Artigo de método

Fabricação de uma matriz cerebral expansível personalizável em diferentes estágios de desenvolvimento

DOI:

10.3791/68638

⸱

20 de fevereiro de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Spinal Cord and Brain Injury Research Center, Department of Physiology, College of Medicine, University of Kentucky, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, University of Kentucky, 3Department of Neurosurgery, University of Kentucky

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um método inovador para construir matrizes cerebrais expansíveis para cortar fatias coronais ou sagitais é descrito para aplicação em leitões neonatais. Essa abordagem econômica utiliza placas de acrílico esculpidas com moldes de gel de agarose, aplica-se a múltiplas espécies e permite a expansão para acomodar o crescimento cerebral.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O interesse crescente em usar leitões recém-nascidos como modelo de estudo para o desenvolvimento e patologia neonatal aumentou a necessidade de uma matriz cerebral para adquirir com precisão as seções histológicas. No entanto, o rápido crescimento do cérebro recém-nascido limita a utilidade das matrizes comercialmente disponíveis a uma janela de desenvolvimento estreita. Portanto, foi desenvolvido um método ajustável de construção de matriz cerebral. Primeiro, um recipiente de vidro foi colocado sobre gelo úmido, e uma camada de gel de agarose a 4% foi colocada no fundo. Em seguida, um cérebro fixado com formol foi colocado sobre essa camada e embutido com gel de agarose a 4%. Após o gel solidificar, o gel acima do cérebro foi cuidadosamente removido e o cérebro foi extraído. A cavidade foi preenchida com gel de agarose a 4% e tinta indiana a 2%. Após a solidificação, o bloco de gel era removido e cortado na espessura desejada (2 mm ou 5 mm) e na orientação (coronal ou sagital) para imprimir os moldes cerebrais em papel de escamas. Os moldes eram copiados para uma série de placas acrílicas transparentes (2 mm ou 5 mm de espessura) e recortados conforme correspondido em uma serra de fita. Por fim, as placas foram montadas e fixadas com três conjuntos de parafusos e porcas através de furos de alinhamento pré-perfurados para construir uma matriz cerebral personalizada. A construção das matrizes coronal e sagital é ilustrada para um cérebro de leitão neonatal do dia 5 com passos de 2 mm e uma matriz coronal para cérebros pós-natal dos dias 32-38 com passos de 5 mm. Ao adicionar ou remover placas acrílicas adequadas, a matriz era ajustada para se adaptar aos vários tamanhos de cérebros de leitão. Assim, um método simples e econômico para personalizar matrizes cerebrais para diferentes tamanhos de animais grandes é introduzido na comunidade de pesquisa neurológica.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O desenvolvimento cerebral dos leitões imita de perto o doshumanos 1,2,3,4. Assim, há um interesse crescente no uso de leitões para estudos pré-clínicos de distúrbios do neurodesenvolvimento, doenças neonatais e pediátricas, e lesões (Figura 1A,B)5,6,7,8,9,10. Como visto na Figura 1, o leitão-nascido, como modelo animal grande, tem um crânio e tamanho cerebral mais próximos dos de um feto humano prematuro (Figura 1A,B), enquanto os crânios adultos de camundongo e rato são pelo menos duas magnitudes menores.

No entanto, existem desafios no uso de mamíferos maiores em pesquisas biomédicas em comparação com os modelos murinos mais amplamente utilizados. Cérebros de leitões neonatais crescem rapidamente durante os primeiros 3 meses após o nascimento. Nas primeiras 5 semanas de vida, o cérebro do leitão quase dobra de peso e triplica de volume (Figura 1C)4,11,12,13. Durante o período que vai de p5 a p38, o crescimento cerebral e o desenvolvimento de giros e sulcos foram notáveis (Figura 1C). O peso e o volume do cérebro do leitão p5 foram de 29,5 g e 18,9 mL, enquanto os dois cérebros do p32 foram de 51,4 e 52,6 g, e 49,6 e 53,5 mL, respectivamente. Aos 38 dias, o cérebro cresceu para 53,7 g e 52,5 mL, representando um aumento de 80% no peso e 170% no volume em relação ao p5. Esse rápido crescimento do cérebro porcino neonatal representa um desafio para a secção histológica precisa dos cérebros de leitões de diferentes idades, linhagens ou sexos, usando uma única matriz.

Matrizes cerebrais comerciais para leitões têm um custo aproximado de $1.000 a $3.600 cada e estão disponíveis apenas em um tamanho, projetadas para uso em leitões com 2 semanas ou menos. Embora existam algumas publicações que utilizaram a técnica de escaneamento 3D e impressão 3D para criar várias matrizes cerebrais para peixes-zebra, camundongos eaves 14, 15, 16, essas matrizes são em escala relativamente pequena. Não existe uma série estabelecida de ressonância magnética ou um gráfico detalhado de crescimento para o cérebro de leitões neonatais, especialmente para aqueles com 2 semanas ou menos. Por isso, criamos vários modelos de corte cerebral usando cérebros coletados entre o dia 5 e o dia 38, com base nos quais foi estabelecido um sistema de matriz cerebral ajustável.

