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Artigo de método

Estabelecendo modelos in vitro de cultura de gânglios da raiz dorsal: abordagens complementares para investigar a diafonia câncer-nervo

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DOI:

10.3791/68552

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11 de julho de 2025

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1Division of Cancer Biology and Genetics, Sinclair Cancer Research Institute, and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Laboratory of Mutagenesis and Oncogenetics, Department of General Biology - Center for Biological Science, State University of Londrina

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve métodos para estabelecer culturas de montagem inteira e dissociadas de gânglios da raiz dorsal de camundongos (DRG) e seu uso para avaliar as interações tumor-nervo.

Resumo

A contribuição do sistema nervoso para o microambiente tumoral e a importância da invasão neural como via de disseminação do câncer estão sendo cada vez mais reconhecidas. As interações das células cancerígenas com os neurônios podem promover sua invasão ao redor e nos nervos, uma característica de muitos cânceres com resultados clínicos ruins. Modelos in vitro para estudar interações recíprocas entre neurônios e células cancerígenas fornecem ferramentas valiosas para entender a disseminação do câncer e identificar abordagens para mitigá-la.

Aqui, descrevemos um protocolo para isolamento de gânglios da raiz dorsal murina (DRG) e o estabelecimento de culturas de monocamada de montagem inteira e dissociadas que podem ser usadas para visualizar a morfologia dos neurônios e o crescimento dos neuritos ao longo do tempo. DRGs inteiros montados em Matrigel preservam a arquitetura nervosa e as respostas a estímulos em um ambiente heterogêneo mais semelhante ao nervo in vivo , enquanto as culturas nervosas dissociadas permitem a avaliação das interações diretas célula-célula mais de perto. Uma vez que as culturas DRG são estabelecidas, as células cancerígenas podem ser adicionadas para gerar co-culturas que podem ser usadas para visualizar mudanças no crescimento de neuritos e na morfologia nervosa em resposta às células cancerígenas. O crescimento ou motilidade das células cancerígenas em resposta a sinais derivados do nervo ao longo do tempo ou sob condições de estimulação ou inibição do crescimento pode ser avaliado, bem como visualizar os efeitos do contato direto entre células cancerígenas e extensões nervosas.

Como ambos os modelos de co-cultura podem ser gerados simultaneamente, este protocolo fornece uma visão mais abrangente do impacto das interações câncer-neurônio e facilita comparações de condições de tratamento e integração de informações do nível celular e gânglios inteiros. Este protocolo facilitará o estudo das interações nervo-tumor e pode ser usado para uma ampla gama de aplicações, incluindo estudos de sinalização celular, triagem de drogas ou estudo da heterogeneidade do ambiente tumor-nervo e os mecanismos de disseminação do tumor ao longo dos nervos.

Introdução

A disseminação tumoral, por invasão local e metástase regional ou à distância, é a principal causa de morte relacionada ao câncer. Embora a pesquisa tenha se concentrado nas rotas vasculares ou linfáticas de disseminação, a invasão neural de células tumorais é frequentemente observada em muitos tumores sólidos, incluindo câncer de pâncreas 1,2, próstata 3, cabeça e pescoço4, mama5 e colorretal6. Nos últimos anos, numerosos estudos destacaram o papel emergente dos nervos na promoção do crescimento e progressão tumoral e, como vias de disseminação, impulsionando o desenvolvimento de metástases 7,8. Nesse contexto, a neurociência do câncer tem emergido como um campo de pesquisa proeminente, oferecendo novas perspectivas em oncologia ao elucidar as interações entre as células tumorais e os componentes fundamentais do sistema nervoso periférico (SNP) que podem contribuir para esses processos 8,9.

O SNP é composto por nervos periféricos e gânglios, que são estruturas heterogêneas compostas por diversos tipos de células, incluindo neurônios de tamanhos e funções variados, células de Schwann e outras células gliais, fibroblastos, macrófagos, mastócitos, melanócitos e células endoteliais vasculares que formam a vasculatura local10. O SNP é um componente crítico do microambiente tumoral (TME), e a comunicação recíproca entre células cancerígenas e nervos, seja diretamente por contato físico ou indiretamente por meio da liberação de fatores neurotróficos, neurotransmissores, fatores de crescimento e outros sinais, pode facilitar a invasão neural e promover fenótipos mais agressivos8.

