Gerando co-culturas de esferóides epiteliais-fibroblastos humanos normais flutuantes

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo simples e muito prático, mas confiável, para co-cultivo esferoidal direto de células epiteliais pulmonares humanas e fibroblastos sem depender de uma matriz.

Resumo

Os sistemas de cultura tridimensionais (3D) tornaram-se cada vez mais populares devido à sua capacidade de reproduzir propriedades e arquiteturas celulares naturais, imitando estruturas semelhantes a tecidos in vitro. Entre esses modelos, a cultura de agregados celulares esféricos (os chamados esferoides) incorporados em uma matriz extracelular (MEC) semissólida representa um modelo avançado de cultura de células quase in vivo , pois permite diferentes estados funcionais da célula como resultado de interações célula-célula e célula-MEC, bem como gradientes de oxigênio e nutrientes. Como os esferoides são tecnicamente menos exigentes e relativamente baratos de obter, eles são frequentemente usados na triagem de medicamentos e testes de toxicidade, permitindo a triagem de alto conteúdo para testar novos medicamentos na fase pré-clínica. Para isso, estruturas 3D de vários tumores são predominantemente recriadas. Ao mesmo tempo, o Matrigel é atualmente um dos ECMs mais utilizados e é considerado o padrão-ouro no cultivo de esferóides e organoides, embora esta seja uma matriz 3D baseada em experimentos com camundongos, cuja extração - como os testes em animais em geral - está associada a grandes preocupações éticas. Aqui, apresentamos um protocolo livre de matriz para co-cultivo esferoidal direto de células epiteliais brônquicas humanas e fibroblastos, que pode ser considerado como um método de co-cultivo otimizado, especialmente no que diz respeito à comunicação epitelial-fibroblasto e interações dentro dos respectivos esferoides, sem depender de uma matriz transportadora (baseada em animais). Ao estabelecer essas co-culturas esferóides epiteliais e fibroblastóides flutuantes como uma plataforma in vitro orientada para o paciente para modelar toxicidades de tecido normal (pulmão) de abordagens terapêuticas de câncer, não apenas uma redução no número de animais experimentais, mas também uma substituição adequada e significativa de experimentos animais correspondentes pode ser alcançado.

Introdução

As culturas de células bidimensionais (2D), nas quais as células planas de monocamada são cultivadas, expandidas e depois plaqueadas para ensaios de pesquisa baseados em células, continuam sendo um método fácil, conveniente, econômico e amplamente utilizado para procedimentos de triagem pré-clínica padrão ^1,2. Para estudar a diafonia interativa (parácrina) entre vários tipos de células in vitro, um meio condicionado de um tipo de célula para estimulação de outro tipo de célula pode ser usado. Além disso, surgiram vários métodos de co-cultura, por exemplo, métodos indiretos, quando as células co-cultivadas são fisicamente separadas usando uma membrana microporosa. Esses 'sistemas Transwell' incluem uma inserção (a membrana microporosa) que é colocada em uma placa de cultura de células 2D tradicional. Um tipo de célula é então semeado e cultivado na membrana, compartilhando o mesmo meio que o outro tipo que cresce no poço companheiro, permitindo assim comunicações parácrinas bidirecionais². Os dois tipos de células podem até ser semeados nos dois lados da membrana, formando mais uma co-cultura de contato direto célula a célula, que é adequada para investigar tecidos estruturados em barreira ^3,4.

No entanto, as respostas celulares desses sistemas de cultura de células 2D ainda avançados nem sempre refletem os resultados dos experimentos em animais correspondentes e até mesmo estudos clínicos, o que se deve, entre outras coisas, à falta de sinalização direta entre os diferentes tipos de células e, portanto, à falta de organizações celulares semelhantes in vivo. Portanto, os sistemas de cultura tridimensionais (3D) tornaram-se cada vez mais populares devido às capacidades das características e arquiteturas celulares naturais que imitam estruturas semelhantes a tecidos in vitro ^5,6. Entre esses modelos, a cultura de agregados celulares esféricos, denominados esferoides, incorporados em matrizes extracelulares semissólidas, fornece um modelo de cocultura celular mais avançado, onde diferentes estados celulares funcionais após interações célula-célula e célula-ECM, bem como gradientes de oxigênio e nutrição, podem ser alcançados⁷. Essas culturas in vitro in vitro mais complexas desejadas devem ser geradas e mantidas homogêneas em relação aos tamanhos de montagem celular, promovendo o desenvolvimento e a diferenciação celular, enquanto ainda são eficazes, rápidas, consistentes e convenientes ^7,8.

