Method Article

Compreendendo as mudanças na morfologia mitocondrial por meio de micrografias de fluorescência dinâmicas e tridimensionais

DOI:

10.3791/68478

⸱

August 15th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Stellenbosch University, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui descrevemos o localizador de eventos mitocondriais (MEL), um plugin ImageJ útil na quantificação das mudanças tridimensionais na fissão mitocondrial e na atividade de fusão ao longo do tempo. Também descrevemos um pipeline de processamento de imagem útil para a limpeza de micrografias antes da análise no ImageJ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas e vitais para a sobrevivência de qualquer animal, passando por eventos regulares de fissão e fusão em resposta às necessidades ou estresses do hospedeiro, levando à constante remodelação da rede mitocondrial. Por isso, ser capaz de avaliar a rede mitocondrial em três dimensões, bem como ao longo do tempo, oferece um benefício na compreensão de como o sistema responde a fatores como estresse ou intervenção farmacêutica. A imagem de fluorescência das redes mitocondriais de células permite visualizar e monitorar essas mudanças. No entanto, a rede mitocondrial é frequentemente descrita como uma estrutura bidimensional e estática definida por métricas não padronizadas. Portanto, nos propusemos a descrever um pipeline que permite ao usuário preparar suas imagens para o localizador de eventos mitocondriais (MEL), uma ferramenta plugin do ImageJ que detecta eventos de fissão e fusão na rede mitocondrial ao longo do tempo e de maneira tridimensional, oferecendo assim uma visão sobre as mudanças dinâmicas que essa rede sofre. Além disso, descrevemos os benefícios de entender a fissão e a fusão à luz das mudanças na contagem mitocondrial e nas alterações morfológicas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas presentes em todas as células eucarióticas, fornecendo-lhes energia e regulando seu metabolismo. Assim, as mitocôndrias estão na encruzilhada da morte celular e da sobrevivência. As mitocôndrias têm se mostrado essenciais para uma variedade de processos, desde a acidificação lisossômica e ação motora molecular até a contração muscular e o disparo de sinapses 1,2.

As mitocôndrias passam por eventos regulares de fissão e fusão para manter uma rede mitocondrial que produz ATP com eficiência em resposta à demanda metabólica e ao estresse da célula. De fato, foi demonstrado que as mitocôndrias sofrem fissão para facilitar a mitofagia, a remoção seletiva de fragmentos mitocondriais. Assim, apenas as mitocôndrias que respiram ativamente e não as despolarizadas são deixadas no sistema celular 3,4. A fusão, no entanto, ocorre como um meio de aumentar a produção de ATP da rede caso haja uma necessidade aumentada 5,6. Além disso, tanto a fissão quanto a fusão também demonstraram desempenhar um papel importante na partição e proteção do DNA mitocondrial 7,8. Deve-se notar que a extensão da fissão e fusão requer um controle homeostático cuidadoso para garantir uma rede mitocondrial saudável, já que muito ou pouco de qualquer processo demonstrou ser prejudicial.

Demonstrou-se que a fissão excessiva leva a uma rede mitocondrial fragmentada com subsequente diminuição dos níveis de ATP na doença de Alzheimer, doença de Parkinson e tauopatias 9,10,11, e baixos níveis de fissão podem levar a um acúmulo de mitocôndrias despolarizadas, levando a sintomas semelhantes aos da doença de Parkinson 12. Sabe-se que a hiperfusão da rede ocorre durante períodos de estresse para aumentar a produção de ATP. No entanto, a existência neste estado por períodos prolongados de tempo demonstrou aumentar os níveis de ROS e a atividade da autofagia, resultando no início da morte celular 9,12.

Fica claro, portanto, que entender o estado da rede mitocondrial oferece insights importantes para entender o estado da célula e, portanto, do organismo. A clara importância de compreender a rede mitocondrial no contexto da saúde e da doença, sua capacidade de sofrer eventos de fissão e fusão e seu impacto na saúde celular é o que motivou o desenvolvimento deste protocolo e das ferramentas de análise associadas. Especificamente, as ferramentas que permitem a caracterização da dinâmica mitocondrial são amplamente limitadas e mal descritas na literatura.

