Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico

Resumo

O Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baseia-se na técnica básica do IBEX, adicionando bloqueio de heparina para minimizar a ligação inespecífica e aproveitando a detecção espectral com desmistura computacional para suprimir a autofluorescência. Essa abordagem acelera a aquisição de imagens enquanto reduz as fontes de fundo, permitindo análises proteômicas espaciais robustas de várias rodadas e de alto parâmetro.

Resumo

A imagem altamente multiplexada permite o estudo de células funcionalmente diversas e seus nichos em seus ambientes de tecido nativo. O Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) é uma técnica de imunomarcação cíclica e inativação de fluoróforos que permite que vários marcadores sejam visualizados na mesma seção de tecido. As imagens capturadas podem ser analisadas posteriormente para adquirir dados de célula única para definir clusters de células, suas localizações e tipos de células vizinhas. A interpretação desses dados depende da capacidade de distinguir expressões de marcadores verdadeiros de fontes de fundo inerentes à microscopia de fluorescência. O Spectral IBEX, uma adaptação do protocolo IBEX, integra a detecção confocal espectral com a separação computacional e incorpora o bloqueio da heparina para reduzir a ligação fora do alvo baseada em carga. Essa combinação melhora a relação sinal-fundo, suprime a autofluorescência do tecido e minimiza o sangramento, além de reduzir o tempo de aquisição em comparação com a imagem confocal convencional de várias faixas. A aplicação ao tecido de pólipo nasal humano, um modelo caracterizado por alto conteúdo de eosinófilos e forte autofluorescência, demonstrou imagens confiáveis de 26 marcadores nos compartimentos estrutural, imunológico e de estado celular em seis rodadas de imagem. O fluxo de trabalho resultante gera informações proteômicas de alta dimensão e espacialmente resolvidas que capturam arquitetura complexa de tecidos e nichos celulares. Juntos, essa abordagem otimizada fornece uma estratégia robusta e amplamente aplicável para imagens multiplexadas, particularmente adequada para tecidos onde a autofluorescência e a coloração não específica limitam as abordagens convencionais.

Introdução

Os tecidos são compostos por um conjunto diversificado de células com funções especializadas que se organizam em estruturas tridimensionais e, por meio da interação, coordenam os processos biológicos necessários à vida. A patologia surge quando interrupções na composição celular ou na arquitetura do tecido interferem nessas interações e comprometem a homeostase tecidual¹. O conhecimento de como os numerosos tipos de células especializadas se localizam e interagem em nossos tecidos é necessário para entender a biologia subjacente à saúde e às doenças humanas.

Os avanços nas tecnologias de perfil de célula única nos níveis transcriptômico, epigenômico e proteômico revelaram uma diversidade excepcional de tipos de células especializadas. ^2,3 Tecnologias como sequenciamento de RNA de célula única e citometria de fluxo espectral podem medir o número de parâmetros necessários para caracterizar essas populações heterogêneas. No entanto, essas abordagens carecem de informações espaciais, pois as células devem ser dissociadas de seu ambiente de tecido nativo em suspensões unicelulares ^4,5. Como tal, tipos de células associados a vários contextos de doenças foram identificados, mas suas interações dentro do tecido e sua contribuição para perpetuar a doença permanecem obscuras.

Para resolver algumas dessas limitações, várias tecnologias espaciais-ômicas foram desenvolvidas para capturar a heterogeneidade celular dentro de um tecido, ao mesmo tempo em que preservam a posição de cada célula⁶. Por exemplo, a transcrição gênica pode ser medida amplificando RNA em pontos rasterizados em uma seção de tecido (por exemplo, Visium) ou usando sondas de hibridização de RNA direcionadas a um painel de genes específicos que são visualizados em resolução de célula única (por exemplo, Xenium) ^{7 , 8} . Esses métodos são eficazes para rastrear padrões transcricionais e mecanismos regulatórios dentro dos tecidos. No entanto, os perfis transcricionais geralmente se correlacionam mal com a expressão de proteínas, que reflete mais diretamente as capacidades funcionais de uma célula⁹. A expressão proteica pode ser identificada por meio de anticorpos específicos conjugados a fluoróforos, que podem ser detectados por microscopia de fluorescência^10,11. O uso da microscopia de fluorescência tradicional pode permitir imagens discretas de mais de seis desses fluoróforos conjugados com anticorpos. No entanto, os perfis de excitação e emissão sobrepostos desses fluoróforos resultam em incerteza quanto à origem do sinal de fluorescência em qualquer canal¹².