Usando as características naturais de autoagregação e adesão, os esferoides (principalmente esferoides tumorais) são geralmente gerados usando a técnica de gota suspensa ^9,10. Como uma das primeiras técnicas usadas para gerar corpos embrionários, o ensaio de gota suspensa tornou-se um método amplamente utilizado para gerar numerosos esferóides homogêneos com base nos princípios de gravidade e tensão superficial antes da incorporação de ECM usando Matrigel, o 'padrão ouro' de matrizes extracelulares, embora seja baseado em camundongos. Um esforço substancial foi feito para gerar esferoides em abordagens livres de andaimes ^8,11. Por exemplo, os esferoides podem ser gerados usando um frasco de cultura de células com um agitador, evitando assim a semeadura celular, o método mais simples para produzir esferoides em larga escala¹².

A coisa mais difícil na complexação de culturas de células e, portanto, no estabelecimento de um sistema fisiologicamente valioso como alternativas in vitro in vivo em laboratório, são protocolos complexos com muitas etapas diferentes (que ainda precisam ser estabelecidas). Por exemplo, gerar estruturas celulares primeiro usando um método, colhê-las e depois incorporá-las em uma matriz, especialmente o uso de matrizes que não são fáceis de manusear, são etapas críticas que exigem mais convencimento antes que um método possa ser usado rotineiramente e em série. Aqui, usamos uma placa de fixação ultrabaixa em um formato de 96 poços, que praticamente não permite a ligação celular ao material de cultura para estabelecer esferóides 3D complexos de células epiteliais pulmonares e fibroblastos. Os esferoides resultantes são formados de forma altamente uniforme e bastante rápida em 24 horas, o que encurta a linha do tempo experimental. O cultivo prolongado e, portanto, o crescimento e a diferenciação celular confiáveis são realizados no mesmo poço durante todo o período, de modo que, após o plaqueamento inicial, apenas o meio precisa ser substituído durante todo o período de cultivo. Portanto, apresentamos um protocolo muito simples, rápido e, portanto, altamente prático para gerar esferoides pulmonares humanos que replicam morfologicamente e funcionalmente o epitélio das vias aéreas em níveis quase fisiológicos. Outra vantagem é que este protocolo pode ser facilmente adaptado a outras células.

Protocolo

Todas as etapas são realizadas em condições estéreis (gabinete de biossegurança). Para as composições de mídia usadas neste estudo, consulte a Tabela 1.

1. Preparação do material experimental

1. Cultive e expanda células epiteliais pulmonares normais humanas (HBEC3-KT) em placas de cultura de células plásticas padrão (frascos T75) em meio de crescimento epitelial normal usando uma incubadora padrão¹³ (ver Tabela 1).
   NOTA: Para melhorar o crescimento, o meio pode ser adicionalmente suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS).
2. Cultura de fibroblastos humanos (HS-5) em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bezerro e penicilina/estreptomicina^10,14 (ver Tabela 1).
3. Prepare o meio organoide pulmonar ramificado (BLO-Medium) suplementando DMEM / F12 com N-2, B27, penicilina-estreptomicina, albumina de soro bovino, monotioglicerol, ácido ascórbico, KGF / FGF7, FGF10, ATRA e CHIR99021. (ver Tabela 1 e Tabela de Materiais).
   NOTA: Recomenda-se preparar o meio na hora, pelo menos com a adição de KGF/FGF7, FGF10, ATRA e CHIR99021. Se for necessário mais meio num curto período de tempo, recomenda-se apenas um curto período de armazenamento de alguns dias (até 1 semana) a 4 °C. Alternativamente, o meio de diferenciação de organoides de vias aéreas PneumaCult disponível comercialmente pode ser usado.

2. Preparação de células epiteliais e fibroblastos

NOTA: Use os dois tipos de células quando as células atingirem cerca de 80% de confluência. Prepare cada tipo de célula separadamente.