A morfologia mitocondrial é normalmente determinada usando microscopia confocal seguida de análise computacional, que requer que as micrografias brutas passem por algum grau de processamento para melhorar sua qualidade para avaliação, pois isso descreve melhor a organização mitocondrial. Dessa forma, os usuários podem determinar muitos resultados morfométricos da rede mitocondrial, como contagem, volume, comprimento e proporção 13,14,15. Os usuários podem fazer uso de micrografias 2D ou 3D para avaliações morfológicas, embora a análise 3D ofereça maior precisão e percepção, uma vez que a rede mitocondrial consiste em estruturas 3D. Para fins de análise de fissão e fusão, micrografias com eixo z são recomendadas para uso, pois isso compensa melhor a tridimensionalidade da rede mitocondrial16.

Muitos estudos envolvem a categorização das mitocôndrias em estados fragmentados, filamentosos ou intermediários como forma de descrever a rede16,17. A análise 3D é particularmente benéfica devido às diferentes formas que as mitocôndrias assumem na célula. Adicionar 3 dimensionalidades ao estudo dá confiança, especialmente às contagens mitocondriais, pois as mitocôndrias provavelmente se movem para cima ou para baixo ao longo de um eixo z. MEL é um plugin ImageJ que depende de imagens capturadas em 3D18. Aqui, usamos células neuronais do hipocampo de camundongos GT1-7 coradas com TMRE e Hoechst para visualizar a rede mitocondrial, bem como o núcleo da célula. As células foram então colocadas através de um pipeline de pré-processamento para melhorar a qualidade das micrografias em preparação para a análise da imagem.

Muitas técnicas foram disponibilizadas que permitem a determinação da morfologia mitocondrial com base em métricas estáticas. Poucos incluem atividades de fissão e fusão e permitem a captura quantitativa do comportamento dinâmico das mitocôndrias 13,19,20,21. Aqui descreveremos um protocolo para aprimoramento de imagem antes da determinação das características da rede, com foco na fissão mitocondrial e na atividade de fusão. Demonstraremos como essa técnica pode complementar os métodos publicados anteriormente para determinar a morfologia mitocondrial.

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Protocol

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1. Tratamento celular e aquisição de microscopia

  1. Cultura de células GT1-7 em placas de 8 câmaras em DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de Penstrep (meio completo). Deixe as células se ligarem durante a noite e depois trate com cloridrato de metformina 2,5 mM feito em DMEM com 10% de FBS por 72 h, certificando-se de substituir o meio a cada 24 h. Co-trate as células com 10 μM de CCCP 6 h antes da imagem e 400 nM de Bafilomicina A1 (Baf) 4 h antes da imagem.
    NOTA: Isso pode ser feito com qualquer linhagem de células eucarióticas de sua escolha.
  2. Antes da obtenção de imagens, prepare um coquetel de meios completos pré-aquecidos contendo 5 nM Hoechst e 100 nM TMRE.
  3. Substitua o meio de tratamento celular pelo coquetel de imagem e aguarde 10 minutos de tempo de incubação antes da imagem.
    NOTA: Devido à atividade dinâmica das mitocôndrias, as células devem ser visualizadas usando um microscópio com uma câmara de incubação ajustada para 37 ° C e 5% de CO2.

2. Exames de imagem

  1. Células de imagem usando ampliação de 100x com 1,4 NA.
  2. Ajuste a potência do laser de forma que a potência seja baixa o suficiente para evitar o fotobranqueamento, ~ 2%. Certifique-se de que a velocidade de digitalização seja alta. Capture imagens com resolução de 512 x 512.
  3. Defina os intervalos de corte Z entre incrementos de 0,25 μm. Para seguir esse protocolo, crie imagens das células de forma que consistam em 10 pilhas Z. Adquira cinco períodos de tempo sem nenhum intervalo entre a aquisição de uma pilha Z.
    NOTA: Uma vez otimizado, este protocolo não deve ser ajustado entre grupos de tratamento ou grupos experimentais, pois as macros listadas aqui exigem que o protocolo de imagem seja padronizado em todas as células.