Este protocolo descreve um método inovador para estabelecer modelos cerebrais neonatais de leitões e desenvolver a construção de matrizes cerebrais personalizadas baseada em placas acrílicas, que pode ser usada para seccionamento coronal ou sagital de cérebros em um espectro de tamanhos.

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Protocolo

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Neste artigo, os quatro cérebros de leitões foram obtidos e preparados para coloração histológica após eutanásia humanitária, seguindo um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Kentucky para um estudo separado. Todos os procedimentos em animais foram aprovados, e o cuidado adequado dos animais foi tomado para minimizar o estresse ou a dor associados aos tratamentos ou à eutanásia.

1. Animais

  1. Adquira quatro leitões masculinos naïfs neonatais (pós-natal dia 4, p4) (peso corporal 1,5-1,8 kg) com histórico genético de 62,5% Landrace, 25% Large White, e 12,5% Yorkshire.
  2. Alojar os animais juntos em um cômodo dedicado em um chiqueiro, com o apoio de uma lâmpada de calor e o chão coberto por toalhas. Alimente-os ad libitum com substituto de leite na primeira semana e faça a transição para a ração em pellets às 2-3 semanas.
  3. Monitore a atividade fisiológica e o peso corporal e realize ressonâncias magnéticas semanais sob anestesia isofluorana.
  4. Eutanasiar com overdose de pentobarbital e perfundir transcardialmente com soro fisiológico heparinizado, seguido por formalina tamponada neutra com 10%.
  5. Disseque o cérebro a partir docrânio 17, fixe com formalina durante a noite e depois coloque 30% de sacarose em PBS por 3 dias para criopreservação.

2. Moldagem em gel de agarose

  1. Submerga um recipiente de vidro em um balde de gelo úmido até sua metade da altura (Figura 2A).
  2. Use uma tira plástica resistente como revestimento para o recipiente e certifique-se de que a parte inferior e as laterais estejam totalmente cobertas, mantendo ambas as extremidades pelo menos 5 cm acima da borda superior.
  3. Aqueça 150 mL de PBS em um béquer de vidro a 90 °C em uma placa quente de mexer com um agitador de ímã e adicione e dissolva gradualmente 6 g de agarose para obter um gel de agarose a 4% em PBS.
  4. Despeje uma camada de 0,5-1 cm de espessura no recipiente de vidro (Figura 2B) e espere até que solidifique.
  5. Aplique uma camada fina de óleo mineral topicamente no cérebro (Figura 2C) e coloque o cérebro sobre a camada de gel (Figura 2D).
  6. Deixe a solução de agarose esfriar até 50 °C. Infundir o cérebro com gel de agarose resfriado (Figura 2E) e deixar solidificar (Figura 2F), o que geralmente leva ~10 minutos em gelo úmido.
  7. Remova cuidadosamente a camada superior do gel de agarose acima do cérebro (Figura 2G) com uma sonda cirúrgica e extraia o cérebro do molde solidificado (Figura 2H,I).
  8. Aqueça 98 mL de PBS em outro béquer de vidro a 90 °C em uma placa quente com um mexedor magneto, adicione 4 g de agarose e 2 mL de tinta da Índia, e deixe mexer e misturar bem. Despeje 4% de agarose com 2% de tinta da íntea na cavidade deixada pelo cérebro extraído (Figura 2J) até estar cheia e deixe solidificar sobre gelo úmido por 15 minutos (Figura 2K).
  9. Usando as partes salientes da fita plástica, levante a tira plástica para remover todo o bloco de agarose do recipiente (Figura 2L).

