Gerando co-culturas de esferóides epiteliais-fibroblastos humanos normais flutuantes

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo simples e muito prático, mas confiável, para co-cultivo esferoidal direto de células epiteliais pulmonares humanas e fibroblastos sem depender de uma matriz.

Resumo

Os sistemas de cultura tridimensionais (3D) tornaram-se cada vez mais populares devido à sua capacidade de reproduzir propriedades e arquiteturas celulares naturais, imitando estruturas semelhantes a tecidos in vitro. Entre esses modelos, a cultura de agregados celulares esféricos (os chamados esferoides) incorporados em uma matriz extracelular (MEC) semissólida representa um modelo avançado de cultura de células quase in vivo , pois permite diferentes estados funcionais da célula como resultado de interações célula-célula e célula-MEC, bem como gradientes de oxigênio e nutrientes. Como os esferoides são tecnicamente menos exigentes e relativamente baratos de obter, eles são frequentemente usados na triagem de medicamentos e testes de toxicidade, permitindo a triagem de alto conteúdo para testar novos medicamentos na fase pré-clínica. Para isso, estruturas 3D de vários tumores são predominantemente recriadas. Ao mesmo tempo, o Matrigel é atualmente um dos ECMs mais utilizados e é considerado o padrão-ouro no cultivo de esferóides e organoides, embora esta seja uma matriz 3D baseada em experimentos com camundongos, cuja extração - como os testes em animais em geral - está associada a grandes preocupações éticas. Aqui, apresentamos um protocolo livre de matriz para co-cultivo esferoidal direto de células epiteliais brônquicas humanas e fibroblastos, que pode ser considerado como um método de co-cultivo otimizado, especialmente no que diz respeito à comunicação epitelial-fibroblasto e interações dentro dos respectivos esferoides, sem depender de uma matriz transportadora (baseada em animais). Ao estabelecer essas co-culturas esferóides epiteliais e fibroblastóides flutuantes como uma plataforma in vitro orientada para o paciente para modelar toxicidades de tecido normal (pulmão) de abordagens terapêuticas de câncer, não apenas uma redução no número de animais experimentais, mas também uma substituição adequada e significativa de experimentos animais correspondentes pode ser alcançado.

Introdução

As culturas de células bidimensionais (2D), nas quais as células planas de monocamada são cultivadas, expandidas e depois plaqueadas para ensaios de pesquisa baseados em células, continuam sendo um método fácil, conveniente, econômico e amplamente utilizado para procedimentos de triagem pré-clínica padrão ^1,2. Para estudar a diafonia interativa (parácrina) entre vários tipos de células in vitro, um meio condicionado de um tipo de célula para estimulação de outro tipo de célula pode ser usado. Além disso, surgiram vários métodos de co-cultura, por exemplo, métodos indi....

Protocolo

Todas as etapas são realizadas em condições estéreis (gabinete de biossegurança). Para as composições de mídia usadas neste estudo, consulte a Tabela 1.

1. Preparação do material experimental

1. Cultive e expanda células epiteliais pulmonares normais humanas (HBEC3-KT) em placas de cultura de células plásticas padrão (frascos T75) em meio de crescimento epitelial normal usando uma incubadora padrão¹³ (ver Tabela 1).
   NOTA: Para melhorar o crescimento, o meio pode ser adicionalmente suplementado com 10% de soro fetal de bez....

Resultados

Este protocolo simples permite o co-cultivo esferoidal livre de matriz de células epiteliais brônquicas humanas e fibroblastos em combinação com placas de fixação ultrabaixas (Figura 1A). Durante o processo de cultivo, esferoides pulmonares mais complexos formam-se gradualmente a partir dos esferoides inicialmente gerados, com a geração eficiente de diferentes estruturas epiteliais e fibroblásticas representando interações celulares diretas, conforme revelado por análises morfológicas usando.......

