O Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baseia-se na técnica básica do IBEX, adicionando bloqueio de heparina para minimizar a ligação inespecífica e aproveitando a detecção espectral com desmistura computacional para suprimir a autofluorescência. Essa abordagem acelera a aquisição de imagens enquanto reduz as fontes de fundo, permitindo análises proteômicas espaciais robustas de várias rodadas e de alto parâmetro.
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Artigo de método
Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem altamente multiplexada permite o estudo de células funcionalmente diversas e seus nichos em seus ambientes de tecido nativo. O Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) é uma técnica de imunomarcação cíclica e inativação de fluoróforos que permite que vários marcadores sejam visualizados na mesma seção de tecido. As imagens capturadas podem ser analisadas posteriormente para adquirir dados de célula única para definir clusters de células, suas localizações e tipos de células vizinhas. A interpretação desses dados depende da capacidade de distinguir expressões de marcadores verdadeiros de fontes de fundo inerentes à microscopia de fluorescência. O Spectral IBEX, uma adaptação do protocolo IBEX, integra a detecção confocal espectral com a separação computacional e incorpora o bloqueio da heparina para reduzir a ligação fora do alvo baseada em carga. Essa combinação melhora a relação sinal-fundo, suprime a autofluorescência do tecido e minimiza o sangramento, além de reduzir o tempo de aquisição em comparação com a imagem confocal convencional de várias faixas. A aplicação ao tecido de pólipo nasal humano, um modelo caracterizado por alto conteúdo de eosinófilos e forte autofluorescência, demonstrou imagens confiáveis de 26 marcadores nos compartimentos estrutural, imunológico e de estado celular em seis rodadas de imagem. O fluxo de trabalho resultante gera informações proteômicas de alta dimensão e espacialmente resolvidas que capturam arquitetura complexa de tecidos e nichos celulares. Juntos, essa abordagem otimizada fornece uma estratégia robusta e amplamente aplicável para imagens multiplexadas, particularmente adequada para tecidos onde a autofluorescência e a coloração não específica limitam as abordagens convencionais.
Introdução
Os tecidos são compostos por um conjunto diversificado de células com funções especializadas que se organizam em estruturas tridimensionais e, por meio da interação, coordenam os processos biológicos necessários à vida. A patologia surge quando interrupções na composição celular ou na arquitetura do tecido interferem nessas interações e comprometem a homeostase tecidual1. O conhecimento de como os numerosos tipos de células especializadas se localizam e interagem em nossos tecidos é necessário para entender a biologia subjacente à saúde e às doenças humanas.
Os avanços nas tecnologia....
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Protocolo
Os tecidos dos pólipos nasais usados neste estudo foram coletados durante a cirurgia sinusal na Hamilton Health Sciences com aprovação ética do Hamilton Integrated Research Ethics Board. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes.
1. Coleta de amostras
- Obter amostras durante procedimentos de polipectomia de rotina realizados em pacientes com rinossinusite crônica. Após a remoção cirúrgica, coloque as amostras em um frasco contendo solução salina medicinal no gelo para transporte e processe-as imediatamente para imagem para preservar a integridade do tecido.
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Resultados
Dois desafios fundamentais enfrentados pelas técnicas de imagem de imunofluorescência são a ligação não específica de sondas de anticorpos conjugados com fluoróforo e a autofluorescência tecidual. Este protocolo foi projetado para ajudar a distinguir um sinal verdadeiro do fundo para otimizar as técnicas de imunofluorescência multiplexada.
O bloqueio da heparina reduz a ligação não espec.......
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Discussão
O Spectral IBEX, uma adaptação do protocolo IBEX, aborda com sucesso duas questões-chave na imagem de imunofluorescência: ligação não específica e autofluorescência. O tratamento de tecidos altamente eosinofílicos com heparina e o uso de separação espectral para eliminar a autofluorescência e a sobreposição espectral entre os canais aumentaram significativamente a detecção do sinal verdadeiro acima do fundo. Capturar todos os marcadores em uma única passagem reduz o tempo de aquisição, o.......
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Divulgações
JFEK, MJ recebem financiamento da ALK Abello A/S. JFEK recebe honorários de consulta da Merida Biosciences.