3. Avaliação computacional

NOTA: Todo o processamento subsequente foi feito usando o ImageJ v1.53t. O plugin MEL, bem como os módulos de suporte, podem ser encontrados em https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin, enquanto todas as macros usadas podem ser encontradas em https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections.

  1. Preparação de imagem
    1. Abra o arquivo raw no ImageJ.
    2. Para cortar várias células de uma única micrografia, comece duplicando a imagem até o número de células únicas que devem ser analisadas.
    3. Use a ferramenta sincronizar janelas, a ferramenta de desenho à mão livre e o ajuste de cor para desenhar uma região de interesse em torno de uma célula de interesse onde há várias células em um campo de visão (Figura Suplementar S1).
    4. Clique em Editar | Claro Fora.
    5. Divida os canais vermelho e azul um do outro e salve o canal mitocondrial como um . Arquivo Tiff.
  2. Geração e deconvolução da função de spread de pontos
    1. Para gerar uma função de propagação de ponto (PSF), use o plug-in gerador PSF usando informações de micrografia incorporadas. Ir para Plugins | PSF Generator para abrir o plugin. Além disso, vá para Imagem | Mostrar informações... ou pressione I para abrir as informações da imagem e role até a parte inferior. Usando o tamanho e a profundidade do voxel, na caixa de informações do show, altere o Pixelsize XY para 166,1 nm e o Z-step para 200 nm. Altere o comprimento de onda para 568 nm, tamanho XYZ para corresponder a uma resolução de imagem de 512 x 512 e uma pilha Z de 10 fatias Z (Figura Suplementar S2).
    2. Ir para Plugins | Macros | Editar | Deconvolution_time_lapse_mine.ijm macros.
    3. Edite as linhas de entrada e saída e pressione executar (Figura Suplementar S3).
  3. Aprimoramento e desfoque do contraste da imagem
    1. Ir para Plugins | Macros | Editar | Pré-processamento.ijm.
    2. Nas macros Preprocessing.ijm , use uma subtração de plano de fundo com um raio de bola rolante igual a 6. Defina o Sigma Filter Plus de forma que o raio seja igual a 1, os pixels usados sejam iguais a 2 e a fração mínima de pixels seja igual a 0,2, com o plug-in ciente de outlier. Ajuste as configurações do CLAHE de forma que o tamanho do bloco seja 64; defina os compartimentos do histograma como 256, a inclinação máxima como 2,5 e a Gama como 0,8.
      NOTA: Todas essas configurações foram otimizadas para nossos conjuntos de dados e os valores devem ser otimizados para conjuntos de dados alternativos antes de serem aplicados. A filtragem Sigma é aplicada para suavizar a imagem e misturar efetivamente os pixels próximos para garantir estruturas consistentes. O contraste local é aplicado para aumentar o contraste entre pixels claros e escuros e, juntamente com uma mudança na gama, aumenta a presença das estruturas mitocondriais enquanto minimiza os pixels de fundo.
    3. Altere a linha de entrada para a pasta que contém micrografias que sofreram deconvolução (Figura Suplementar S4).
    4. Clique em Executar.
  4. Limite de imagem
    NOTA: Embora os usuários possam usar qualquer ferramenta de limite que escolherem, recomendamos o plug-in de limite adaptável de Qingzong Tseng (https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold).
    1. Abra um arquivo de interesse que tenha sido modificado pelas macros Preprocessed.ijm em ImageJ.
    2. Vá para Plugins | adaptiveThr.
    3. Defina o limite local como Média ponderada e o tamanho do bloco de pixels de acordo com a preferência do usuário.
      NOTA: O tamanho do bloco de pixels deve ser mantido consistente entre as células, pois esse valor afeta as avaliações dimensionais mitocondriais, como volume ou proporção.
    4. Para otimizar o tempo, clique em visualizar e ajuste o tamanho do bloco de forma que o maior número possível de mitocôndrias seja claramente incluído. Ajuste também o valor de subtração de cada célula para eliminar o fundo desnecessário. Salve arquivos de micrografia em pastas associadas ao valor de subtração (Figura Suplementar S5).
      NOTA: As macros Threshold.ijm incluem um filtro de tamanho para eliminar partículas menores.
    5. Selecione Plugins | Macros | Editar | Threshold.ijm.
    6. Edite as linhas input_path e output_path, bem como blockSize e subtraia linhas no script de macros (Figura Suplementar S6).
    7. Clique em Executar.
  5. Detecção de eventos de fissão e fusão pelo plugin localizador de eventos mitocondrial (MEL)
    NOTA: O MEL foi projetado para processar uma sequência de lapso de tempo de z-stacks que consiste em um único canal, salvo como um único Tiff por vez. Embora isso possa ser feito alterando a linha de entrada para o arquivo Tiff de interesse, também demonstraremos um método de processamento de vários arquivos Tiff de uma só vez usando a função concatenar em ImageJ.
    1. Abra até 10 micrografias limiares que pertençam às mesmas condições de tratamento.
      NOTA: As micrografias devem ter o mesmo número de z-slices para que isso funcione.
    2. Ir para a imagem | Pilhas |Ferramentas | Concatene e pressione Ok.
    3. Para remover os pequenos pontos restantes deixados para trás pelo limite, vá para Plugins | Arquivadores de imagem integral | Remova outliers. Use a visualização para definir os tamanhos X e Y para remover os fragmentos necessários.
    4. Salve o arquivo concatenado como um Tiff.
    5. Ir para Plugins | Macros | Editar | Quicktest_new.ijm e edite os caminhos de entrada e saída conforme necessário (Figura Suplementar S7).
      NOTA: Depois de concluído, uma pasta chamada "MEL_results" será encontrada na pasta de saída com todos os resultados do MEL. Estes são mostrados como eventos de fissão e fusão detectados em cada ponto de tempo, e o último ponto de tempo deve sempre ser removido devido à maneira como o MEL funciona18.

