Um teste de preferência olfativa para medir vieses hedônicos olfativos em modelos de depressão em camundongos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de teste de preferência olfativa que permite a avaliação de vieses olfativos negativos em relação a estímulos de odor apetitivos e aversivos em modelos de depressão em camundongos.

Resumo

A depressão é o maior contribuinte para a incapacidade em todo o mundo, afetando 280 milhões de pessoas anualmente. Além da redução da atividade e da motivação, a depressão demonstrou estar associada a um viés negativo de valência: os pacientes acham os estímulos sensoriais neutros e positivos menos agradáveis e os negativos mais desagradáveis em comparação com indivíduos saudáveis. Em particular, o viés hedônico olfatório pode representar um marcador de estado da doença em pacientes e pode ser facilmente medido em modelos de camundongos. No entanto, existem muito poucos testes em animais para medir o viés emocional de forma translacional. Aqui propomos um protocolo para uma avaliação confiável da atribuição de valência de odor de camundongos controle e depressivos através da exploração de odores associados a vários valores hedônicos. Usando este teste de preferência olfativa e várias leituras comportamentais, confirmamos um viés olfativo negativo em relação a estímulos apetitivos e aversivos em dois modelos distintos de depressão em camundongos. É importante ressaltar que este método é aplicável a indivíduos do sexo masculino e feminino. Finalmente, este protocolo permite múltiplas adaptações para melhorar a avaliação da resposta emocional e pode ser facilmente combinado com ferramentas clássicas para monitoramento ao vivo da atividade neuronal.

Introdução

A depressão é um transtorno de humor grave e uma das principais causas de incapacidade em todo o mundo. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, aproximadamente 280 milhões de pessoas, ou seja, 4% da população, sofrem de depressão. É 50% mais comum entre as mulheres do que entre os homens, e o surto de COVID-19 aumentou em 25% a prevalência de transtornos depressivos no primeiro ano da pandemia (Organização Mundial da Saúde, 2022). Além disso, cerca de um terço dos pacientes não responde às terapias antidepressivas clássicas, leva semanas para observar os efeitos antidepressivos e a fisiopatologia dos transtornos de humor permanece amplamente desconhecida.

Com base no DSM-5¹, um diagnóstico de depressão depende de vários sintomas, incluindo humor deprimido, perda de interesse ou prazer, variação significativa de peso, desaceleração física e psicológica, fadiga, sentimentos de inutilidade, dificuldade de concentração e pensamentos recorrentes de morte. Estudos clínicos também demonstraram que os transtornos de humor vêm acompanhados de alterações sensoriais: pacientes deprimidos acham os estímulos sensoriais menos agradáveis do que os indivíduos controles ^2,3,4.

A "valência" hedônica refere-se ao grau em que algo é prazeroso (valência positiva) ou aversivo (valência negativa). A atribuição de valência a um estímulo pode desencadear um comportamento adaptado, incluindo abordagem ou evitação⁵. Curiosamente, esse processo é altamente conservado entre espécies, de insetos a humanos⁶. A depressão está, portanto, associada a um viés negativo de valência. No entanto, o diagnóstico clínico ainda depende pouco de avaliações de viés sensorial.

Entre as modalidades sensoriais, o olfato é particularmente interessante, pois as entradas olfativas ignoram em grande parte os relés talâmicos e se projetam para o sistema límbico em mamíferos, incluindo humanos. Do ponto de vista evolutivo, esse sistema tem se mostrado crítico na codificação de um conjunto de respostas primárias a estímulos ambientais 7,8,9,10,11,12. Além desses circuitos neurais compartilhados, estudos clínicos revelam uma relação bilateral entre olfato e depressão, com pacientes deprimidos apresentando alterações olfativas, bem como distúrbios olfativos causando sintomas depressivos¹³. Além disso, a função olfativa é recuperada em pacientes deprimidos após medicação ou terapia 14,15,16,17. Esses resultados sugerem que os déficits olfatórios podem ser um biomarcador de estado (estado das manifestações clínicas nos pacientes) e não de traço (propriedades que desempenham um papel antecedente, possivelmente causal, na fisiopatologia do transtorno psiquiátrico e, portanto, podem ser usadas para diagnóstico precoce e pré-sintomático) para a doença¹⁸. Assim, uma melhor e mais ampla compreensão de como a modalidade olfativa é alterada na depressão pode abrir caminho para novas ferramentas terapêuticas para diagnóstico e detecção da capacidade de resposta ao tratamento.

Portanto, avaliar o viés hedônico olfativo em modelos de depressão seria de particular interesse, tanto para avaliar o fenótipo do tipo depressivo induzido quanto como uma ferramenta para investigar os mecanismos neurais por trás dessas mudanças na atribuição de valência. Estudos anteriores já usaram abordagens comportamentais para avaliar a atribuição de valência de odor em camundongos. No entanto, esses testes apresentam várias ressalvas: requerem dispositivos sofisticados¹⁹ que envolvem principalmente caixas fechadas por uma tampa 19,20,21, implicam contato físico constante com solução de odor 20,21,22 e/ou resultam em tempos de exploração de odor muito curtos 21,22,23 . Isso torna esses ensaios incompatíveis com as ferramentas clássicas de monitoramento ao vivo da atividade neuronal que requerem durações de amostragem mais longas em camundongos amarrados.