Agradecimentos
Agradecemos aos Drs. Andrea Radtke e Ziv Yaniv por seu apoio durante a integração e iteração do IBEX. Agradecemos aos Drs. João Bronze de Firmino e Mouhanad Babi pelo suporte e solução de problemas da microscopia, e ao Centro de Microscopia de Luz Avançada da McMaster pelo acesso aos seus microscópios. Agradecemos a Tina Walker, Jianping Wen e Rangana Talpe Guruge pelo suporte técnico. Este trabalho é apoiado por uma Bolsa de Pesquisa em Alergia Alimentar revisada por pares, financiada em conjunto pelo Instituto CIHR de Infecção e Imunidade (CIHR-III), Instituto CIHR de Saúde Circulatória e Respiratória (CIHR-ICRH) e a Fundação Canade....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de ácido sulfúrico 2N (H2SO4) | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| Béquer de 500 mL | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| Placa de 6 poços | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| BCL-6 - Alexa Fluor 647 | BD em Biociências | 561525 | Fator de diluição 1:100 |
| Kit de Fixação/Permeabilização de Citofix/Citoperm BD | BD em Biociências | 554722 | |
| Microscópio de dissecação de bancada | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| Albumina Sérica Bovina (BSA) | SIGMA-ALDRICH | A4503 | |
| CD11c - Alexa Fluor 700 | BD em Biociências | 561352 | Fator de diluição 1:100 |
| CD138/Syndecan-1 - PE | BioLegend | 356503 | Fator de diluição 1:200 |
| CD20 - Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53020282 | Fator de diluição 1:100 |
| CD21 - Alexa Fluor 532 | NovusBio | NBP2-60733AF532 | Fator de diluição 1:100 |
| CD23 - PE | BioLegend | 338507 | Fator de diluição 1:200 |
| CD3 - iFluor 594 | AAT Bioquest | 100320C0 | Fator de diluição 1:100 |
| CD31 - Alexa Fluor 700 | BioLegend | 303134 | Fator de diluição 1:100 |
| CD34 - iFluor 594 | AAT Bioquest | 103400C0 | Fator de diluição 1:100 |
| CD38 - Alexa Fluor 700 | BioLegend | 303523 | Fator de diluição 1:100 |
| CD4 - Alexa Fluor 647 | BioLegend | 300520 | Fator de diluição 1:100 |
| CD45 - Alexa Fluor 532 | ThermoFisher Scientific | 58045942 | Fator de diluição 1:100 |
| CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647 | BioLegend | 353113 | Fator de diluição 1:100 |
| Adesivo de Alúmen e Gelatina de Cromo | Oferta de Novos Chegados | 1033A | |
| Cryomold | Fisher Scientific & nbsp; | NC9511236 | Além disso, o Catálogo nº 50-465-347 para amostras maiores |
| Slide de calibração DAPI | Agar Scientific | AG2273 | |
| Solução DAPI, 1 mg/mL | ThermoFisher Scientific | 62248 | Fator de diluição 1:3000 |
| E-cadherina/CD324 - Alexa Fluor 647 | BioLegend | 147307 | Fator de diluição 1:100 |
| EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594 | BioLegend | 324228 | Fator de diluição 1:100 |
| Tubos Eppendorf/Falcon | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Pinças | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| FoxP3 - eFluor 660 | ThermoFisher Scientific | 50577382 | Fator de diluição 1:100 |
| Portas de microscópio de extremidade fosca | ChemScience | GEW45-2575-W | |
| GL7 - Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | 53590282 | Fator de diluição 1:100 |
| Heparina sal sódico | SIGMA-ALDRICH | H3393 | 10KU |
| HLA-DR - PE | NovusBio | NB100-77855PE | Fator de diluição 1:200 |
| Human TruStain FcX (Solução para Bloqueio de Receptores Fc) | BioLegend | 422302 | Fator de diluição 1:100 |
| Câmara de umidade | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| Balde de gelo com tampa | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| IgD - Alexa Fluor 488 | BioLegend | 348215 | Fator de diluição 1:100 |
| IL4Ra/CD124 - PE | BioLegend | 144803 | Fator de diluição 1:200 |
| Conversor de Arquivos Imaris | Instrumentos OXFORD | N/A | Cobrir qualquer formato de arquivo de imagem para o formato .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter) |
| Isopentano (2-Metilbutano) | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| Ki-67 - Alexa Fluor 488 | BD em Biociências | 558616 | Fator de diluição 1:100 |
| Kimberly-Clark Kimberly-Clark Kimtech Science Kimwipes Limpadores Delicados de Tarefa, 1-Camada | Ciência Kimtech | 06-666 | |
| Pinças grandes (ou seja, 25 cm de comprimento) | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| Nitrogênio líquido | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| Borohidreto de lítio (LiBH4) | SIGMA-ALDRICH | 222356 | |
| MECA-79 - Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53603680 | Fator de diluição 1:100 |
| Tampa de lâmina de microscópio Vidro nº 1 22x50 mm | Fisher Scientific & nbsp; | 12-542A | |
| Água Milli-Q | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| MUC2 - Alexa Fluor 488 | NovusBio | NB120-11197AF488 | Fator de diluição 1:100 |
| Cobertura Coberta Camerada Nunc Lab-Tek | ThermoFisher Scientific | 155380 | |
| Caneta PAP | Abcam | AB2601 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| Bisturi | N/A | N/A | O que estiver disponível/usado no laboratório |
| Extensões SimpleITK Imaris | N/A | N/A | Software usado para alinhar imagens de diferentes rodadas (https://github.com/niaid/imaris_extensions) |
| Sacarose | SIGMA-ALDRICH | S0389 | |
| Composto Tecido-Tecido O.C.T. | Sakura Finetek USA | 4583 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Zeiss LSM 980 | Microscopia ZEISS | N/A | O sistema de imagem utilizado neste estudo |
| Zen Blue | Microscopia ZEISS | N/A | O software usado para processamento de imagens pós-aquisição |
Referências
- Hagios, C., Lochter, A., Bissell, M. J. Tissue architecture: The ultimate regulator of epithelial function. Philosoph Trans Royal Soc B: Biol Sci. 353 (1370), (1998).
- Mincarelli, L., Lister, A., Lipscombe, J., Macaulay, I. C. Defining Cell Identity with Single-Cell Omics.
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Reimpressões e permissões