Modelos in vitro podem ser usados para caracterizar os processos que contribuem para a manutenção e reparo do nervo e estão sendo cada vez mais usados para examinar as interações celulares entre nervos e células cancerígenas11,12. Um modelo in vitro frequentemente usado envolve gânglios da raiz dorsal de camundongos extraídos (DRG) co-cultivados com células tumorais11. Esses modelos geralmente usam cultura de monocamada bidimensional (2D) de células DRG dissociadas para estudar a biologia neuronal in vitro e têm sido usados para modelar interações celulares no PNS13,14. No entanto, as culturas 2D não têm a complexidade do microambiente nervoso e representam mal sua arquitetura in vivo. Montagens tridimensionais (3D) inteiras de neurônios periféricos ou gânglios oferecem uma alternativa que recapitula de forma mais eficaz a fisiologia do nervo periférico para representar as interações nervo-ambiente de forma mais holística 15,16,17,18. No entanto, a heterogeneidade desse modelo limita a capacidade de visualizar ou quantificar as interações célula-célula, e esses modelos são mais eficazes para observar as respostas gerais dos nervos periféricos do que para explorar interações celulares específicas e respostas mecanicistas a estímulos. Assim, fica claro que as culturas neuronais dissociadas e de montagem inteira são complementares e que a avaliação de modelos 2D e 3D em paralelo é ideal para avaliar os efeitos gerais e as respostas celulares individuais aos estímulos.

Este protocolo descreve métodos para gerar culturas nervosas complementares dissociadas (2D) e de montagem total (3D) que podem ser usadas para avaliar as interações nervosas e cancerígenas nos níveis celular e tecidual, fornecendo uma visão mais abrangente dessas interações do que os métodos que usam apenas um tipo de cultura 1,13. Esses modelos podem ser usados para visualizar e avaliar processos celulares, incluindo morfologia de células nervosas e crescimento de neuritos, bem como respostas de células tumorais a agentes quimiotáticos secretados por nervos, como fatores neurotróficos, e crosstalk entre neurônios sensoriais e células tumorais. Também permite a exploração de possíveis interações entre células tumorais e outros componentes do microambiente neural, como células imunes, fibroblastos e glia. Destacamos a aplicação desses modelos para estudar as interações nervo-câncer ao longo do tempo, visualizadas por coloração de células vivas ou imunofluorescência, como exemplos de abordagens para avaliar ou quantificar interações e respostas celulares. Juntos, os resultados gerados pelo uso desses métodos podem aprofundar nossa compreensão de como o sistema nervoso promove o crescimento e a disseminação do câncer, ajudando-nos a desenvolver estratégias para atingir esses mecanismos.

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Protocolo

Todo o trabalho com camundongos foi revisado e aprovado pelo Escritório do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade da Queen's (Protocolo número 2524). Os animais foram mantidos e sacrificados para coleta de tecidos em conformidade com as diretrizes éticas do Conselho Canadense de Cuidados com Animais e do Centro Nacional para a Substituição, Refinamento e Redução de Animais em Pesquisa (Reino Unido). Neste protocolo, usamos tecido isolado de animais C57BL/6, mas também usamos com sucesso outros genótipos, incluindo animais Rag2IL2Rγc KO. As seções 1-6 podem ser realizadas em um ambiente limpo em uma bancada de laboratório esterilizada por superfície (consulte a Figura 1), enquanto as seções 7-9 devem ser realizadas em uma cabine de segurança biológica. Para melhor compreensão, foram criadas representações esquemáticas das etapas mencionadas (Figura 1).

1. Preparação das soluções-mãe

  1. Prepare a solução de papaína e a solução de colagenase IV / Dispase II. Dissolva a papaína em PBS estéril (solução salina tamponada com fosfato) na concentração de 30 U / mL; armazenar em alíquotas de 1 ml a -20 °C. Dissolva a colagenase tipo IV a 1,25 mg / mL e a dispase II a 2,5 mg / mL em PBS. Conservar em alíquotas de 1 ml a -20 °C.
  2. Prepare meios de cultura neurobasais (F12) suplementados com 2% de suplemento de B27 (50x solução estoque), 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) (100x solução estoque).
  3. Prepare a solução salina balanceada de Hank (HBSS) com penicilina-estreptomicina a 1% (solução estoque 100x).
    NOTA: Para apoiar a sobrevivência e fixação inicial das células, o meio F12 suplementado com 10% de FBS é usado para melhorar o estabelecimento das culturas. No entanto, o FBS também promove a proliferação de células não neuronais, incluindo fibroblastos. Condições de meio reduzido ou sem soro (por exemplo, F12 suplementado apenas com B27) podem ser usadas para minimizar o crescimento de células não neuronais na cultura DRG e na cocultura de câncer, mas podem afetar a sobrevida, particularmente de culturas de neurônios dissociadas. Meios livres de soro também devem ser considerados ao coletar meios condicionados com DRG para avaliar seus efeitos no comportamento das células cancerígenas.

