Compreendendo as mudanças na morfologia mitocondrial por meio de micrografias de fluorescência dinâmicas e tridimensionais

Summary

Aqui descrevemos o localizador de eventos mitocondriais (MEL), um plugin ImageJ útil na quantificação das mudanças tridimensionais na fissão mitocondrial e na atividade de fusão ao longo do tempo. Também descrevemos um pipeline de processamento de imagem útil para a limpeza de micrografias antes da análise no ImageJ.

Abstract

As mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas e vitais para a sobrevivência de qualquer animal, passando por eventos regulares de fissão e fusão em resposta às necessidades ou estresses do hospedeiro, levando à constante remodelação da rede mitocondrial. Por isso, ser capaz de avaliar a rede mitocondrial em três dimensões, bem como ao longo do tempo, oferece um benefício na compreensão de como o sistema responde a fatores como estresse ou intervenção farmacêutica. A imagem de fluorescência das redes mitocondriais de células permite visualizar e monitorar essas mudanças. No entanto, a rede mitocondrial é frequentemente descrita como uma estrutura bidimensional e estática definida por métricas não padronizadas. Portanto, nos propusemos a descrever um pipeline que permite ao usuário preparar suas imagens para o localizador de eventos mitocondriais (MEL), uma ferramenta plugin do ImageJ que detecta eventos de fissão e fusão na rede mitocondrial ao longo do tempo e de maneira tridimensional, oferecendo assim uma visão sobre as mudanças dinâmicas que essa rede sofre. Além disso, descrevemos os benefícios de entender a fissão e a fusão à luz das mudanças na contagem mitocondrial e nas alterações morfológicas.

Introduction

As mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas presentes em todas as células eucarióticas, fornecendo-lhes energia e regulando seu metabolismo. Assim, as mitocôndrias estão na encruzilhada da morte celular e da sobrevivência. As mitocôndrias têm se mostrado essenciais para uma variedade de processos, desde a acidificação lisossômica e ação motora molecular até a contração muscular e o disparo de sinapses ^1,2.

As mitocôndrias passam por eventos regulares de fissão e fusão para manter uma rede mitocondrial que produz ATP com eficiência em resposta ....

Protocol

1. Tratamento celular e aquisição de microscopia

1. Cultura de células GT1-7 em placas de 8 câmaras em DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de Penstrep (meio completo). Deixe as células se ligarem durante a noite e depois trate com cloridrato de metformina 2,5 mM feito em DMEM com 10% de FBS por 72 h, certificando-se de substituir o meio a cada 24 h. Co-trate as células com 10 μM de CCCP 6 h antes da imagem e 400 nM de Bafilomicina A1 (Baf) 4 h antes da imagem.
   NOTA: Isso pode ser feito com qualquer linhagem de células eucarióticas de sua escolha.
2. Antes da obtenção de imagens, prepare um coquete....

Results

Selecionando células apropriadas
Os usuários devem estar cientes de que a rede mitocondrial muda dependendo do estado mitótico da célula. Se o núcleo parecer em forma de haltere ou U, ou se houver um espaço próximo ao núcleo com falta de sinal de fluorescência, isso pode indicar que a célula está se aproximando da mitose. Nesse estado, as mitocôndrias provavelmente estão sofrendo fissão devido à divisão celular e não por causa da intervenção do tratamento e seu efeito na rede (Figura Suplement.......

Discussion

Embora exista um número crescente de abordagens para descrever a morfologia mitocondrial, técnicas limitadas estão disponíveis para capturar adequadamente a dinâmica mitocondrial de maneira quantitativa. Além disso, deve-se notar que a morfologia da rede mitocondrial, bem como os mecanismos que governam essa morfologia, são de natureza variada. Isso resulta em redes que estão ligadas às necessidades da célula, variando de uma formação ramificada para maior produção de energia a regiões t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
8 pratos de câmara	ThermoFisher	#Z734853
Limite ajustado			https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
Bafilomicina A1	Laboratórios LKT	#B0026
Carbonilcianeto clorofenilhidrazona (CCCP)	Merck	#C2759
Microscópio confocal	Carl Zeiss AG		Plataforma de super-resolução LSM780 ELYRA PS.1
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	ThermoFisher	#341956062
Soro fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	#F0679
Link do Github			https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad Prism v7.06
Células GT1-7	ATCC	SCC116
Hoecsht	Sigma-Aldrich	H6024
ImageJ v1.53t	Fiji
Macros			https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
Metformina	Farmacopeia Europeia	M06050000
Penicilina/estreptomicina (PenStrep)	Sigma-Aldrich	#P4333
T25s	Bio-Smart Scientific	#70025
TMRE	ThermoFisher	#T669
Tripsina	Sigma-Aldrich	#T4049