1. Remova e descarte o meio de cultura.
2. Lave as células enxaguando brevemente a camada celular com 5 mL de PBS.
3. Tripsinize as células epiteliais adicionando 2 mL de tripsina-EDTA a 0,5%, seguido por uma incubação curta a 37 ° C por 4-8 min.
4. Colha células arredondadas e quase destacadas adicionando meio de crescimento normal ou PBS suplementado com 10% de FCS usando uma pipeta sorológica de 5 mL.
5. Pipete o volume apropriado para cima e para baixo várias vezes no balão T75 (ao longo da superfície de crescimento) para separar ainda mais os aglomerados de células e transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml.
6. Colha fibroblastos HS5 respectivamente usando tripsinização TE a 37 ° C por 3-5 min.
7. Pulverize cada tipo de célula (e, portanto, livre de tripsina) por centrifugação (por exemplo, 300-400 × g por 5 min à temperatura ambiente [RT]) e ressuspenda (células epiteliais e fibroblastos) em 1-2 mL de meio de crescimento epitelial normal antes da contagem.
8. Determinar o número de células viáveis usando um volume apropriado de células ressuspensas; cada um diluído 1/5 usando 0,4% de mancha azul de tripano em uma câmara de contagem Neubauer sob um microscópio.

3. Geração de culturas de esferóides epitelio-fibroblastos 3D

1. Diluir o número desejado de células em meio de crescimento epitelial normal usando um tubo de 15 mL. Calcule 2000 células epiteliais com 50 fibroblastos em 100 μL de meio para cada poço das placas de 96 poços. O número de células resultante adequado para uma placa de 96 poços é de 200.000 células HBEC e 5.000 fibroblastos HS5 em 10 mL de meio de crescimento epitelial normal.
2. Misture delicadamente usando pipetas sorológicas estéreis de 10 mL.
3. Transfira a suspensão celular para um reservatório de reagente estéril para uma micropipeta multicanal.
4. Semeie as células em uma placa de fixação ultrabaixa, transferindo 100 μL da suspensão celular para cada poço usando uma pipeta multicanal (12 canais).
5. Incubar em condições padrão de cultura de células a 37 °C e 5% de CO₂ em uma atmosfera umidificada.
   NOTA: A formação de esferóides é avaliada por meio de exame microscópico regular usando um microscópio invertido e fotografando esferóides para cada ponto de tempo desejado.
6. Após 4 dias, adicione 100 μL de BLO-Medium por poço aos esferoides gerados.
7. Incubar ainda mais em condições padrão de cultura de células a 37 °C e 5% de CO₂ em uma atmosfera umidificada.

4. Realizando uma mudança regular de mídia

1. Após 7 a 8 dias, execute uma mudança de mídia regular. Portanto, posicione a placa em um pequeno ângulo para que os esferóides afundem na direção de inclinação de acordo com a gravidade.
2. Aspire o sobrenadante cuidadosamente e da melhor maneira possível com uma ponta de pipeta de 100-200 μL.
3. Reposicione a placa horizontalmente e encha com 100-150 μL de meio BLO por poço (usando uma pipeta multicanal)
4. Incubar ainda mais em condições normais de cultura celular a 37 °C e 5% de CO₂ numa atmosfera humidificada ou iniciar uma experiência/tratamento.
   NOTA: Os esferoides podem ser cultivados por períodos mais longos (até 21 dias). Em seguida, uma troca completa do meio deve ser realizada pelo menos duas vezes por semana.

