22 μm, a amostra foi desgaseificada por desgaseificação ultrassônica por 10 min. A temperatura do forno de coluna foi de 30 °C. A taxa de fluxo foi de 1 mL/min. A amostra foi injetada em um volume de 20 μL. O detector eletroquímico foi operado a uma tensão de 1000 mV com uma faixa de 10 μA. A quantidade de dopamina nos tecidos do peixe-zebra foi calculada com base na equação de regressão.
9. Mancha ocidental
As proteínas foram extraídas do tecido do peixe-zebra e a concentração foi testada (concentração final: 10 mg/mL). As proteínas (50 μg/5 μL) foram submetidas à eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio a 8%. A membrana de transferência foi conduzida a 110 V por 1 h. As membranas foram bloqueadas com leite a 5% por 1 h. Incubado a 4 °C com anticorpos primários: coelho anti-TLR4 (1:1000), coelho anti-NF-κB (1:2000), coelho anti-lamina B1 (1:2000) ou coelho anti-GAPDH (1:1000). Após a lavagem com TBST (3 vezes por 5 min cada), as membranas foram incubadas com anticorpo secundário por 1 h. As bandas foram visualizadas usando um kit de substrato quimioluminescente ECL e quantificadas usando um sistema de imagem em gel. Lamin B1 e GAPDH foram usados como controles de carregamento.
10. Análise estatística
Todos os dados foram expressos em média ± DP e analisados com software estatístico. As análises estatísticas foram realizadas por meio de análise de variância (ANOVA) de uma via seguida do teste de Tukey. Um valor de P de <0,05 foi estatisticamente significativo.
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Resultados
Efeitos do LPS na função motora do peixe-zebra
A velocidade média, a distância total e a aceleração máxima do peixe-zebra nos grupos LPS (60 μg/mL e 90 μg/mL) foram reduzidas (P < 0,01) em comparação com o grupo controle. A disfunção motora também se manifestou como mudanças frequentes na direção do movimento. O ângulo de giro absoluto da natação do peixe-zebra nos grupos LPS 60 μg/mL e LPS 90 μg/mL foi significativamente aumentado (P < 0,01) (<...
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Discussão
As plantas medicinais têm um longo histórico de aplicações anti-inflamatórias e neuroprotetoras14. Nossos estudos anteriores mostraram que o HSYA teve um efeito protetor em modelos animais de DP induzidos por agentes neurotóxicos. Usando a toxicidade induzida por LPS em peixe-zebra, este estudo demonstra que o HSYA atenua a lesão induzida por inflamação em neurônios dopaminérgicos de peixe-zebra, regulando a via de sinalização TLR4 / NF-κB.
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
CONTRIBUIÇÃO DO AUTOR:
Conceituação: Guirong Zhang, Bing Han. Aquisição de financiamento: Guirong Zhang, Bing Han. Investigação: Huilin Zhang. Metodologia: Huilin Zhang, Mingyue Li, Xiaohan Zhang, Yang Li. Supervisão: Guirong Zhang, Bing Han. Redação - rascunho original: Mingyue Li, Xiaohan Zhang, Yang Li. Redação - revisão e edição: Huilin Zhang, Guirong Zhang, Bing Han.
Agradecimentos
Agradecemos a Rachel James por editar este manuscrito. Esta pesquisa foi financiada pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong (Grant No. ZR2020MH377).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de Medição de Concentração de Proteína BCA | Beyotime Biotechnology | P0012S | |
| Sistema de imagem quimioluminescente | Beijing Sage Venture Technology Co. | ChampChemi 910 | |
| Sigma– Aldrich | PHR1090 | ||
| Balança eletrônica | Shanghai OHAUS Instrument Co. | Kits ELISA AR-2140 | |
| para IL-1β | CB10018-FI | COIBO | |
| Biotechnology para TNF-&alfa; | COIBO Biotechnology | CB10148-FI | |
| GAPDH anticorpo | de Sinalização Celular | 5174S | |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Software estatístico, Boston, MA, EUA, www.graphpad.com | Prisma 5.0 | |
| Cromatografia líquida de alto desempenho– detecção eletroquímica (HPLC– ECD) | GL Sciences, Ibaraki, Japão | ED723 | |
| Pequim Dalong Xingchuang Experimental Instrument Co. | D3024R | ||
| HPLC– ECD | GL Sciences | ED723 | |
| HSYA | Luye Pharma Group Ltd. | ||
| Image Quant | GE Healthcare, Tóquio, Japão | LAS 4000 | |
| Lamin B1 anticorpo | Cell Signaling Technology | 13435S | |
| LPS | Sigma– Aldrich | L2630 | |
| Microscópio | Leica, Wetzlar | DM1000LED | |
| Microscópio | Leica, Alemanha | DM1000LED | |
| Rotulador Multifuncional | de Enzimas Shanghai Meigu Molecular Instrument Co. | SpectraMax Paradigm | |
| NF-κ | Tecnologia de sinalização celular | 8242S | |
| Noldus Visual Vision XT sistema | Beijing Noldus Biotechnology Co., Ltd. | EthoVision XT15 | |
| Beyotime Biotechnology | P0028 | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnology | ST506 | |
| TAK-242 | Merck | 614316 | |
| Termostato | Shenzhen Galaxy Instrumentation Co. | ||
| anticorpo TLR4 | Abcam | ab13556 | |
| Zebrafish | Northern Center for National Zebrafish Model Animals | AB strain | |
| Zebrafish recirculação de água sistema | Beijing Aisheng Biotechnology Co., Ltd. | ESEN-AW-S1 |
Referências
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Reimpressões e permissões