Além disso, Malkesman et al. já desenvolveram o Teste de Cheirar Urina Feminina (FUST) para monitorar a atividade de busca de recompensa em roedores, medindo a investigação olfativa de camundongos machos expostos à urina de camundongos fêmeas²⁴. No entanto, este teste avalia apenas a resposta comportamental a um estímulo positivo específico de natureza social e com tempos de interação curtos. Além disso, este teste foi projetado exclusivamente para roedores machos, embora a depressão seja duas vezes mais prevalente entre as mulheres do que entre os homens.

Para superar todas essas limitações, desenvolvemos aqui um Teste de Preferência Olfativa (OPT) adaptado de Bigot et ^al.14, onde camundongos machos e fêmeas podem ser expostos a uma grande variedade de odores neutros, positivos e negativos, a fim de avaliar com precisão a resposta hedônica no contexto da depressão. A escolha dos odores pode ser baseada em publicações anteriores ^14,25, mas esse teste também permite explorar novos estímulos sociais, nutricionais e relacionados à infecção, usando componentes naturais e misturas químicas monomoleculares ou especificamente projetadas.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais e de cuidados com os animais seguiram as diretrizes nacionais e europeias (2010/63/UE) e foram aprovados pelo Ministério da Pesquisa da França (APAFiS: #16380-2018080217358599_v1; APAFIS # 51636-2024101718013761_v4). Camundongos machos e fêmeas C57BL/6JRj (modelo UCMS) e camundongos machos C57BL/6NTac (modelo CORT) (8 semanas de idade) foram alojados socialmente (4-5 camundongos por gaiola) e mantidos em condições padrão (23 ± 1 ° C; umidade 40%) em um ciclo claro/escuro de 14/10 h (luzes acesas às 7 da manhã) com comida e água ad libitum.

1. A configuração experimental

1. Instalação da arena
   1. Prepare a configuração experimental, que consiste em uma arena de dois compartimentos (45 cm × 50 cm × 25 cm) feita de paredes de acrílico cinza e um piso branco. Divida os dois compartimentos (25 cm × 45 cm) por uma parede de acrílico cinza (37 cm × 25 cm).
   2. Coloque uma placa de Petri perfurada (60 mm × 15 mm com 7 orifícios de 5 mm de diâmetro) na parte inferior da parede de cada compartimento.
   3. Fixe verticalmente as placas de Petri na parede usando adesivo de dupla face ou adesivo sensível à pressão (por exemplo, Blu-tack).
   4. Coloque uma câmera no topo da arena para registrar o comportamento dos animais (2 m acima da arena) e rastreie automaticamente seus movimentos durante o experimento.
2. Escolha de odores
   1. Antes do experimento, escolha uma lista de odores com valência neutra, positiva e negativa que serão testados (consulte a Tabela 1 para exemplos).
   2. Verifique se todos os odores escolhidos têm pressão de vapor semelhante. Além disso, avalie a difusão por toda a arena para alguns odores com um detector de fotoionização (PID)²⁶.
   3. Teste cada odor em um dia separado.
      NOTA: Recomenda-se planejar primeiro o uso de odores neutros, depois apetitivos e terminar com os odores aversivos para minimizar os efeitos de exploração de um dia para o outro. Essa ordem minimiza os efeitos de transferência de um dia de teste para outro. Alternativamente, uma apresentação aleatória pode ser usada, mas todos os grupos experimentais devem ser testados com a mesma sequência de odor.
3. Planejamento de grupos experimentais
   1. Divida os camundongos em pelo menos dois grupos experimentais: camundongos de controle e camundongos que serão submetidos ao modelo de depressão. Alojar os animais do mesmo grupo nas mesmas gaiolas.
      CUIDADO: Cada grupo experimental deve conter pelo menos aproximadamente 7-8 indivíduos para obter significância estatística. As gaiolas devem ser localizadas nas proximidades do biotério para minimizar o efeito da gaiola.
   2. Induza um fenótipo semelhante ao depressivo em grupos de camundongos relevantes usando o modelo de depressão de escolha.
      NOTA: Descrever protocolos para induzir comportamentos semelhantes à depressão em camundongos está além do escopo deste artigo. No entanto, este estudo apresenta experimentos utilizando dois modelos diferentes (o Estresse Leve Crônico Imprevisível [UCMS] e a Corticosterona [CORT]^)27,28 como resultados representativos para este teste de preferência olfativa. Em breve, o modelo UCMS depende da exposição a uma variedade de diferentes estressores ambientais ao longo de várias semanas, enquanto o modelo CORT consiste na administração crônica de corticosterona dissolvida na água potável de camundongos (cerca de 5 mg / kg / dia, dependendo de quanto os camundongos bebem).