O Iterative Bleaching Extends multipleXity (IBEX) é um método de imagem de alto conteúdo que foi desenvolvido para superar essa limitação da microscopia de fluorescência 13,14,15. O IBEX usa borohidreto de lítio (LiBH₄) para inativar quimicamente os fluoróforos após a imagem, permitindo que a mesma amostra de tecido seja corada novamente com uma rodada subsequente de anticorpos conjugados com fluoróforo antes da recriação da imagem. O IBEX preserva a integridade do tecido, permitindo que muitas rodadas de imagem visualizem um número teoricamente ilimitado de marcadores na mesma seção de tecido. O alinhamento computacional das imagens adquiridas fornece caracterização em nível ômico na resolução de uma única célula, preservando os dados espaciais para revelar nichos celulares. Esses dados também podem revelar possíveis interações celulares, embora devam ser validadas por outras técnicas¹⁶. O IBEX é um método de código aberto compatível com fluoróforos disponíveis comercialmente e é apoiado por uma comunidade internacional de pesquisadores que validaram reagentes e compartilham dados publicamente para promover acessibilidade, adoção rápida e geração de dados de alta qualidade ^17,18.

Neste trabalho, um protocolo modificado de IBEX foi projetado para superar dois grandes desafios da técnica: autofluorescência tecidual e ligação não específica de sondas de anticorpos conjugados com fluoróforo (coletivamente referidas como background). A autofluorescência surge quando a excitação de moléculas fluorescentes endógenas a um tecido emite luz que se sobrepõe ao sinal desejado obtido de fluoróforos conjugados com anticorpos ^19,20. A ligação fora do alvo ou não específica de anticorpos conjugados com fluoróforo resulta em fluorescência de células ou estruturas que não expressam a proteína alvo^21,22. Esses artefatos podem resultar na conclusão imprecisa de que uma célula expressa um marcador que ela não expressa verdadeiramente, complicando assim as análises computacionais e a atribuição precisa do tipo de célula. Ao combinar a neutralização de carga baseada em heparina do sinal fora do alvo com aquisição espectral completa e desmistura computacional, o IBEX espectral reduz significativamente o sangramento, melhora a relação sinal-fundo (SBR) e reduz pela metade o tempo de aquisição por rodada.

Protocolo

Os tecidos dos pólipos nasais usados neste estudo foram coletados durante a cirurgia sinusal na Hamilton Health Sciences com aprovação ética do Hamilton Integrated Research Ethics Board. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes.

1. Coleta de amostras

1. Obter amostras durante procedimentos de polipectomia de rotina realizados em pacientes com rinossinusite crônica. Após a remoção cirúrgica, coloque as amostras em um frasco contendo solução salina medicinal no gelo para transporte e processe-as imediatamente para imagem para preservar a integridade do tecido.

2. Preparação do reagente

1. Prepare a solução de fixação e permeabilização diluindo a solução de fixação e permeabilização obtida a 1:4 em PBS. Prepare a solução de criopreservação como sacarose a 30% em PBS. Preparar o tampão de diluição a 0,1% v/v Triton X-100 em PBS.
2. Prepare o reagente de bloqueio BSA como albumina sérica bovina a 1% p / v em tampão de diluição. Prepare o reagente do bloco de heparina como sal de heparina sódica 10KU em 1 mL de PBS. Prepare o tampão de bloqueio misturando o reagente em bloco de heparina (1:50) com o reagente em bloco Fc (1:100) no reagente em bloco BSA.
3. Prepare a mistura de coloração como anticorpo titulado em diluições apropriadas no tampão de bloqueio. Prepare a solução clareadora adicionando 10 mg de LiBH₄ em 10 mL de água ultrapura.