2. Preparação de reagentes e materiais para a dissecação de DRGs (Figura 1A)

  1. Instrumentos cirúrgicos em autoclave. Esterilize o microscópio de dissecação com etanol a 70% e coloque-o em uma bancada limpa.
  2. Adicione 6-8 ml de HBSS-Pen-Strep (passo 1.3) a duas placas de cultura de 10 cm e coloque sobre gelo.
    NOTA: Essas placas serão usadas para coletar colunas vertebrais após a dissecção. Dependendo do número de medulas espinhais que estão sendo dissecadas, placas adicionais podem ser necessárias.
  3. Adicione 8-10 mL de HBSS-Pen-Strep a um tubo cônico de 15 mL e coloque no gelo.
  4. Adicione 3 ml de HBSS-Pen-Strep a uma placa de cultura de 3 cm e coloque sobre gelo.
    NOTA: O tubo de 15 mL preparado na etapa 2.3 será usado para coletar DRGs para dissociação, enquanto a placa de cultura de 3 cm (etapa 2.4) será usada para coletar DRGs para o modelo de montagem inteira.

3. Preparação de reagentes e materiais para cultura DRG de montagem inteira

NOTA: Algumas etapas nesta seção podem exigir preparação durante a noite. Embora qualquer tipo de placa de cultura de tecidos possa ser usado para culturas DRG, os volumes e instruções neste protocolo foram otimizados para lâminas de fundo de vidro de 8 poços, o que proporcionou uma qualidade de imagem ideal para nossas análises. Mantenha a lâmina de fundo de vidro de 8 poços, as pontas da pipeta e o Matrigel no gelo o tempo todo.

  1. Descongele a solução de Matrigel a 4 °C durante a noite (ou pelo menos 3 h) antes de usar. Certifique-se de manter Matrigel coberto com gelo o tempo todo.
  2. Resfrie as pontas da pipeta e a lâmina de fundo de vidro de 8 poços a -20 °C durante a noite para minimizar a aderência do Matrigel às pontas e evitar a polimerização prematura do Matrigel na placa.
  3. Meio suplementado quente (passo 1.2) a 37 °C em banho-maria.

4. Preparação de reagentes e materiais para cultura DRG dissociada

  1. Descongele a solução de papaína e a solução de colagenase IV/Dispase II (etapa 1.1) em banho-maria a 37 °C até que estejam prontas para uso.
    NOTA: Para cada camundongo dissecado, use 1 alíquota (1 mL) de cada solução de papaína e colagenase IV / Dispase II.
  2. Meios de cultura suplementados a quente (etapa 1.2).

5. Coleta da coluna vertebral (Figura 1B) e dissecação dos DRGs (Figura 1C)

  1. Eutanasiar camundongos de 4 a 8 semanas de idade por overdose de isoflurano seguida de luxação cervical. Deite o animal sacrificado em seu abdômen e raspe seu pelo, concentrando-se na área sobre a coluna vertebral (Figura 1B, etapas 1,2).
  2. Pulverize as costas do animal com etanol 70% e remova qualquer pelo solto, limpando-o com toalhas de papel da cauda ao crânio para evitar que o pelo contamine a dissecção.
  3. Usando uma tesoura esterilizada, faça uma incisão reta ao longo da superfície dorsal raspada, da cauda ao crânio. Retraia a pele em ambos os lados da incisão usando uma pinça romba para expor a coluna vertebral (Figura 1B, etapa 3).
  4. Usando uma pinça e tesoura novas para evitar a contaminação com pelos, faça uma incisão horizontal na base (extremidade da cauda) da coluna vertebral (Figura 1B, etapa 4).
  5. Faça duas incisões longitudinais paralelas em cada lado da coluna vertebral para liberá-la. Use uma pinça para levantar suavemente a coluna vertebral para remover o tecido conjuntivo circundante (Figura 1B, etapa 5).
  6. Para liberar totalmente a coluna vertebral, faça uma incisão na parte superior da coluna vertebral (proximal ao crânio). Transferir a coluna vertebral para as placas pré-arrefecidas de 10 cm contendo HBSS-Pen-Strep em gelo (etapa 2.2) (Figura 1C, etapa 6).
    NOTA: É conveniente coletar todas as colunas vertebrais na mesma placa de 10 cm e mover as colunas individuais, uma de cada vez, para uma placa separada para outras etapas de dissecação.