2. Fase de habituação

1. Habituação geral e manuseio
   1. Ao chegar, deixe os ratos intactos por 1 semana sem qualquer troca de cama. Adicione material de algodão suplementar e um iglu na gaiola para reduzir o estresse.
   2. Após 1 semana, manuseie suavemente todos os ratos diariamente por 3-4 dias e habitue-os ao manuseio do copo, de preferência na sala experimental.
2. Condições experimentais do ensaio
   1. Transfira o mouse para a sala de testes comportamentais 30 minutos antes do início do experimento.
      NOTA: Idealmente, a sala comportamental deve incluir duas partes separadas, permitindo que os animais fiquem em uma parte enquanto o rato testado atua na outra.
   2. Esteja ciente de que as condições padrão de alojamento são mantidas (23 ± 1 °C; umidade 40%) e não há som, iluminação ou odor perturbador na sala.
   3. Usando um luxímetro, configure a iluminação para aproximadamente 40 lux na arena. Certifique-se de que a iluminação seja homogênea na arena.
3. Habituação à arena
   1. Adicione um papel de filtro limpo (42,5 mm) em ambas as placas de Petri (60 mm × 15 mm).
   2. Use fita transparente para prender a tampa da placa de Petri ao fundo (porque ela será colocada verticalmente).
   3. No primeiro dia, coloque delicadamente todos os ratos da mesma gaiola juntos na arena por 10 minutos para reduzir a neofobia.
      CUIDADO: Sempre coloque os ratos na arena pelo manuseio do copo para evitar estresse devido ao apanhar pela cauda.
   4. No dia seguinte, introduza cada rato individualmente na arena, apenas entre os dois compartimentos, e registre o comportamento por 10 min.
   5. Repita por 2-3 dias seguidos.
4. Critério de exploração
   1. Defina as duas áreas (25 cm e 15 cm) em que as placas de Petri foram colocadas e meça o tempo que cada animal passa em cada zona.
   2. Faça a média dessas medidas em todas as etapas de habituação individuais.
   3. Se o tempo médio gasto em cada uma das zonas for superior a 50 s, o critério está preenchido. Caso contrário, repetir as sessões de habituação até atingir o critério ou excluir o animal da análise.
      NOTA: Um máximo de duas sessões de habituação podem ser realizadas por dia (manhã e tarde).

3. Fase de teste

1. Preparação do odor
   1. No dia do teste, prepare o odor com a diluição correta sob uma capa química. Dilua o odor em óleo mineral ou água destilada, dependendo da estrutura química. Para evitar contaminação, armazene o óleo mineral em uma sala ventilada separada, longe de odores.
      NOTA: O uso de uma nova garrafa de óleo mineral é recomendado ao iniciar um novo experimento.
   2. Armazene a solução odorífera em um frasco de vidro. Evite recipientes de tubos de plástico que possam adicionar contaminação por odores.
   3. Imediatamente antes de cada camundongo ser testado, colete 200 μL da solução de odor com uma micropipeta usando pontas de filtro e coloque-a no papel de filtro em uma das duas placas de Petri.
   4. Deixar o outro papel de filtro da segunda placa de Petri intocado.
   5. Transfira as placas de Petri na sala de testes e fixe-as verticalmente na parede da arena.
      CUIDADO: Não prepare e jogue fora as soluções odoríferas na sala experimental para evitar contaminação por odores. Troque as luvas regularmente durante o experimento. Se houver suspeita de que as luvas podem estar contaminadas durante a manipulação do odor, troque-as antes de pegar os ratos para teste.
2. Teste comportamental
   1. Coloque cada mouse individualmente na arena, apenas entre os dois compartimentos.
   2. Gravar por 10 min.
   3. Remova o mouse da arena.
   4. Remova o odor placa de Petri.
   5. Limpe a arena com uma solução desinfetante (por exemplo, etanol 70%) e seque-a.
   6. Jogue fora o papel de filtro e repita a preparação do odor para o próximo mouse.
   7. O ideal é testar apenas um odor por dia. Preferencialmente, use odores neutros primeiro, depois odores positivos e, finalmente, odores negativos (veja a Figura 1).
      CUIDADO: Realize as etapas de habituação e teste aproximadamente na mesma hora do dia durante os dias do experimento (idealmente entre 9h e 15h). Se o número de animais exigir um período de tempo mais longo, esteja atento para testar diferentes grupos experimentais de maneira alternada para evitar qualquer viés diurno. Se machos e fêmeas precisarem ser testados no mesmo experimento, prefira testar um sexo após o outro.
      NOTA: Use placas de Petri limpas todos os dias do teste para evitar a contaminação por odores. É importante observar que as placas de Petri perfuradas podem ser reutilizadas para vários experimentos após a limpeza adequada e a descontaminação do odor.