5. Análises a jusante (colheita de esferoides)

1. Realize exames microscópicos regulares e documentação tirando fotos em combinação com medições de tamanho de esferóides e cálculos de volume, permitindo finalmente a quantificação do crescimento de esferóides e possíveis alterações de crescimento após os tratamentos.
2. Para imagens de células vivas nos pontos de tempo desejados, incube os esferóides por mais 15 minutos com 1 μg / mL Hoechst 33342 (ou DAPI) para coloração de núcleos e analise por microscopia de fluorescência.
3. A colheita gerou esferoides no ponto de tempo desejado usando uma pipeta de 200 μL com a saída cortada (manter estéril) para aumentar o diâmetro. Portanto, aspire também o meio que contém o esferoide. Combine e colete os esferóides em um tubo de 2-5 mL. Após 2-5 min, quando os esferóides afundarem devido à gravidade, remova o sobrenadante e prossiga para a análise a jusante.
4. Para a geração de lisados de proteínas esferóides inteiras, adicione diretamente tampão de lise gelado (150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% de dodecilsulfato de sódio, 50 mmol / L Tris / HCl, pH 8, suplementado com coquetel de inibidores de protease) ao tubo contendo os esferóides colhidos. Após dois a três ciclos de congelamento e descongelamento, determine o teor de proteína dos lisados e prossiga para a análise a jusante, por exemplo, análise de Western blot¹⁵.
5. Para a geração de lisados de RNA esferoides inteiros, adicione diretamente o tampão de lise de RNA ao tubo que contém os esferoides colhidos e realize o isolamento de RNA de acordo com as instruções do fabricante do respectivo kit de isolamento de RNA usado.
6. Para coloração por imuno-histoquímica (IHQ) e imunofluorescência, siga as etapas 5.6.1-5.6.3.
   1. Trate os esferóides colhidos com 1-2 mL de solução salina tamponada com paraformaldeído/fosfato a 4% (PBS) por 30 min e, posteriormente, sujeito a inclusão e seccionamento de parafina (3-5 μm).
   2. Antes da coloração imunofluorescente, prepare as amostras usando uma série descendente de álcool e incubação com uma solução de recuperação de alvo. Em seguida, bloqueie as lâminas com uma solução de bloqueio (soro de cabra normal a 2% / PBS) para reduzir interações inespecíficas e incubar anticorpos primários durante a noite a 4 ° C.
   3. Detecte antígenos por anticorpos secundários marcados com fluorescência. Contracorar os núcleos com DAPI. Realize coloração adicional (por exemplo, kit de coloração PAS) de acordo com os protocolos do fabricante para avaliação histológica.
7. Para suspensões de célula única, siga as etapas 5.7.1 e 5.7.2.
   1. Ressuspenda os esferóides colhidos em 1-2 mL de TrypLE contendo 100 U / mL DNase I, seguido por uma incubação de 15 minutos a 37 ° C. Pare a digestão adicionando PBS contendo 2-5% FCS, 2 mM EDTA e DNAse I.
   2. Passe a solução celular através de um filtro de células de 70 μm para um tubo cônico fresco antes da análise a jusante (por exemplo, citometria de fluxo ou análise de célula única).
8. Para análise de sequenciamento de RNA de célula única, siga as etapas 5.8.1-5.8.3.
   1. Rotule as diferentes suspensões de célula única de interesse que representam diferentes pontos de tempo ou tratamentos usando um kit de multiplexação de célula única (humano) de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Combine amostras depois e carregue em uma pista em um cartucho de célula única com o objetivo de 10.000 a 40.000 células.
   3. Recupere células únicas, execute transcrição reversa e preparação da biblioteca de acordo com as instruções do fabricante e sequencie o RNA isolado.

Resultados

Este protocolo simples permite o co-cultivo esferoidal livre de matriz de células epiteliais brônquicas humanas e fibroblastos em combinação com placas de fixação ultrabaixas (Figura 1A). Durante o processo de cultivo, esferoides pulmonares mais complexos formam-se gradualmente a partir dos esferoides inicialmente gerados, com a geração eficiente de diferentes estruturas epiteliais e fibroblásticas representando interações celulares diretas, conforme revelado por análises morfológicas usando...