Discussão

Modelos de cultura de células 3D têm sido propostos para preencher a lacuna entre culturas 2D e estudos in vivo, pois esse tipo de (co-)cultura imita melhor as propriedades fisiológicas, morfológicas e patológicas presentes in vivo porque mais interações célula-célula, interações célula-ECM, respostas a estímulos, expressão gênica, expressão proteica e diferenciação estão presentes^{17, 18}. Além dos numer.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipetas sorológicas estéreis de 10 mL	Pipetas serológicas estéreis	ThermoFischer	170356N
tubo cónico equivalente de 15 ml	Corning	430052	ou equivalente
37 ° C/ 5% CO2 umidificado  incubadora
5 mL pipetas sorológicas estéreis	Pipetas sorológicas estéreis	ThermoFischer	170355N
tubo cônico equivalente de 50 mL	Corning	CLS430829	ou
equivalente ATRA (All-Trans Retinoic Acid)	StemCell Technologies	Cat#72262	50 nM
B-27 Suplemento (50x),	ThermoFischer/Gibco	Cat#17504044	1x
BD Rhapsody WTA Amplification Kit	BD Bioscience	Cat#633801	use de acordo com as instruções do fabricante
			biossegurança
Albumina de soro bovino	Roche	Cat#BSAVHS-RO	0,4% (v/v)
Filtro de células	Corning	352350	Falcon 70 µ m Cell Strainer, Branco, Estéril, Embalado Individualmente
Centrífuga	Eppendorf	https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001	por exemplo, Eppendorf Centrifuge 5804 - Centrífuga de Bancada
DMEM/F12	Invitrogen	Cat#11330-032	500 mL
DNase I, livre de RNase (1  U/μ L)	ThermoFischer	Cat#EN0521	100 U/mL
EDTA (0,5 M), pH 8,0,	ThermoFischer	AM9260G	2 mM
Eppendorf Research mais pipeta multicanal de 12 canais	Eppendorf		, por exemplo, # 3125000044 (10– 100 µ L) ou # 3125000060 (30– 300 µ L)
Soro fetal para bezerros	ThermoFischer/Gibco	Cat#A5256701	10% (v/v)
HBEC3-KT	de células epiteliais pulmonares normais humanas	ATCC	CRL-4051
Solução de Heparina (0.2%)	StemCell Technologies	Cat#7980	0.8 mL
Hoechst 33342	ThermoFischer	Cat#H1399	1 µ g/mL
HS-5	Fibroblastos estromais humanos	ATCC	CRL-3611
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACF	StemCell Technologies	Cat#78173.1	10 ng/mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF	StemCell Technologies	Cat#78186.1	de 10 ng/mL
	BD Bioscience	Cat#633781	use de acordo com as instruções do fabricante
Solução de estoque de hidrocortisina	StemCell Technologies	Cat#7926	0,5 mL por 500 mL
Laduviglusib (CHIR-99021)	Biozol/Selleckchem	Cat#S1263	3 µ
M L-Ácido Ascórbico	Sigma-Aldrich	Cat#A92902	50 µ g/mL
Microscópio	ZEISS
Monotioglicerol	Sigma-Aldrich	Cat#M6145	0.4 µ
M N-2 Suplemento (100x)	ThermoFischer/Gibco	Cat#17502048	1x
câmara de contagem Neubauer	Merck	BR718605	por exemplo, MARCA  câmara de contagem BLAUBRAND  Padrão Neubauer
Soro de cabra normal	ThermoFischer	Cat#31873	2% (v/v) em PBS
NP-40	Merck/Millipore	Cat#492016	NP-40-Alternative, 1
Kit de coloração PAS	Sigma Aldrich	Cat#1016460001	use de acordo com as instruções do fabricante
PBS	ThermoFischer	Cat#10010023	1x
Penicilina-Estreptomicina (10.000  U/mL), 100x	ThermoFischer/Gibco	Cat#15140122	1x
PFA	ThermoFischer	Cat#J61899. AK	Paraformaldeído, 4% em PBS
PneumaCult Meio de Diferenciação de Organoides das Vias Aéreas (ODM)	StemCell Technologies	Cat#05060	PneumaCult Organoid das Vias Aéreas Basal Medium (#05061, 360 mL) e PneumaCult Airway Organoid Differentiation Supplement* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus Medium	StemCell Technologies	Cat#5040	Kit composto por PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (#05041, 490 mL) e PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL)
Coquetel inibidor de protease	Merck/Roche	Cat#4693132001	1 comprimido/10 mL
Kit de cDNA de rapsódia	BD Bioscience	Cat#633773	use de acordo com as instruções do fabricante
RPMI 1640 Médio	ThermoFischer/Gibco	Cat#11875093	500 mL
Cloreto de Sódio	Merck/Sigma-Aldrich	S9625	150 mmol/L
Citrato de Sódio	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#1613859-1G	0.10%
Desoxicolato de Sódio	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#30970	0.50%
Dodecil Sulfato de Sódio	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#11667289001	0,10%
Reservatório de reagente estéril para micropipeta multicanal (por exemplo, 60 ml)	ThermoFischer	9510037	ou equivalente
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ck	Sarstedt (ou facellitate)	83.3925.400 (ou F202003)	placa de fixação ultra-baixa
Tris/HCl	ThermoFischer	Cat#AM9855G	50 mmol/L , pH 8
Triton  X-100	Sigma-Aldrich	Cat#X100-5ML	0.05 %
Mancha azul de tripano (0,4%)	ThermoFischer	Cat#15250061	1/5 (v/v) com NGM
TrypLE	ThermoFischer	Cat#12604013	1x
tripsina-EDTA (0,5%)	ThermoFischer	Cat#15400054	solução de tripsina-EDTA (TE) a 0,05% diluída assepticamente a 1X usando solução salina tamponada com fosfato (sem cálcio e magnésio)
Reagente WST-1	CELLPRO-RO, Roche	Cat#5015944001	reagente de proliferação celular

Nunc, ou Nunc, ouGabinete de sem RNase Linha   Kit de Multiplexação de Célula Única Humana %