4. Análise dos dados

1. Rastreamento de comportamento
   1. Use um programa de rastreamento automático para registrar a posição do mouse durante os testes.
   2. Defina zonas separadas na arena para análise (consulte a Figura 1):
      1. Defina uma "zona de odor" (25 cm × 15 cm), a área onde a placa de Petri é colocada com o papel de filtro embebido com o odor (ou seja, a área mais próxima do odor representando cerca de um terço do compartimento da superfície).
      2. Defina uma "zona de controle" (25 cm × 15 cm), simétrica à "zona de odor", mas sem nenhum odor adicionado na placa de Petri.
      3. Defina uma "zona de odor atrás" (25 cm × 30 cm), ou seja, o resto do compartimento é onde a placa de Petri de odor é colocada.
      4. Defina uma "zona de controle atrás" (25 cm × 30 cm), simétrica à "zona de controle atrás", consistindo no resto do compartimento sem odor.
         NOTA: O rastreamento do ponto central do corpo do camundongo é suficiente para analisar a preferência olfativa do animal. No entanto, rastrear o nariz de cada camundongo especificamente pode ilustrar com mais precisão a investigação olfativa do animal.
2. Leituras da resposta hedônica
   1. Usando o rastreamento automático, colete as seguintes informações para cada mouse e todos os dias do teste, incluindo etapas de habituação:
      1. Registre a distância total percorrida na arena (m).
      2. Registre o tempo gasto em cada zona da(s) arena(s).
      3. Registre o número de entradas em cada zona da arena.
   2. Use a distância total percorrida para avaliar os principais efeitos locomotores.
   3. Para avaliar as diferenças na preferência olfativa por vários odores, use as leituras principais:
      1. Use o tempo gasto na zona de odor.
      2. Use o número de entradas na zona de odor.
      3. Use um índice de preferência, calculado como o tempo gasto na zona de odor normalizado para o tempo gasto nesta zona durante a habituação (a normalização é realizada em camundongos de todos os grupos). A média refere-se à média aritmética do tempo gasto na zona odorífera e sd refere-se ao seu desvio padrão.
         
      4. Use um índice de exploração de odor, calculado como a média dos valores normalizados de distância percorrida, tempo gasto na zona de odor e número de entradas na zona de odor da seguinte forma:
         
         
         NOTA: Este índice de preferência pode ser adaptado se necessário, por exemplo, comparando os tempos passados na zona de odor versus zona de controle. Se os grupos mostrarem diferenças significativas em sua exploração da "zona de odor" durante a habituação, a normalização pode ser realizada apenas em relação ao grupo de controle, em vez de todos os grupos combinados.
   4. Represente visualmente essas leituras para camundongos de controle e depressivos como média ± erro padrão da média (SEM).
   5. Use a análise de variância bidirecional de medidas repetidas (ANOVA) seguida de testes post hoc (aqui o teste de diferença menos significativa de Fisher não corrigido) para levar em conta os grupos experimentais, odores (fator de medição repetida) e fatores de efeito de interação. O fator de interação indica se as diferenças entre os grupos são consistentes em todos os odores apresentados.
   6. Verificar normalidade e homocedasticidade por meio de testes adaptados (teste de Shapiro-Wilk, teste de Bartlett). A significância estatística foi estabelecida em *p < 0,05, **p < 0,01, *** p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultados

Para verificar que camundongos do tipo depressivo apresentam um viés olfatório negativo^14,29 e que ele pode ser medido de forma confiável usando o protocolo do teste de preferência olfativa que descrevemos aqui, avaliamos a resposta hedônica a diferentes odores em dois modelos distintos de depressão em camundongos.

Primeiro, usamos um modelo de camundongo de estresse leve crônico imprevisível (UCMS) com duração de 4 semanas adaptado de²⁸ (consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter o protocolo detalhado) para induzir um fenótipo semelhante ao depressivo em camundongos C57BL / 6JRj fêmeas jovens (Figura 2A, B). Essas fêmeas foram testadas no teste de preferência olfativa com urina de camundongo macho (MU, pura) como odor apetitivo e 2,4,5-trimetiltiazol (TMT, 5% em óleo mineral) como odor aversivo. Em média, cada camundongo passou pelo menos 50 s na zona de "controle" e "odor" durante a habituação, cumprindo o critério (Figura 2C). No entanto, por meio da habituação, os camundongos UCMS passaram significativamente mais tempo na "zona de controle" em comparação com os controles, mas como não há diferença significativa em relação à zona onde o odor será adicionado, essa diferença pode ser descartada. Em relação à distância, os camundongos controle se moveram significativamente mais do que o UCMS quando expostos ao MU, mas não durante a habituação ou na presença de TMT (Figura 2D). Finalmente, todas as leituras da resposta hedônica (tempo gasto na zona de odor, número de entradas na zona de odor e índice de preferência) mostram diferenças significativas ou uma tendência estatística entre as mulheres Controle e UCMS (Figura 2E-G). Esse efeito também é visível através do índice global de exploração de odores, que é uma medida combinada da resposta hedônica e locomotora (Figura 2H). Consistentemente, cada leitura demonstra um viés hedônico negativo em resposta a estímulos olfativos apetitivos e aversivos. Curiosamente, o escore de emocionalidade, que é calculado como um valor normalizado do fenótipo semelhante à ansiedade e depressão com base em uma grande bateria de testes comportamentais¹⁴, está positivamente correlacionado com o índice de exploração de odor de MU e TMT (Figura 2I), mostrando uma relação entre a resposta comportamental a odores positivos e negativos e o fenótipo semelhante à ansiedade e depressão.

Em segundo lugar, usamos o mesmo protocolo UCMS para induzir um fenótipo semelhante ao depressivo em camundongos machos desta vez. Durante o Teste de Preferência Olfativa, esses camundongos foram expostos à urina de camundongo fêmea (FU, pura), que é apetitosa, e TMT como anteriormente, como odor negativo (Figura 3A, B). Não há diferença no tempo gasto nas quatro zonas durante a habituação, nem na distância percorrida no teste (Figura 3C,D). O tempo gasto na zona de odor mostra uma redução significativa da exploração de FU e TMT no UCMS em comparação com os controles (Figura 3E). Além disso, os camundongos UCMS entram significativamente menos na zona de odor, ou tendem a fazê-lo, e apresentam um índice de preferência significativamente reduzido para FU e TMT ( Figura 3F, G ), confirmando um viés olfativo negativo em um estado depressivo. Da mesma forma, o índice de exploração de odor mostra uma resposta comportamental negativamente deslocada à FU e TMT de camundongos UCMS em comparação com os controles (Figura 3H), que tendem a ser positivamente correlacionados com o escore de emocionalidade dos animais (Figura 3I).