3. Fatiamento em blocos de agarose e cópia de modelos para papel em escala

  1. Para proteger o papel da umidade durante o processo de fatiamento, coloque uma folha de papel em escamas entre duas placas transparentes de acrílico de 0,76 mm (0,03") de espessura (Figura 3A) e coloque a placa de papel-acrílico laminado próxima à borda da bancada.
  2. Fixe quadrados de canto ao banco com grampos em posição apropriada para manter duas placas de acrílico de 5 mm de espessura em pé e segurando firmemente o bloco de gel entre eles com a orientação desejada (sagital na Figura 3). Certifique-se de que a borda de cada placa vertical de acrílico esteja alinhada à mesma linha no papel de escala para usar como referência na fatia do bloco de gel. Use um peso para fixar o bloco de gel na extremidade oposta ao local onde o corte ocorrerá (Figura 3B).
  3. Usando o papel de escamas subjacente como guia, mova o bloco de gel para frente entre as placas de acrílico na etapa desejada (2 mm ou 5 mm), segure a lâmina do microtomo com as duas mãos e corte a parte além da borda frontal da placa acrílica (Figura 3B).
  4. Recolha cada fatia (Figura 3C), coloque em um papel de escala separado (Figura 3D), pressione suavemente a parte tingida com tinta da China do molde no papel de escala para transferir o contorno (Figura 3E), traçe o contorno de toda a seção de gel usando uma caneta, remova a seção de gel e contorne a impressão em tinta da Índia também usando caneta (Figura 3F). Preste atenção em manter a orientação de cada fatia e o modelo copiado consistentes.
  5. Repita os passos 2.3 e 2.4 até que todas as peças de gel sejam copiadas para o papel da escala e numeradas sequencialmente. Reverifique as fatias e suas impressões (imagens representativas das fatias coronais e impressões na Figura 3G,H).

4. Entalhe em placa acrílica

  1. Corte sulcos na grande placa de acrílico com uma faca de acrílico e quebre as placas grandes em pedaços de 10 x 8,5 cm.
    NOTA: O número total de pedaços depende do tamanho do cérebro, espessura desejada da fatia e orientação para fatiar. Geralmente, preparamos 25 pedaços de placas acrílicas de 2 mm para matriz coronal ou sagital para cérebros de leitões neonatais e 15 placas de 5 mm para cérebros maiores para facilitar o manuseio.
  2. Marco três furos de ancoragem na placa de acrílico nas coordenadas x, y medidas a partir do canto inferior esquerdo (em mm): (11, 42); (45, 15); e (88, 42).
  3. Fixe as placas de acrílico com o suporte de quadrados de canto e grampos na plataforma da furadeira. Fure três furos de ancoragem nas coordenadas mencionadas com uma broca de placa acrílica (Figura 4A). Desenhe uma linha de cor no lado direito de todas as placas para indicar a orientação.
  4. Remova o filme protetor da placa acrílica e coloque-o acima do molde no papel de escama, alinhando a borda superior da placa de acrílico com as linhas superiores do molde que foi copiado para o papel de escama. Trace o contorno do cérebro na placa de acrílico com uma caneta permanente (Figura 4B). Rotule a placa sequencialmente, como no modelo.
  5. Corte a placa de acrílico da serra de fita ao longo das linhas do molde (Figura 4C). Alternativamente, use uma ferramenta rotativa com um kit de corte multiuso e uma ponta de entalhe em madeira para remover as áreas indesejadas.
  6. Polir a borda cortada usando a ferramenta rotativa com uma ponta de lixamento para alisar as bordas deixadas pela ferramenta de corte (Figura 4D).
  7. Verifique novamente os cortes nas placas de acrílico contra o molde do papel de escala (Figura 4E). Aparar e polir se necessário.
  8. Pré-monte a matriz empilhando as placas cortadas em ordem sequencial e verifique o alinhamento das placas (Figura 4F).

5. Montagem e expansão da matriz cerebral

  1. Coloque três arruelas entre placas de acrílico, cada uma centralizada em um furo de ancoragem (Figura 5A). Cole ao redor dos furos de ancoragem com supercola do mesmo lado de todas as placas de acrílico para reduzir o tempo de montagem (Figura 5A).
  2. Empilhe as placas de acrílico sequencialmente, insira parafusos de aço inox por cada furo de ancoragem para montar a matriz e aperte as porcas para fixar (Figura 5A).
  3. Aplique o polimento final das bordas cortadas que vão entrar em contato com os cérebros para alisar as placas.
  4. Codifica por cores o topo da matriz para ajudar a identificar as etapas durante o slice. Alternemente colorir as bordas superiores da placa com preto, vermelho e depois blank para formar um padrão. Repita essa etapa até que todas as placas estejam codificadas por cores com o mesmo padrão (Figura 5).
  5. Para ajustar a geometria ou alterar o tamanho da cavidade para melhor se ajustar a certos cérebros, remova ou adicione placas acrílicas selecionadas (Figura 5B) para se adaptar a diferentes tamanhos de cérebro, o que aumenta muito a flexibilidade dessas matrizes e pode economizar materiais e esforço.