6. Dissecando os gânglios da raiz dorsal (DRGs)

  1. Usando uma tesoura de mola, remova qualquer tecido conjuntivo residual ao redor da coluna vertebral, expondo as vértebras (Figura 1C, etapa 7). Isso permite uma visualização mais clara da vértebra e facilita o corte ao longo da linha média. Recolher as colunas aparadas num prato fresco de 10 cm pré-arrefecido (passo 2.2).
  2. Um de cada vez, transfira a medula espinhal aparada para o estágio do microscópio para dissecção. Divida cuidadosamente a coluna vertebral no plano sagital usando uma tesoura de mola (Figura 1D, passo 8).
  3. Usando pinças de ponta fina, remova a medula espinhal da coluna vertebral, expondo os DRGs bilateralmente ao longo das raízes dos nervos espinhais (Figura 1D, etapa 9).
    NOTA: Deve-se ter cuidado extra nesta etapa, pois os DRGs podem ser removidos com a medula espinhal se forem manuseados com muita força.
  4. Corte os nervos espinhais com uma tesoura de mola e remova qualquer tecido conjuntivo ao redor dos DRGs (Figura 1D, etapa 10).
    NOTA: A remoção do tecido conjuntivo nesta etapa minimiza os detritos nas culturas DRG.
  5. Usando uma pinça de ponta fina, puxe suavemente o DRG para extraí-lo da raiz dorsal. Para cultura de montagem inteira, coloque os DRGs na placa de 3 cm (preparada na etapa 2.4) (Figura 1D, etapa 11). Agrupe os DRGs restantes em um tubo cônico de 15 mL (preparado na etapa 2.3) para ser usado para dissociação.
    NOTA: Mantenha as placas e tubos no gelo durante todo o processo de dissecação.
  6. Repita as etapas 6.4 a 6.5 até que todos os DRGs sejam extraídos. Repita todas as etapas acima para quaisquer colunas vertebrais adicionais.
    NOTA: Os camundongos têm 30-31 pares de DRG, dependendo da cepa, o que permitirá a coleta de até 60 DRGs de cada animal. Se coletar DRGs apenas da porção lombar da medula espinhal, 10 DRGs podem ser extraídos. O uso de DRGs do mesmo animal para estabelecer os dois modelos de cultura reduz a variabilidade intraexperimental e garante resultados consistentes e comparáveis entre experimentos complementares.
    NOTA: Todas as etapas após a extração dos DRGs devem ser realizadas em uma cabine de segurança biológica.

7. Cultura de DRG de montagem inteira (Figura 2)

  1. Usando pontas pré-resfriadas (etapa 3.2), pipete 2 μL de Matrigel resfriado para formar uma gota em cada poço de uma lâmina de fundo de vidro de 8 poços colocada no gelo (Figura 2A, etapa 1). Para evitar que o Matrigel polimerize prematuramente antes de adicionar o DRG, pipete apenas uma única gota de cada vez. Para evitar arranhões na superfície do slide, coloque o slide em uma placa de 10 cm antes de colocá-lo no gelo.
  2. Usando uma pinça de ponta fina, transfira um DRG para uma placa seca e mova-o suavemente para remover qualquer excesso de HBSS, evitando uma diluição adicional do Matrigel ao adicionar o DRG à gota de Matrigel. Transfira o DRG para o drop Matrigel (Figura 2A, etapa 2).
    NOTA: Use uma pinça de ponta fina para empurrar suavemente o DRG na gota Matrigel, garantindo que o DRG esteja totalmente imerso e posicionado centralmente dentro da gota.
  3. Repita as etapas 7.1 a 7.2 para cada DRG adicionado a um droplet Matrigel.
  4. Incube a lâmina de fundo de vidro de 8 poços a 37 ° C por 5 min em uma incubadora umidificada para permitir que o Matrigel polimerize (Figura 2A, etapa 3).
  5. Adicione cuidadosamente 200 μL de meio de cultura suplementado quente a cada poço e incube a 37 ° C com 5% de CO2 (Figura 2B, etapa 4). Substitua o meio por meios de cultura suplementados novos a cada 72 h.
  6. Monitore o DRG usando microscopia de campo claro para avaliar sua viabilidade e crescimento neuronal a cada 24 h (Figura 2C e Figura 3).
    NOTA: A viabilidade pode ser indicada por um aumento no comprimento e densidade de neuritos. As imagens podem ser capturadas ao longo do tempo para demonstrar o desenvolvimento das extensões de células DRG (Figura 3).

8. Cultura DRG dissociada (Figura 4)

NOTA: Qualquer placa multipoços pode ser usada para semear os neurônios DRG dissociados. No entanto, neste protocolo, foram utilizadas lâminas de fundo de vidro de 8 poços por proporcionarem melhor confluência celular e qualidade de imagem para análises de imunofluorescência.