Em um terceiro experimento, recorremos a outro modelo de depressão que se baseia na administração crônica de corticosterona (CORT) na água potável de camundongos C57BL / 6NTac machos, enquanto os camundongos controle recebem apenas a solução veículo (Veh) (10% 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina) ²⁷. Após quatro semanas de tratamento com CORT ou Veh, os camundongos foram habituados por quatro dias e, em seguida, expostos a um odor neutro (OCT: 2-transoctenal, 1% em água), um odor positivo (PO: óleo de amendoim) e um odor negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazol, 5% em óleo mineral) (Figura 4A, B). Por meio da habituação, não houve diferenças entre Veh e CORT (Figura 4C). No entanto, ambos os grupos passaram significativamente mais tempo na "zona de odor" em comparação com a "zona de controle". Não há diferenças para a distância percorrida, exceto para o odor positivo (PO) para o qual os camundongos Veh se moveram mais do que o CORT (Figura 4D). É importante ressaltar que, como para camundongos UCMS, o tempo gasto na zona de odor foi significativamente reduzido para camundongos CORT quando expostos a um odor neutro e apetitivo ( Figura 4E ). A exploração reduzida de odores também é visível por meio de uma redução significativa ou tendência a um menor número de entradas na zona de odor (Figura 4F). Nesse caso, as diferenças entre os grupos são reveladas dependendo da leitura analisada, provavelmente devido às limitações relacionadas ao número de animais utilizados, bem como a um potencial efeito de piso causado pelo baixo tempo de exploração observado após a exposição ao TMT. No geral, o índice de preferência é significativamente menor em camundongos CORT para todos os estímulos de odor em comparação com Veh (Figura 4H). Finalmente, o índice de exploração de odores para todos os odores está significativamente correlacionado com o escore de emocionalidade dos animais (Figura 4I), demonstrando mais uma vez que este teste de preferência olfativa é uma ferramenta adequada para avaliar o viés emocional negativo em vários modelos de depressão em camundongos.

Finalmente, podemos descartar a possibilidade de que as diferenças observadas possam ser causadas por uma redução na atividade locomotora, e não por vieses emocionais. De fato, a locomoção não difere entre os grupos durante a habituação ao avaliar a distância total percorrida (Figura 2D, Figura 3D, Figura 4D). Além disso, com base na análise estatística, uma redução geral no engajamento da tarefa ou um efeito de novidade também não pode explicar esses vieses. De fato, encontramos um efeito significativo do fator odor na análise do índice de preferência, sem interação significativa entre os grupos experimentais e os odores. Esses resultados demonstram que camundongos depressivos realmente realizam a tarefa e que sua exploração reduzida é específica para cada pista olfativa.