3. Processamento de tecidos e macroscopia

1. Inspecione o tecido sob um microscópio de dissecção (normalmente com ampliação de ~ 15x, embora isso possa variar dependendo da amostra e do microscópio) e remova a gordura e o osso com uma pinça e um bisturi. Para melhor preservar o tecido, use instrumentos limpos, trabalhe em uma superfície fria e úmida e minimize a duração do processamento.
2. Os tecidos macroscópicos > 0,5 cm de espessura em fatias de 4-5 mm com bisturi²³. Mergulhe as fatias em solução de fixação e permeabilização e gire a °C por 16 h.
   NOTA: O volume desta solução e das outras na etapa 3.3 deve ser aproximadamente 20x o volume da amostra, em um tubo de tamanho apropriado.
3. Mova o tecido para PBS e enxágue por 5 min. Mergulhe o tecido em solução de criopreservação e incube a °C por 16 h. Não lave após esta etapa, pois isso reintroduziria água no tecido.

4. Congelamento de tecidos

1. Rotule uma placa de 6 poços com o experimento e os detalhes da amostra acima de cada poço e coloque-a em um freezer a -20 ° C para esfriar por pelo menos 20 min.
2. Encha um criomoldor de tamanho apropriado com composto de temperatura de corte ideal (OCT). Evite criar bolhas na OCT. Arraste as bolhas grandes para as bordas do criomoldor usando uma agulha ou ponta de pipeta.
   NOTA: Um criomold pode ser feito usando papel alumínio enrolado em um pequeno frasco ou tubo de fundo plano.
3. Remova o tecido da solução de criopreservação. Passe suavemente o lenço em um lenço de papel sem fiapos para remover o excesso de líquido, pois isso pode comprometer o congelamento.
4. Encher um copo de 250 ml com cerca de 100-150 ml de isopentano numa hotte e colocá-lo numa caixa de espuma ou num refrigerador parcialmente cheio de azoto líquido.
   NOTA: O isopentano evapora se deixado aberto por mais de 2 h; Use imediatamente após a abertura. O isopentano facilita o congelamento uniforme e rápido do tecido. O isopentano pode congelar lentamente ao longo do tempo. Se congelar, retire o copo do nitrogênio líquido e deixe-o descongelar. O isopentano pode ser derramado em uma garrafa de vidro com tampa para ser reutilizado em até 5x. O nível de isopentano deve ser superior ao azoto líquido para evitar que o copo flutue ou tombe.
5. Ajustar a orientação do tecido conforme desejado na OCT ao microscópio de dissecação.
   NOTA: Para tecidos de pólipos nasais, normalmente orientamos a amostra ao longo de seu eixo longo para obter seções simétricas que capturam a maior área de seção transversal possível. Consulte os manuais de histologia do tecido de interesse para obter a orientação ideal da incorporação.
6. Mergulhe o fundo do criomold no isopentano. Remova o criomold do isopentano quando o centro do tecido estiver totalmente branco e opaco. Evite submergir completamente o criomolde; O bloco pode rachar, comprometendo o seccionamento.
7. Retire suavemente o bloco do criomold, aplicando pressão na parte de trás, e coloque-o na placa pré-arrefecida de 6 poços a -20 °C. Depois de congelar todas as amostras, transfira a placa para um freezer a -80 °C para armazenamento de longo prazo.
   NOTA: Este é um ponto de pausa. Os tecidos podem ser armazenados a -80 °C por anos.

5. Preparação da lâmina e crio-seccionamento

1. Pipetar 10-1 μL de adesivo de gelatina de alúmen cromado nas lâminas; espalhe uniformemente e seque ao ar por 15 min. Para uma adesão ideal, aplique adesivo de gelatina de alúmen cromado em vidros de cobertura com câmara 2x-3x, adicionando 5 μL por aplicação (total de 15 μL).
2. Após a secagem, coloque as lâminas em um forno a 80 °C por 1 h para garantir a secagem completa. Se utilizar uma lamínula com câmara, deixe-a secar a 37 °C durante a noite, uma vez que o plástico pode derreter a 80 °C.
   NOTA: Uma vez que as lâminas são revestidas e secas, elas podem ser armazenadas em temperatura ambiente por dias até serem usadas. Eles devem ser cobertos para evitar poeira.
3. Transfira os tecidos de -80 ° C a -20 ° C (ou para o criostato na temperatura de corte) para equilibrar e pré-resfrie por 1 h antes do seccionamento. Corte seções de 10-2 μm em um criostato²⁴.
   1. Se seccionar em uma lamínula com câmara, pegue suavemente a seção usando uma pinça depois de levantar a placa estabilizadora. Use um pincel para colocá-lo no vidro dentro da câmara. Pressione o polegar sob a amostra na parte inferior da lamínula para derreter a seção no vidro.
4. Secar as lâminas a 3 °C durante 1 h ou à temperatura ambiente durante 24 h.
   NOTA: Se as lâminas forem usadas imediatamente, elas podem ser armazenadas temporariamente em temperatura ambiente em uma caixa de lâminas para protegê-las da poeira enquanto se preparam para a coloração. No entanto, se não forem usados imediatamente, armazene-os a -80°C para preservar a integridade do tecido. Este é um ponto de pausa. Se as lâminas forem armazenadas a -80 °C, o processo pode ser pausado aqui.