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Results

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Selecionando células apropriadas
Os usuários devem estar cientes de que a rede mitocondrial muda dependendo do estado mitótico da célula. Se o núcleo parecer em forma de haltere ou U, ou se houver um espaço próximo ao núcleo com falta de sinal de fluorescência, isso pode indicar que a célula está se aproximando da mitose. Nesse estado, as mitocôndrias provavelmente estão sofrendo fissão devido à divisão celular e não por causa da intervenção do tratamento e seu efeito na rede (Figura Suplement...

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Discussion

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Embora exista um número crescente de abordagens para descrever a morfologia mitocondrial, técnicas limitadas estão disponíveis para capturar adequadamente a dinâmica mitocondrial de maneira quantitativa. Além disso, deve-se notar que a morfologia da rede mitocondrial, bem como os mecanismos que governam essa morfologia, são de natureza variada. Isso resulta em redes que estão ligadas às necessidades da célula, variando de uma formação ramificada para maior produção de energia a regiões t...

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Disclosures

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi financiada pela Universidade de Stellenbosch, África do Sul, pelo Conselho de Pesquisa Médica da África do Sul (SAMRC) e pela Fundação Nacional de Pesquisa (NRF) da África do Sul, bem como pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) e pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8 pratos de câmaraThermoFisher#Z734853
Limite ajustadohttps://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
Bafilomicina A1Laboratórios LKT#B0026
Carbonilcianeto clorofenilhidrazona (CCCP)Merck#C2759
Microscópio confocalCarl Zeiss AGPlataforma de super-resolução LSM780 ELYRA PS.1
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)ThermoFisher#341956062
Soro fetal bovino (FBS)Sigma-Aldrich#F0679
Link do Githubhttps://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad Prism v7.06
Células GT1-7ATCCSCC116
HoecshtSigma-AldrichH6024
ImageJ v1.53tFiji
Macroshttps://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
MetforminaFarmacopeia EuropeiaM06050000
Penicilina/estreptomicina (PenStrep)Sigma-Aldrich#P4333
T25sBio-Smart Scientific#70025
TMREThermoFisher#T669
TripsinaSigma-Aldrich#T4049

References

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