Discussão

Modelos de cultura de células 3D têm sido propostos para preencher a lacuna entre culturas 2D e estudos in vivo, pois esse tipo de (co-)cultura imita melhor as propriedades fisiológicas, morfológicas e patológicas presentes in vivo porque mais interações célula-célula, interações célula-ECM, respostas a estímulos, expressão gênica, expressão proteica e diferenciação estão presentes^{17, 18}. Além dos numer...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipetas sorológicas estéreis de 10 mL	Pipetas serológicas estéreis	ThermoFischer	170356N
tubo cónico equivalente de 15 ml	Corning	430052	ou equivalente
37 ° C/ 5% CO2 umidificado  incubadora
5 mL pipetas sorológicas estéreis	Pipetas sorológicas estéreis	ThermoFischer	170355N
tubo cônico equivalente de 50 mL	Corning	CLS430829	ou
equivalente ATRA (All-Trans Retinoic Acid)	StemCell Technologies	Cat#72262	50 nM
B-27 Suplemento (50x),	ThermoFischer/Gibco	Cat#17504044	1x
BD Rhapsody WTA Amplification Kit	BD Bioscience	Cat#633801	use de acordo com as instruções do fabricante
			biossegurança
Albumina de soro bovino	Roche	Cat#BSAVHS-RO	0,4% (v/v)
Filtro de células	Corning	352350	Falcon 70 µ m Cell Strainer, Branco, Estéril, Embalado Individualmente
Centrífuga	Eppendorf	https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001	por exemplo, Eppendorf Centrifuge 5804 - Centrífuga de Bancada
DMEM/F12	Invitrogen	Cat#11330-032	500 mL
DNase I, livre de RNase (1  U/μ L)	ThermoFischer	Cat#EN0521	100 U/mL
EDTA (0,5 M), pH 8,0,	ThermoFischer	AM9260G	2 mM
Eppendorf Research mais pipeta multicanal de 12 canais	Eppendorf		, por exemplo, # 3125000044 (10– 100 µ L) ou # 3125000060 (30– 300 µ L)
Soro fetal para bezerros	ThermoFischer/Gibco	Cat#A5256701	10% (v/v)
HBEC3-KT	de células epiteliais pulmonares normais humanas	ATCC	CRL-4051
Solução de Heparina (0.2%)	StemCell Technologies	Cat#7980	0.8 mL
Hoechst 33342	ThermoFischer	Cat#H1399	1 µ g/mL
HS-5	Fibroblastos estromais humanos	ATCC	CRL-3611
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACF	StemCell Technologies	Cat#78173.1	10 ng/mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF	StemCell Technologies	Cat#78186.1	de 10 ng/mL
	BD Bioscience	Cat#633781	use de acordo com as instruções do fabricante
Solução de estoque de hidrocortisina	StemCell Technologies	Cat#7926	0,5 mL por 500 mL
Laduviglusib (CHIR-99021)	Biozol/Selleckchem	Cat#S1263	3 µ
M L-Ácido Ascórbico	Sigma-Aldrich	Cat#A92902	50 µ g/mL
Microscópio	ZEISS
Monotioglicerol	Sigma-Aldrich	Cat#M6145	0.4 µ
M N-2 Suplemento (100x)	ThermoFischer/Gibco	Cat#17502048	1x
câmara de contagem Neubauer	Merck	BR718605	por exemplo, MARCA  câmara de contagem BLAUBRAND  Padrão Neubauer
Soro de cabra normal	ThermoFischer	Cat#31873	2% (v/v) em PBS
NP-40	Merck/Millipore	Cat#492016	NP-40-Alternative, 1
Kit de coloração PAS	Sigma Aldrich	Cat#1016460001	use de acordo com as instruções do fabricante
PBS	ThermoFischer	Cat#10010023	1x
Penicilina-Estreptomicina (10.000  U/mL), 100x	ThermoFischer/Gibco	Cat#15140122	1x
PFA	ThermoFischer	Cat#J61899. AK	Paraformaldeído, 4% em PBS
PneumaCult Meio de Diferenciação de Organoides das Vias Aéreas (ODM)	StemCell Technologies	Cat#05060	PneumaCult Organoid das Vias Aéreas Basal Medium (#05061, 360 mL) e PneumaCult Airway Organoid Differentiation Supplement* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus Medium	StemCell Technologies	Cat#5040	Kit composto por PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (#05041, 490 mL) e PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL)
Coquetel inibidor de protease	Merck/Roche	Cat#4693132001	1 comprimido/10 mL
Kit de cDNA de rapsódia	BD Bioscience	Cat#633773	use de acordo com as instruções do fabricante
RPMI 1640 Médio	ThermoFischer/Gibco	Cat#11875093	500 mL
Cloreto de Sódio	Merck/Sigma-Aldrich	S9625	150 mmol/L
Citrato de Sódio	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#1613859-1G	0.10%
Desoxicolato de Sódio	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#30970	0.50%
Dodecil Sulfato de Sódio	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#11667289001	0,10%
Reservatório de reagente estéril para micropipeta multicanal (por exemplo, 60 ml)	ThermoFischer	9510037	ou equivalente
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ck	Sarstedt (ou facellitate)	83.3925.400 (ou F202003)	placa de fixação ultra-baixa
Tris/HCl	ThermoFischer	Cat#AM9855G	50 mmol/L , pH 8
Triton  X-100	Sigma-Aldrich	Cat#X100-5ML	0.05 %
Mancha azul de tripano (0,4%)	ThermoFischer	Cat#15250061	1/5 (v/v) com NGM
TrypLE	ThermoFischer	Cat#12604013	1x
tripsina-EDTA (0,5%)	ThermoFischer	Cat#15400054	solução de tripsina-EDTA (TE) a 0,05% diluída assepticamente a 1X usando solução salina tamponada com fosfato (sem cálcio e magnésio)
Reagente WST-1	CELLPRO-RO, Roche	Cat#5015944001	reagente de proliferação celular