6. Bloqueio e imunomarcação de anticorpos

1. Desenhe um círculo no vidro ao redor do tecido usando uma caneta PAP para criar uma barreira hidrofóbica que contenha o líquido durante a coloração ou outras etapas. Não desenhe sobre a OCT, pois a tinta hidrofóbica será lavada quando a OCT se dissolver.
   NOTA: Esta etapa não é necessária para a lamínula com câmara, pois as paredes retêm o líquido no poço.
2. Adicione ~ 100 μL de PBS a cada tecido e incube por ~ 2 min em temperatura ambiente para reidratar os tecidos e lavar a OCT. Use ~ 1 mL de PBS para vidro de cobertura com câmara.
   NOTA: Para evitar que o tecido se levante do vidro, não pipete o líquido diretamente sobre a amostra.
3. Aspire o PBS e adicione 100 μL do tampão de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente numa câmara de humidade coberta durante 1 h. Use ~ 400 μL de tampão de bloqueio para vidro de cobertura com câmara.
4. Aspirar o tampão de bloqueio e adicionar 100 μL da mistura de coloração. Incubar numa câmara de humidade coberta, colocada no interior do frigorífico (4 °C) durante a noite. Use ~400 μL da mistura de coloração para vidro de cobertura com câmara. Preparar cortes corados com apenas um dos fluoróforos do painel, e um controlo negativo sem quaisquer manchas, para definir o espectro dos fluoróforos e a autofluorescência dos tecidos.
   NOTA: As diluições de anticorpos devem ser otimizadas experimentalmente titulando para 1:50, 1:100 e 1:200, ou outra diluição, conforme necessário. Escolha a quantidade mínima de anticorpos que produzirá o sinal ideal. Procure que as intensidades de todos os anticorpos no painel sejam aproximadamente equivalentes para maximizar a eficácia da separação espectral. Proteja as amostras da luz além desta etapa para minimizar o fotobranqueamento dos fluoróforos.
5. Aspire a mistura de coloração e lave 3x com PBS (10 μL, 2 min cada), aspirando o líquido entre cada lavagem. Use ~ 1 mL de PBS para vidro de cobertura com câmara.
6. Adicione ~10 μL de mídia de montagem a cada seção. Pipete lentamente para evitar bolhas de ar que criarão aberrações ópticas durante a geração de imagens. Aspire todas as bolhas que se formarem usando uma pipeta. Para vidro de cobertura com câmara, adicione 1 mL de mídia de montagem a cada poço.
   NOTA: As etapas a seguir, 6.7 e 6.8, não são necessárias para a lamínula com câmara.
7. Coloque suavemente a lamínula nº 1 de 22 mm x 50 mm sobre a amostra.
   NOTA: As bolhas podem ser minimizadas pressionando firmemente uma extremidade da lamínula na mídia de montagem e permitindo que o vidro caia sobre a amostra, espalhando o meio uniformemente. A espessura da lamínula deve corresponder às especificações da lente objetiva (por exemplo, lamínula # 1.5 para a maioria das objetivas de abertura numérica alta). Se a lente objetiva tiver um colar de correção, certifique-se de que ele esteja ajustado para o tamanho correto da lamínula. Usar a espessura ou a configuração de colar erradas pode causar aberração esférica e resultar em imagens borradas ou distorcidas.
8. Vire o slide e pressione suavemente sobre um pano sem fiapos para empurrar o excesso de meio de montagem.
   NOTA: Evite empurrar para baixo com muita força no slide. A força excessiva pode danificar ou deformar o tecido, o que pode afetar o alinhamento entre as rodadas de imagem.