Figura 1: Esquema geral da linha do tempo e configuração do teste de preferência olfativa. Os ratos são os primeiros habituados à arena. No primeiro dia de habituação, os ratos da mesma gaiola são colocados juntos para reduzir a neofobia. No dia seguinte, eles são colocados individualmente na arena. Após a habituação, um odor é adicionado a uma das câmaras. Os odores neutros são preferencialmente testados primeiro, seguidos por odores positivos e, finalmente, odores negativos. Para análise, a arena pode ser dividida em quatro zonas diferentes. Criado com Biorender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Viés olfativo negativo em um modelo de depressão em camundongo fêmea UCMS. (A, B) Linha do tempo e grupos experimentais do estudo: Camundongos fêmeas controle e UCMS (Estresse Leve Crônico Imprevisível) são testados no Teste de Preferência Olfativa com odor positivo (MU: urina de camundongo macho, pura) e negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazol, 5% em óleo mineral). Criado com Biorender. (C) Os camundongos UCMS passaram, em média, significativamente mais tempo na "zona de controle" e menos tempo na "zona de odor atrás" em comparação com os controles durante a habituação (Grupo: F (1, 12) = 74,03, p < 0,0001; Zona: F(2,434, 29,21) = 7,688, p = 0,0012; Interação: F(3, 36) = 5,148, p = 0,0046). (D) A distância total percorrida diminuiu significativamente no UCMS quando exposto à MU, mas não para Habituação (Hab) e TMT (Grupo: F (1, 12) = 4,664, p = 0,0518; Odor: F(1,871, 22,45) = 4,846, p = 0,0195; Interação: F(2, 24) = 4,797, p = 0,0177). (E) Os camundongos UCMS gastaram significativamente menos tempo explorando MU e TMT (Grupo: F (1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Odor: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Interação: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (F) Os camundongos UCMS entraram menos do que a zona de odor ou tenderam a (Grupo: F (1, 12) = 9,279, p = 0,0102; Odor: F(1, 12) = 5,100, p = 0,0433; Interação: F(1, 12) = 1,649, p = 0,2233). (G) O índice de preferência por MU e TMT é significativamente reduzido em camundongos UCMS (Grupo: F (1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Odor: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Interação: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (H) O índice de exploração de odor para MU e TMT é significativamente reduzido em camundongos UCMS (F (1, 12) = 14,71, p = 0,0024; Odor: F(1, 12) = 0, p > 0,9999; Interação: F(1, 12) = 0,02630, p = 0,8739). (I) O índice de exploração de odores para MU e TMT está positivamente correlacionado com o escore de emocionalidade dos animais (MU: Pearson R² = 0,4837, F(1,12) = 11,24, **p = 0,0058; TMT: Pearson R² = 0,5340, F(1,12) = 13,75, **p = 0,0030). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Viés olfativo negativo em um modelo de depressão em camundongo macho UCMS. (A, B) Linha do tempo e grupos experimentais do estudo: Camundongos machos controle e UCMS são testados no Teste de Preferência Olfativa com odor positivo (FU: urina de camundongo fêmea, pura) e negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazol, 5% em óleo mineral). Criado com Biorender. (C) Não há diferenças em média no tempo gasto nas diferentes zonas da arena por habituação (Grupo: F(1, 13) = 3,921, p = 0,0693; Zoner = F(1,688, 21,94) = 34,57, p < 0,0001; Interação: F(3, 39) = 0,7385, p = 0,5355). (D) Não há diferenças na distância total percorrida entre os controles e o UCMS (Grupo: F (1, 13) = 2,313, p = 0,1522; Odor: F(1,722, 22,38) = 1,746, p = 0,1998; Interação: F(2, 26) = 0,8806, p = 0,4266). (E) O tempo gasto explorando a zona de odor com FU e TMT é significativamente reduzido em camundongos UCMS (Grupo: F (1, 13) = 6,808, p = 0,0216; Odor: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Interação: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753). (F) Os camundongos UCMS entraram significativamente menos vezes na zona de odor para TMT e tenderam para FU (Grupo: F (1, 13) = 6,572, p = 0,0236; Odor: F(1, 13) = 3,784, p = 0,0737; Interação: F(1, 13) = 0,2145, p = 0,6509). (G) O índice de preferência dos camundongos UCMS é significativamente reduzido para FU e TMT (Grupo: F(1,13) = 6,808, p = 0,0216; Odor: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Interação: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753); (H) O índice de exploração de odores do UCMS é significativamente reduzido para ambos os odores (Grupo: F(1, 13) = 12,42, p = 0,0037; Odor: F(1, 13) = 0,002580, p = 0,9603; Interação: F(1, 13) = 0,5804, p = 0,4598). (I) O índice de exploração de odores para FU e TMT tende a estar positivamente correlacionado com o escore de emocionalidade dos animais (FU: Pearson R² = 0,2573, F(1, 13) = 4,504, p = 0,0536; TMT: Pearson R² = 0,2266, F(1, 13) = 3,809, p = 0,0729). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Viés olfatório negativo em um modelo de depressão em camundongos machos CORT. (A,B) Linha do tempo e grupos experimentais do estudo: Camundongos machos Veh e CORT são testados no Teste de Preferência Olfativa com odor neutro (OCT: trans-2-octenal, 1% em água), positivo (PO: óleo de amendoim, puro) e negativo (TMT: 2,4,5-trimetiltiazol, 5% em óleo mineral). Camundongos Veh e CORT são administrados com a solução Vehicle e Vehicle + Corticosterone, respectivamente, durante toda a duração do experimento. Criado com Biorender. (C) Tempo médio gasto nas diferentes zonas da arena durante a habituação (Grupo: F(1, 10) = 0,07588, p = 0,7886; Zona: F(2,224, 22,24) = 6,939, p = 0,0036; Interação: F(3, 30) = 0,7033, p = 0,5575). (D) Distância total percorrida durante o teste de Habituação (Hab) e os diferentes odores (Grupo: F(1, 10) = 4,193, p = 0,0678; Odor: F(3, 30) = 11,80, p < 0,0001; Interação: F(3, 30) = 1,489, p = 0,2375). (E) Os camundongos CORT passam menos tempo na zona de odor do que o Veh para OCT e PO (Grupo: F (1, 10) = 5,094, p = 0,0476; Odor: F(2, 20) = 28,87, p < 0,0001; Interação: F(2, 20) = 3,841, p = 0,0388). (F) Camundongos CORT entram menos vezes na zona de odor ou tendidos em comparação com Veh (Grupo: F(1, 10) = 6,832, p = 0,0259; Odor: F(2, 20) = 2,738, p = 0,0889; Interação: F(2, 20) = 0,2902, p = 0,7512). (G) Os qmics CORT apresentam menor índice de preferência para OCT e PO (Grupo: F(1, 10) = 5,895, p = 0,0356; Odor: F(2, 20) = 20,83, p < 0,0001; Interação: F(2, 20) = 1,437, p = 0,2611). (H) O índice de exploração de odores é significativamente reduzido em camundongos UCMS para todos os odores (Grupo: F (1, 10) = 12,35, p = 0,0056; Odor: F(2, 20) = 0,04381, p = 0,9572; Interação: F(2, 20) = 0,3622, p = 0,7006). (I) O índice de exploração de odores para cada odor está positivamente correlacionado com o escore de emocionalidade dos animais (OCT: Pearson R² = 0,5601, F(1, 10) = 12,73, **p = 0,0051; PO: Pearson R² = 0,4495, F(1, 10) = 8,165, *p = 0,0170; TMT: Pearson R² = 0,5061, F(1, 10) = 10,25, **p = 0,0095). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome	Abreviação	Diluição	Valência
2,4,5-Trimetiltiazol	TMT	5% em óleo mineral	Negativo
2-trans-octenal	OUTUBRO	1% em água	Neutro
Urina fêmea do rato	FU	Puro	Positivo
Urina de rato macho	MU	Puro	Positivo
Óleo de amendoim	PO	Puro	Positivo

Tabela 1: Exemplos de odores com valência neutra, positiva e negativa.