  1. Revestimento de placas de cultura com colágeno
    1. Preparar uma solução de trabalho de 50 μg/ml de colagénio I acidificado em HCl 0,01 M estéril numa cabina de segurança biológica.
    2. Pipete 100 μL de solução de colágeno I em cada poço da lâmina de fundo de vidro de 8 poços. Incline e gire suavemente a lâmina para garantir que a solução de colágeno cubra toda a superfície inferior de cada poço uniformemente. Incubar a lâmina a 37 °C em uma incubadora umidificada por 1 h para garantir a polimerização do colágeno I.
      NOTA: Durante o tempo de incubação, prossiga com as etapas 8.2 e 8.3.
    3. Após a incubação, pipete suavemente qualquer solução residual de colágeno I não polimerizado de cada poço. Enxágue cada poço com 100 μL de PBS. Pipete o excesso de PBS, deixando uma fina camada residual para evitar que o colágeno seque.
      NOTA: A lâmina de fundo de vidro de 8 poços pode permanecer no gabinete de segurança biológica até que os DRGs dissociados estejam prontos para a etapa de semeadura.
  2. Digestão enzimática
    1. Centrifugue suavemente o tubo de 15 mL contendo DRGs extraídos (etapa 6.5) por 5 min a 200 × g em temperatura ambiente para peletizar os DRGs. Remova cuidadosamente o HBSS usando uma pipeta.
    2. Enxágue os DRGs em meio suplementado pré-aquecido, batendo suavemente no tubo para garantir que todo o conteúdo esteja sendo lavado e centrifugue por 5 min a 200 × g para pellet os DRGs.
    3. Pipete o meio e adicione 1 mL de solução de papaína (Figura 4A, etapa 1). Misturar suavemente e incubar durante 20 min a 37 °C numa incubadora de cultura de tecidos. Agite suavemente o tubo para agitá-lo a cada 5 min.
    4. Após 20 min, adicione 4,5 mL de meio suplementado e misture suavemente para neutralizar a papaína. Tubo de centrífuga por 5 min a 400 × g para granular DRGs. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta.
    5. Adicione 1 mL de solução de colagenase IV / Dispase II e incube por 20 min a 37 ° C na incubadora. Agite suavemente o tubo a cada 5 minutos (Figura 4A, etapa 1).
    6. Após 20 min, adicione 4,5 mL de meio suplementado e misture suavemente para neutralizar a solução de colagenase IV / Dispase II. Tubo de centrífuga por 5 min a 400 × g para pellet DRGs. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta.
    7. Adicione 2 mL de meio suplementado e adicione DNase I a uma concentração final de 0,2 mg / mL. Neste ponto, os DRGs são completamente digeridos e podem aparecer como um aglomerado solto (Figura 4A, etapa 2).
  3. Dissociação mecânica
    1. Triture suavemente o DRG, pipetando para cima e para baixo 4-5x usando uma ponta de pipeta de filtro de 1000 μL (Figura 4A, etapa 2).
    2. Execute uma segunda etapa de trituração usando uma ponteira de pipeta de 200 μL 4-5x. Após esta etapa, a amostra aparece turva com alguns aglomerados visíveis de tecido remanescentes (Figura 4A, etapa 2).
    3. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm para um tubo cónico de 50 ml. Enxágue gradualmente o filtro com 10 mL de meio para garantir a filtração completa das células através do filtro (Figura 4A, etapa 3).
    4. Tubo de centrífuga por 5 min a 1.000 × g para células de pellets. Remova o meio do pellet e ressuspenda em 500 μL de meio suplementado (Figura 4A, etapa 4).
    5. Remova qualquer PBS residual dos poços da lâmina de fundo de vidro de 8 poços. Distribuir a suspensão DRG dissociada entre os alvéolos revestidos de colagénio. Incubar as lâminas a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Adicione mais meios conforme necessário e substitua os meios por meios de cultura suplementados novos a cada 48 h (Figura 4B, etapa 5).
      NOTA: As células dissociadas em DRG podem ser contadas usando um hemocitômetro ou câmara de contagem de células e coloração com azul de tripano para garantir um número consistente de células por poço. Para este protocolo, aproximadamente 1 × 105 células foram semeadas em cada poço.
    6. Monitore células derivadas de DRG usando microscopia de campo claro para avaliar a viabilidade e o crescimento neuronal (Figura 4C e Figura 5).
      NOTA: Os neurônios aparecem como corpos celulares arredondados com bordas definidas e podem levar 24 horas ou mais para aderir, enquanto as células não neuronais normalmente se instalam antes dos neurônios. Algum crescimento de neuritos pode ser observado após 24 h e aumenta ao longo do tempo até 7 dias em cultura. As células derivadas de DRG dissociadas e o DRG de montagem total são pré-incubadas por 72 h antes de adicionar células cancerígenas e estabelecer co-culturas.

9. Preparação de suspensões de células cancerígenas e estabelecimento de co-culturas

NOTA: Células cancerígenas aderentes de vários tipos podem ser usadas. Os meios de crescimento e o número de células para co-culturas dependerão da linhagem celular. Recomendamos testes preliminares antes do experimento para determinar o tempo de coleta de células e o número ideal de semeadura de células. O protocolo aqui descrito foi baseado no uso de linhagens celulares de câncer de pâncreas humano PanC1 e MiaPaCa2 e linhagem de câncer de próstata DU-145.