7. Configuração e imagem do microscópio

NOTA: Este protocolo refere-se especificamente ao ZEISS LSM980 e a outros sistemas ZEISS. Essas etapas podem ser diferentes em outros sistemas. Dois fluxos de trabalho são detalhados: confocal + desmistura tradicional (aquisição multipista com desmistura espectral computacional post hoc), que pode ser usado quando um detector espectral não está disponível, mas que tem tempos de aquisição mais longos e algum sangramento residual; e detecção espectral completa (aquisição espectral de passagem única e 34 canais), nosso método preferido, pois fornece o melhor SBR, diafonia quase zero e tempos de imagem mais rápidos.

1. Microscopia confocal tradicional
   1. Ligue o sistema de microscópio (incluindo lasers, detectores e o computador) aproximadamente 30 minutos antes da geração de imagens.
   2. Na tela de controle do microscópio acessada clicando em Microscópio > Objetivas, selecione a lente objetiva apropriada (por exemplo, 20x 0,8 NA) e limpe-a com um lenço à prova de lentes, se necessário.
   3. Monte a amostra com segurança no palco. Tente alinhar o vidro ou a câmara de vidro de cobertura contra o mesmo canto/extremidade do suporte deslizante para facilitar o alinhamento XY de rodadas consecutivas. Isso dependerá do suporte instalado.
   4. Concentre-se na amostra usando as oculares na iluminação GFP, YFP ou RFP e, em seguida, alterne para a guia Aquisição na tela do computador.
      NOTA: Não use o filtro DAPI ao focar a amostra usando as oculares, pois expor a mancha DAPI à luz UV (usando o cubo do filtro DAPI) fará com que ela se fotoconverta em uma molécula verde fluorescente (Figura Suplementar 1A).
   5. Configure trilhas de imagem que minimizem a sobreposição e a excitação do laser cruzado (Tabela Suplementar 1, Tabela Suplementar 2 relata as configurações de aquisição para experimentos tradicionais de microscopia confocal mostrados aqui).
      NOTA: As combinações ideais envolvem picos distintos de excitação e emissão, como DAPI ou AF488 junto com AF594, AF647 ou AF700.
      1. Atribua o(s) laser(s) de excitação ideal para cada faixa. Ajuste o tamanho do orifício para 1 UA ou Airy Unit para cada trilha para um corte óptico ideal.
      2. Ajuste a faixa de comprimento de onda de aquisição para cada detector sintonizável na trilha separadamente, de acordo com os fluoróforos da trilha.
      3. Ajuste as configurações de potência do laser e ganho do detector para maximizar o SBR. Certifique-se de que poucos pixels, se houver, atinjam a intensidade máxima.
         NOTA: Para evitar fotobranqueamento e/ou superexposição dos detectores, mantenha a potência do laser o mais baixa possível. Otimize as diluições de anticorpos para que um sinal forte seja detectado acima do fundo.
   6. Pressione o botão Modo de varredura contínua para visualizar a amostra e definir os parâmetros de varredura (velocidade de varredura, resolução e média, se necessário).
      NOTA: Para ladrilhos pequenos e para minimizar o fundo, recomenda-se um tempo de permanência entre 0.2-0.3 μs, com 1-2 rodadas médias. Para maximizar a velocidade e preservar a segmentação e a resolução de célula única, use a velocidade de varredura mais rápida sem média e um tamanho de pixel de 0,2-0. μm/pixel. Por exemplo, a geração de imagens a 2048 x 2048 pixels por bloco com uma objetiva de 20x/0,80 NA produz 0,20 μm/pixel em um campo de 424,26 x 424,2 μm².
   7. Execute varreduras de teste para cada faixa para verificar se há diafonia ou sangria.
      1. Na lâmina corada com todos os marcadores, no modo de varredura contínua, inicie cada laser em baixa potência e levante-o apenas até que o marcador esteja claramente visível sem saturação (use o indicador LUT/saturação).
         NOTA: Se possível, recomenda-se usar uma amostra replicada ou uma região indesejada para otimizar as configurações do microscópio antes de obter imagens da amostra experimental. Isso é especialmente importante ao colorir com DAPI (para evitar o risco de fotoconversão) ou fluoróforos que fotobranqueiam rapidamente (por exemplo, PE).
      2. Vá para o controle de coloração única para esse fluoróforo. Ajuste a potência do laser e o ganho do detector para que o sinal seja brilhante e insaturado.