Arquivo Suplementar 1: Protocolo para estresse leve crônico imprevisível de 4 semanas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O viés emocional negativo é uma característica importante dos transtornos depressivos e é de particular interesse para entender melhor a fisiopatologia da doença. Portanto, é crucial incluir a avaliação de vieses sensoriais em modelos pré-clínicos para melhorar a caracterização do fenótipo depressivo e investigar quais mecanismos biológicos estão subjacentes ao processamento emocional e suas alterações em condições patológicas. Além disso, o olfato é um senso de escolha para estudar vieses emocionais. De uma perspectiva translacional, é etologicamente relevante avaliar o processamento emocional tanto em camundongos quanto em humanos. Além disso, os sistemas olfativo e emocional estão altamente interligados e compartilham estruturas neuronais comuns ao longo da evolução. Existe uma forte relação recíproca entre o olfato prejudicado e a depressão¹⁰, o que torna o olfato uma ferramenta promissora e poderosa a ser usada para o diagnóstico e a capacidade de resposta ao tratamento, bem como na pesquisa fundamental.

Aqui, desenvolvemos um protocolo para um teste de preferência olfativa para avaliar vieses emocionais olfativos em dois modelos de depressão em camundongos. É importante ressaltar que esse método permite a avaliação da resposta a uma grande variedade de estímulos com valência variável, tanto positivos quanto negativos, bem como estímulos neutros que podem ser alterados em valor em condições patológicas. Esses estímulos posteriores não são obrigatórios para a validade do teste, mas podem trazer informações adicionais interessantes para o experimento. Este teste também permite avaliar a escalabilidade da resposta usando diferentes concentrações de odor. Avaliar a resposta a estímulos com diferentes valores hedônicos e separar o processamento emocional positivo do negativo no contexto da depressão é crucial. De fato, os resultados pré-clínicos indicam que o tratamento antidepressivo pode não restaurar uniformemente o processamento olfativo igualmente positivo e negativo¹⁴. A exploração espontânea de estímulos olfativos apetitivos ou aversivos inatamente salientes também previne fatores de confusão de déficits cognitivos ou motivacionais associados a estados depressivos^30,31. Portanto, este protocolo não requer longas fases de aprendizado, o que traz benefícios técnicos. É importante notar que ambos os modelos utilizados neste estudo dependem de intervenções realizadas na idade adulta, portanto, experimentos futuros serão necessários para avaliar se este protocolo também é sensível à avaliação de outros fatores de risco de depressão, incluindo adversidades no início da vida.

É importante ressaltar que este protocolo é aplicável a indivíduos do sexo masculino e feminino, o que é crítico, pois as mulheres têm duas vezes mais chances de serem afetadas pela depressão do que os homens. No entanto, os homens provavelmente são subdiagnosticados de depressão devido a expectativas sociais, vergonha ou estigma, conforme revisado em Shi et ^al.32. No entanto, a depressão parece diferir entre homens e mulheres, em termos de sintomatologia (manifestações clínicas), etiologia (causas biológicas) e previsibilidade do tratamento 33,34,35, mas muitos modelos e testes de depressão ainda são projetados principalmente para indivíduos do sexo masculino. Por exemplo, o teste padrão de cheirar urina feminina²⁴ usa um protocolo semelhante, mas depende de uma sugestão de odor social única. Embora muito informativo, este teste resulta em um curto tempo de exploração (30 s nos controles) e é adaptado principalmente para camundongos machos, pois a urina feminina não tem o mesmo significado etológico e hedônico para ambos os sexos. Finalmente, parece que a resposta hedônica olfativa é sensível ao tratamento antidepressivo¹⁴, tornando nosso teste uma ferramenta de escolha para caracterizar de forma confiável estados depressivos, substituindo outros ensaios controversos como o teste de nado forçado^{36 , 37 , 38} .

É importante ressaltar que o teste resulta em tempos de exploração de estímulo mais longos (100-200 s) em comparação com os testes descritos anteriormente^{21 , 22 , 23} . O aumento da duração da exploração é particularmente importante quando este teste é combinado com técnicas de monitoramento ao vivo da atividade neuronal, por exemplo. Além disso, este teste não requer privação de comida/água, evitando fatores de confusão metabólicos. Finalmente, este teste pode ser realizado durante o período de luz, reduzindo as restrições experimentais (ciclo inverso, registros infravermelhos).