  1. Lave as células com meio sem soro e tripsinize-as por aproximadamente 3 min com 2 mL de tripsina / placa de 10 cm.
  2. Neutralize a tripsina adicionando 6 mL de meio suplementado e pipete suavemente para cima e para baixo para garantir uma suspensão de célula única. Conte as células usando um hemocitômetro e uma coloração azul de tripano.
  3. Suspenda as células cancerígenas a uma concentração de 2 × 105 células/mL em meio suplementado (etapa 1.2).
    NOTA: A densidade celular ideal pode variar dependendo do tamanho da célula, do tempo de duplicação e da duração da cocultura e pode ser ajustada conforme necessário.
  4. DRG de montagem total e co-cultura de células cancerígenas (Figura 6B)
    1. Aspire a mídia de todas as culturas DRG de montagem na lâmina de fundo de vidro de 8 poços.
    2. Pipete suavemente 200 μL da suspensão de células cancerígenas (etapa 9.3) em cima da gota Matrigel contendo todo o DRG de montagem.
      NOTA: Isso garante uma distribuição uniforme das células cancerígenas ao redor da gotícula. Tenha cuidado para não perturbar a gota Matrigel com a ponta da pipeta.
    3. Incubar a lâmina de cocultura em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2. Atualize o meio diariamente lavando com 200 μL de meio suplementado aquecido uma vez e, em seguida, adicionando 300 μL de meio suplementado a cada poço.
      NOTA: Aspire suavemente o meio usando uma pipeta para evitar perturbar a co-cultura de células cancerígenas DRG. Com o tempo, à medida que as coculturas se tornam mais complexas e organizadas, elas também se tornam mais suscetíveis a distúrbios que podem afetar as interações celulares e a integridade da cocultura.
    4. Monitore a co-cultura usando microscópio de campo claro ou fluorescência em intervalos de 24 horas para avaliar o comportamento das células cancerígenas e as interações neuronais (Figura 6B).
      NOTA: A frequência de observação pode ser ajustada com base na linha do tempo experimental e nas interações celulares de interesse.
  5. DRG dissociado e co-cultura de células cancerígenas (Figura 6C)
    1. Aspire o meio das culturas dissociadas na lâmina de fundo de vidro de 8 poços.
    2. Distribua suavemente 200 μL da suspensão de células cancerígenas (etapa 9.3) em cada poço. Siga as mesmas etapas de incubação, atualização do meio e monitoramento descritas para coculturas de montagem inteira (etapas 9.4.3 e 9.4.4).
      NOTA: Para melhor visualização dos processos celulares e interações célula-neurônio cancerígeno, rastreadores de células fluorescentes podem ser adicionados à cultura, seguindo o protocolo do fabricante.

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Resultados

Nosso protocolo descreve o isolamento de células primárias derivadas de DRG de camundongo e o estabelecimento de dois modelos de cultura complementares: culturas DRG dissociadas e DRG montadas inteiras, que nos permitem investigar as interações nervo-câncer em diferentes níveis de complexidade. Uma das principais vantagens deste protocolo é que ambos os tipos de cultura podem ser gerados usando DRGs isolados do mesmo animal, o que minimiza a variabilidade inter-animal e inter-experimental...