6. Fatiamento coronal ou sagital do cérebro

  1. Enrole uma extremidade da lâmina criográfica de alto perfil com fita de laboratório por pelo menos 2 cm de comprimento para proteger a mão do usuário. Coloque o cérebro com segurança na cavidade da matriz. Segurando a extremidade enrolada da lâmina, posicione-a cuidadosamente entre as placas acrílicas da matriz e então corte os cérebros em fatias coronais ou sagitais com o cérebro apoiado e fixado pela outra mão (Figura 6A,B).
    NOTA: Cuidado: 1) Como cada parte do cérebro apresenta texturas diferentes após a fixação de formol, deve-se ter cuidado para aplicar pressão uniforme na lâmina. 2) Além disso, o cérebro do leitão é grande, então é melhor usar um movimento de corte para cortar o cérebro do que um movimento direto de "empurrar para baixo". 3) É fundamental manter o cérebro encaixado na matriz com o apoio da outra mão durante o corte para evitar qualquer inclinação ou mudança de orientação. Pressão excessiva sobre o cérebro contra a matriz deve ser evitada o tempo todo.
  2. Coloque todas as fatias em uma bandeja de 6 poços preenchida com PBS ou bandeja de aço inox. Coloque cuidadosamente as fatias na mesma orientação (Figura 6C, D) e preserve ou prossiga conforme necessário.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um leitão foi eutanasiado com overdose de pentobarbital aos 5 anos de idade. Os outros três animais apresentaram atividades fisiológicas normais e ganho de peso corporal semelhante (atingindo 7,44-8,4 kg). Dois leitões receberam ressonância magnética semanal sob anestesia isoflurana até serem eutanasiados no p32. O quarto leitão permaneceu ingênuo até a eutanásia na página 38.

A semelhança do tamanho da cabeça entre leitão e feto humano pode ser visualizada na...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta a metodologia para criar matrizes cerebrais acessíveis e fáceis de construir que podem ser usadas para ajudar na fatia do cérebro do leitão ou de qualquer outra espécie de grande animal na orientação e espessura desejadas. Importante destacar que, ao contrário das matrizes comerciais de "tamanho fixo" que funcionam apenas com uma faixa limitada de tamanhos cerebrais, essa abordagem permite que a matriz seja convenientemente ajustada ou expandida para se ajustar a...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) #R21-NS114771 (K.E.S.), #R56-NS117587, #R01-EB028792, #R01-HD101508, #R21-HD091118, #R41-NS122722, #R42-MH135825 (G. Y.), American Heart Association (AHA) #16GRNT30820006 (G.Y.) e #14SDG20480186 (L.C.), e pela Área Prioritária de Pesquisa em Neurociência da Universidade de Kentucky (L.C.). Os porcos nascidos machos ingênuos foram adquiridos pela Divisão de Recursos Animais de Laboratório (DLAR) do Centro Suíno da Faculdade de Agricultura da Universidade de Kentucky.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Parafuso para máquina de treliça Phillips de aço inoxidável 1/4"-20 x 3-1/2" (25 unidades), rosca grossa, 18-8 (304) em aço inoxidável, por parafuso conta-gotasLançador de parafusohttps://www.amazon.com/
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3  Calço de Redução de Ombros Plano   Arruela, aço inoxidável 18-8, tamanho de parafuso de 1/2", diametro diametral 0,501", 0,750" de dia-ordem, 0,016" de espessura (pacote de 50)Pequenas Parteshttps://www.amazon.com/Shoulder-
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Substituto de Leite Birthright (Pipestone)PipestoneSKU  8229https://pipevet.com/birthright-baby-pig-milk-replacer
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Kit de Ferramentas Rotativas de Alto Desempenho Dremel 4300-5/40Dremelhttps://www.amazon.com/dp/B0
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Béquer de vidro x 2avantor470335-854
Recipiente de vidroPratos de mancha de WheatonWHEATON®   900303
Caderno de Papel Quadriculado: linhas de grade cinza claro 1 mm de espessura e 10 mm mais grossas (métrica, 120 páginas):https://www.amazon.com/
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HACKER INSTRUMENTS LÂMINA MICROTOME FACAINSTRUMENTOS DE HACKER
Tira plástica de alta resistênciaavantor89072-136
Tinta da Índiaspeedball SUPER PRETO
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Fita de laboratórioavantor76276-016
Loctite 1363589 frasco de 4 gramas Super Cola Ultra Gel Control Adesivo, Pack de 3Loctitehttps://www.amazon.com/Loctite-
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Lâminas descartáveis de alto perfil MicrotomeCiência Ótimahttps://www.amazon.com/Optimal
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Óleo mineralSigma-AldrichM8410-100ml
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Polimento Dica de lixamentoBrocas de rebarba de carboneto de 20 peças de 1/8"
Pellet Pré-Inicial Não Medicinal - #50 (Pipestone)PipestoneSKU  8228https://pipevet.com/pre-starter-pellet-non-med-50-hubbard
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Placa elétrica de mexerCorning100493-718
MisturadorVWR58948-138
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Bandeja cirúrgicaavantor10193-194
gelo úmidoFeito em laboratório
Ponta de Carvign de MadeiraFerramentas de Entalhe em Madeira para Ferramenta Rotativahttps://www.amazon.com/
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1-4669-8272-D5D435EA126F

Referências

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