No entanto, para realizar este protocolo com sucesso, algumas etapas técnicas são críticas. Em primeiro lugar, é essencial que os experimentos sejam realizados em um ambiente muito controlado e não estressante: a iluminação deve ser homogênea e não muito brilhante, e não deve haver som ou odor perturbador na sala. Os ratos podem ser testados na arena uma vez por dia, e o teste deve ser realizado aproximadamente no mesmo horário todos os dias. Além disso, um experimentador exclusivo é recomendado ao realizar esses experimentos para reduzir o estresse animal.

Em segundo lugar, deve ser garantida uma exploração suficiente da arena por meio de dias de habituação. Se um camundongo gasta menos de 50 s em média em qualquer uma das zonas onde as placas de Petri são colocadas durante a habituação, um ou dois dias suplementares de habituação podem ser adicionados antes de testar os odores. Se o mouse ainda não estiver explorando a arena por tempo suficiente, ele deve ser excluído da análise. No caso de exploração dissimétrica inicial da "zona de odor" durante a habituação entre grupos experimentais, o cálculo do índice de preferência pode ser adaptado para corrigir vieses de preferência espontânea diferencial, por exemplo, normalizando pelo tempo gasto durante a habituação em relação a cada grupo, ou mesmo em relação à sua própria exploração durante a habituação. De fato, outra dificuldade pode ser a alta variabilidade entre os grupos experimentais. Se o problema surgir, para limitar a variabilidade intraindividual, os camundongos podem ser testados em dois dias consecutivos com o mesmo odor. Os resultados podem então ser calculados entre os dois dias. É importante ressaltar que o teste consecutivo da resposta olfativa não deve afetar significativamente o comportamento exploratório¹⁴.

Em relação à preparação do odor, as soluções devem ser preparadas em uma sala diferente do teste, e os experimentadores devem estar cientes de que a solução não se difunde excessivamente na sala comportamental. Finalmente, as soluções devem ser preparadas preferencialmente pouco antes do teste e armazenadas em um frasco de vidro sem odor para que o odor não desapareça ou seja contaminado. Para alguns odores, como urina de camundongo macho e fêmea, que são supostamente muito apetitosos, se os camundongos controle não apresentarem leituras de exploração associadas a valência altamente positiva, a solução deve ser verificada. Em particular, a urina de ratinho deve ser recentemente recolhida de ratinhos jovens (máximo de 5 meses de idade) pouco antes do ensaio (máximo de 2 a 3 dias antes) e conservada a 4 °C para preservar as propriedades olfativas. É importante observar que a coleta de vários dias consecutivos deve evitar efeitos devido aos estágios do ciclo estral em camundongos fêmeas. Se necessário, a urina pode ser mantida a -20 °C para armazenamento a longo prazo, embora este procedimento não seja recomendado, pois reduz sensivelmente a intensidade do odor. Da mesma forma, a agradabilidade percebida do óleo de amendoim também pode ser variável, dependendo do lote ou marca, por exemplo. É importante ressaltar que dois odores distintos ou odores com concentrações diferentes podem ser adicionados nos compartimentos, em vez da "zona de controle" sem odor, para medir a preferência entre duas soluções odorantes.

Finalmente, o teste de preferência olfativa pode ser adaptado de várias maneiras para melhorar seu design e ampliar suas aplicações potenciais. De fato, além da leitura motora, a avaliação da resposta emocional por meio desse teste pode ser melhorada combinando diferentes técnicas para medir vários componentes das emoções⁶. Por exemplo, um microfone de ultrassom pode ser colocado próximo à arena para gravar vocalizações ultrassônicas, que podem ser emitidas em resposta a certos estímulos positivos e negativos^24,39. A temperatura corporal também pode ser monitorada usando uma câmera infravermelha ou um transmissor de telemetria implantável em tempo real 40,41,42. Alguns desses transmissores são capazes de acessar as frequências cardíaca e respiratória 43,44,45. A combinação dessas ferramentas ajudaria a construir uma avaliação comportamental mais refinada da resposta emocional. O teste de preferência olfativa também pode ser facilmente acoplado a outras técnicas para elucidar ainda mais os mecanismos neuronais por trás da desregulação emocional, como optogenética, fotometria de fibra ou imagens ao vivo de mini-escopo ou gravações de eletrofisiologia in vivo. Por fim, este protocolo pode ser facilmente traduzido para a clínica, integrando a avaliação de vieses sensoriais e resposta olfativa hedônica em pesquisas humanas e até mesmo como uma ferramenta de resposta diagnóstica ou de tratamento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2,4,5-Trimetiltiazol	Sigma-Aldrich	W332518-100G-K
2-trans octenal	Sigma-Aldrich	Rolamento 52464-1ML
Blu-tack	UHU	N/A
Papel de filtro	Fisher Científico	11710125	42,5 milímetros
Frasco de vidro	HOLANDÊS DOMINIQUE	958983
Óleo mineral	Sigma-Aldrich	M5904-500ML
Noldus Ethovision	Noldus Ethovision	Versão 17.5	Alternativamente, o Single Mouse Tracker no software ICY de código aberto ou Deeplabcut pode ser usado
Placa de Petri	Falcão	351007	Placa de Petri de 60 mm x 15 mm com 7 furos feitos sob medida de 5 mm de diâmetro
Arena de acrílico	Feito sob medida	N/A	Arena de acrílico de 45 cm x 50 cm x 25 cm dividida em duas câmaras por uma parede de 37 cm x 25 cm no meio.