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Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve métodos aprimorados para estabelecer culturas de nervos primários DRG 2D e 3D e sua aplicação em co-cultura com células cancerígenas. Este protocolo avança em relação aos métodos anteriores, estabelecendo os dois modelos em paralelo. Como os modelos 2D e 3D são estabelecidos ao mesmo tempo, usando nervos primários isolados dos mesmos animais, a variação interanimal e interexperimental é minimizada e os dados de ambos os modelos podem ser mais facilme...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas operacionais do Canadian Institutes for Health Research (PJT-178274) (LMM), e por uma bolsa Ontario Graduate Scholarship (LCBO), e por uma bolsa da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Finanças 001 (ERP). LMM é a Cátedra Bracken em Genética e Medicina Molecular na Queen's University. Algumas imagens foram geradas em parte usando Biorender.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ferramentas
70 µ Filtro de células mProgene71-229483-ULTUsado para filtrar a suspensão da célula
Corrediças com fundo de vidro de 8 poçosIBidi, Munique, Alemanha80807
Dumont #5 - Fórceps FinoFerramentas de Belas Ciências, Foster City, EUA11254-20
Dumont #5 FórcepsFerramentas de Belas Ciências, Foster City, EUA11252-20
Tesoura finaFerramentas de Belas Ciências, Foster City, EUA91460-11
Fórceps padrãoFerramentas de Belas Ciências, Foster City, EUA91121-12
Tesoura de molaFerramentas de Belas Ciências, Foster City, EUA91500-09
Reagentes
1x solução salina tamponada com fosfatoSigma, St. Louis, EUAD8662-500MLUsado para dissolver enzimas
Suplemento B-27 (50x)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA17504044Usado na concentração de 2% em meios F12
Colágeno bovino tipo ICorning Incorporated, Nova Iorque, EUA354231Usado para placas de revestimento, solução de trabalho 50 e micro; g/mL em HCl 0,01 M
Colagenase Tipo IVSigma-Aldrich, St. Louis, EUAC4-BIOCDissolva em PBS a 1,25 mg / mL, alíquota, armazene a -20 & C
Dissipação IIRoche, Basel, Suíça4942078001Dissolva em PBS a 2,5 mg / mL, alíquota, armazene a -20 & C
DNase IRoche, Basileia, Suíça.11284932001Adicionado na concentração final de  0,2 mg/ml durante a dissociação
Soro fetal bovino (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, EUAF1051Usado na concentração de 10% em meios F12
HBSS (Solução salina balanceada de Hank)Sigma, St. Louis, EUAH6648-500MLPreparado com penicilina-estreptomicina a 1%
Fator de crescimento de Matrigel reduzidoCorning Incorporated, Nova Iorque, EUA356231Descongele aos 4 graus; C durante a noite, mantenha no gelo
Mistura de nutrientes F-12 PresuntoSigma-Aldrich, St. Louis, EUAN6658-500MLMeio basal para preparação de meios de cultura suplementados
PapaínaRoche, Basileia, Suíça.10108014001Dissolva em PBS a 30 U / mL, alíquota, armazene a -20 & C
Penicilina-estreptomicina (100x)Sigma-Aldrich, St. Louis, EUAPág. 4333-100MLUsado na concentração de 1% em meios
Solução Trypan BlueSigma-Aldrich, St. Louis, EUAT8154-100MLAvaliar a viabilidade celular
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA12605-028Para a colheita de células cancerígenas
Anticorpos
anticorpo β-tubulina IIIAbcam (Cambridge, Reino Unido)AB15568Diluição 1:200
Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUAA-11008Diluição 1:2000
Alexa Fluor 594Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUAA-21442Diluição 1:2000
Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUAA-21245Diluição 1:2000
NeuN anticorpoSigma-Aldrich, St. Louis, EUAMAB377Diluição 1:100
< corantes fluorescentes fortes > Sondas
Reagente ActinGreen 488 ReadyProbes (Faloidina)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUAR37110Diluição 1:40
CellTrace Calceína Vermelho-LaranjaThermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUAC34851Rastreador celular usado para visualizar neurônios sob microscópio de fluorescência
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUAH3570Diluição 1:5000

Referências

  1. Thiel, V., et al. Characterization of single neurons reprogrammed by pancreatic cancer. Nature. 640 (8060), 1042-1051 (2025).
  2. Zhu, M., Luo, F., Xu, B., Xu, J. Research progress of neural invasion in pancreatic cancer. Curr Cancer Drug Targets. 24 (4), 397-410 (2024).
  3. Zareba, P., et al. Perineural invasion and risk of lethal prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 26 (5), 719-726 (2017).
  4. Fu, Y., et al. Worst pattern of perineural invasion redefines the spatial localization of nerves in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 11 (766902), (2021).
  5. Hu, J., Chen, W., Shen, L., Chen, Z., Huang, J. Crosstalk between the peripheral nervous system and breast cancer influences tumor progression. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (6), 188828(2022).
  6. Li, J., Mei, S., Zhou, S., Zhao, F., Liu, Q. Perineural invasion is a prognostic factor in stage ii colorectal cancer but not a treatment indicator for traditional chemotherapy: A retrospective cohort study. J Gastrointest Oncol. 13 (2), 710-721 (2022).
  7. Schmitd, L. B., Perez-Pacheco, C., D'silva, N. J. Nerve density in cancer: Less is better. FASEB Bioadv. 3 (10), 773-786 (2021).
  8. Zahalka, A. H., Frenette, P. S. Nerves in cancer. Nat Rev Cancer. 20 (3), 143-157 (2020).
  9. Winkler, F. Neuroscience and oncology: State-of-the-art and new perspectives. Curr Opin Neurol. 36 (6), 544-548 (2023).
  10. Lanigan, L. G., et al. Comparative pathology of the peripheral nervous system. Vet Pathol. 58 (1), 10-33 (2021).
  11. Jiang, S. -H., Zhang, S., Wang, H., Xue, J. -L., Zhang, Z. -G. Emerging experimental models for assessing perineural invasion in human cancers. Cancer Lett. 535 (215610), (2022).
  12. Moysidou, C. -M., Barberio, C., Owens, R. M. Advances in engineering human tissue models. Front. Bioeng. Biotechnol. 8 (620962), (2021).
  13. Bayat, F. K., et al. Adult mouse dorsal root ganglia neurons form aberrant glutamatergic connections in dissociated cultures. PloS ONE. 16 (3), e0246924(2021).
  14. Lin, Y. -T., Chen, J. -C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. J Vis Exp. (140), e57569(2018).
  15. Schmidt, H., Rathjen, F. G. Dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. (58), e3667(2011).
  16. Klimovich, P., Rubina, K., Sysoeva, V., Semina, E. Three-dimensional model of dorsal root ganglion explant as a method of studying neurotrophic factors in regenerative medicine. Biomedicines. 8 (3), 49(2020).
  17. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3d organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS ONE. 12 (7), e0181612(2017).
  18. Melli, G., Höke, A. Dorsal root ganglia sensory neuronal cultures: A tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
  19. Du, J., Sudlow, L. C., Luzhansky, I. D., Berezin, M. Y. Drg explant model: Elucidating mechanisms of oxaliplatin-induced peripheral neuropathy and identifying potential therapeutic targets. bioRxiv. , (2023).
  20. Mo, Y. J., Kim, Y. -S., Kim, M. S., Lee, Y. -I. Advantages of adult mouse dorsal root ganglia explant culture in investigating myelination in an inherited neuropathic mice model. Methods Protoc. 5 (4), 66(2022).
  21. Nguyen, U. N., et al. Type i collagen concentration affects neurite outgrowth of adult rat drg explants by altering mechanical properties of hydrogels. J Biomater Sci Polym Ed. 35 (2), 164-189 (2024).
  22. Ito, K., et al. Histological effects of combined therapy involving scar resection, decellularized scaffolds, and human ipsc-ns/pcs transplantation in chronic complete spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), (2024).
  23. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L., Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).
  24. Berkovitch, Y., Seliktar, D. Semi-synthetic hydrogel composition and stiffness regulate neuronal morphogenesis - pubmed. Int J Pharm. 523 (2), 545-555 (2017).
  25. Carozzi, V. A., Salio, C., Rodriguez Menendez, V., Ciglieri, E., Ferrini, F. 2d vs 3d morphological analysis of dorsal root ganglia in health and painful neuropathy. Eur J Histochem. 65 (Suppl 1), 3276(2021).
  26. Smith, P. R., Meyer, A., Loerch, S., Campbell, Z. T. Protocol for the isolation and culture of mouse dorsal root ganglion neurons for imaging applications. STAR Protocols. 4 (4), (2023).
  27. Bunge, R. P. Expanding roles for the schwann cell: Ensheathment, myelination, trophism and regeneration - pubmed. Curr Opin Neurobiol. 3 (5), 805-809 (1993).
  28. Chen, Z., Fang, Y., Jiang, W. Important cells and factors from tumor microenvironment participated in perineural invasion. Cancers. 15 (5), 1360(2023).
  29. Jang, K., Garraway, S. M. A review of dorsal root ganglia and primary sensory neuron plasticity mediating inflammatory and chronic neuropathic pain. Neurobiol Pain. 15 (100151), (2024).
  30. Hanani, M., et al. Age-related changes in neurons and satellite glial cells in mouse dorsal root ganglia. Int J Mol Sci. 24 (3), 2677(2023).
  31. Martinelli, C., Sartori, P., Ledda, M., Pannese, E. Age-related quantitative changes in mitochondria of satellite cell sheaths enveloping spinal ganglion neurons in the rabbit. Brain Res Bull. 61 (2), 147-151 (2003).
  32. Niwa, H., et al. Differential age-dependent trophic responses of nodose, sensory, and sympathetic neurons to neurotrophins and gdnf: Potencies for neurite extension in explant culture. Neurochem Res. 27 (6), 485-496 (2002).
  33. Adler, J. E. Age-dependent differential regulation of sensory neuropeptides by glial cell line-derived neurotrophic factor. J Neurochem. 71 (1), 170-177 (1998).
  34. Podratz, J. L., et al. Neurotoxicity to drg neurons varies between rodent strains treated with cisplatin and bortezomib. J Neurol Sci. 362, 131-135 (2015).
  35. Lawson, S. N., Biscoe, T. J. Development of mouse dorsal root ganglia: An autoradiographic and quantitative study. J Neurocytol. 8 (3), 265-274 (1979).
  36. Monje, M., et al. Roadmap for the emerging field of cancer neuroscience. Cell. 181 (2), 219-222 (2020).
  37. Silverman, D. A., et al. Cancer-associated neurogenesis and nerve-cancer cross-talk. Cancer Res. 81 (6), 1431-1440 (2021).
  38. Vermeer, P. D., Restaino, A. C., Barr, J. L., Yaniv, D., Amit, M. Nerves at play: The peripheral nervous system in extracranial malignancies. Cancer Discov. 15 (1), 52-68 (2025).

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