      3. Na mesma lâmina de coloração única, verifique todos os outros canais de detecção. Se a intensidade fora do canal exceder o fundo, estreite a janela de detecção e/ou diminua a excitação/ganho.
      4. Repetir 7.1.7.1-7.1.7.2 para cada fluoróforo. Após qualquer ajuste, verifique brevemente as colorações previamente otimizadas para manter as intensidades comparáveis, especialmente para marcadores que co-localizam.
   8. Habilite o recurso Blocos e defina uma região de aquisição de blocos.
      1. Otimize o foco para a região de aquisição do ladrilho no centro do tecido. Encontre um recurso exclusivo (um conjunto de células em um determinado arranjo) como referência para alinhamento em rodadas posteriores.
   9. Ative o recurso Z-stack e vá para a guia Z-stack. Vá para a guia Centro. Defina o número de fatias na pilha Z para pelo menos 6, com um intervalo de pelo menos 1 μm entre as fatias. Em seguida, clique no botão Central para posicionar o ponto de foco atual (determinado na etapa 6.1.8.1) como a fatia do meio da pilha.
   10. Clique no botão Iniciar experimento para começar a adquirir as imagens. Salve as configurações de aquisição e faça backup dos dados da imagem clicando com o botão direito do mouse na miniatura da imagem e selecionando Salvar como. Em seguida, escolha o local do arquivo e nomeie a imagem.
   11. Desfaça a mistura da imagem usando as mesmas configurações otimizadas da aquisição da região lado a lado, capture um Snap de cada controle de coloração simples para obter o espectro de sinal verdadeiro e do controle não corado para capturar fundo/autofluorescência, preparado na Etapa 6.4.
       1. Essas imagens são usadas para desmistura espectral; Não selecione o sinal verdadeiro de amostras multiplexadas. Confirme se a região selecionada realmente representa o sinal, primeiro garantindo que a intensidade/morfologia esteja ausente ou equivalente ao fundo no controle não corado e, em seguida, combinando a localização esperada do marcador (por exemplo, membrana vs nuclear vs citoplasmático vs padrões secretados).
       2. Abra a imagem de snap. Clique na guia Desmisturar . Use uma das ferramentas de seleção de região na guia Ferramentas de desmistura para desenhar um ROI em torno do sinal positivo (um espectro dessa região aparecerá). Repita isso para cada imagem instantânea de cada fluoróforo para criar espectros de referência para desmisturar.
          1. Compare esse espectro com o espectro teórico do fluoróforo para garantir que a região selecionada seja representativa do sinal verdadeiro. Nomeie o espectro de acordo com cada fluoróforo e salve-o no banco de dados espectral.
             NOTA: Um espectro para autofluorescência pode ser identificado e tratado como um fluoróforo separado para desmisturá-lo de outros sinais. Após a otimização completa do painel, não é necessária a aquisição de novas referências, pois é possível reutilizar as mesmas configurações, desde que o mesmo protocolo e tipo de tecido sejam usados.
       3. Carregue a imagem lado a lado e navegue até a ferramenta Desmisturar. Use o botão + para adicionar os espectros de referência de cada fluoróforo à lista de separação e clique no botão Separação linear .
   12. Salve a imagem não misturada para análise posterior.
       NOTA: A saída é uma imagem multilado a lado com um canal para cada marcador. O experimento pode ser pausado aqui antes de continuar.
   13. Adquirir imagem de referência de sombreamento
       1. Usando a mesma configuração exata usada para obter a imagem da amostra, adquira uma imagem de uma lâmina de calibração DAPI. Salve a imagem e extraia apenas o canal DAPI para servir como referência de sombreamento. A saída é uma imagem de campo plano (Figura Suplementar 1B).
          NOTA: Uma imagem de referência não precisa ser adquirida para cada amostra. Desde que o mesmo instrumento com as mesmas configurações seja usado, a referência deve ser a mesma. Não há necessidade dessa referência se as imagens adquiridas não tiverem artefatos de sombreamento, conforme mostrado na Figura Suplementar 1C.
2. Microscopia confocal espectral
   1. Ligue o sistema de microscópio (incluindo lasers, detectores e o computador). Selecione a lente objetiva apropriada (por exemplo, 20x 0.8 NA ou qualquer outra objetiva) e limpe, se necessário.
   2. Monte a amostra com segurança no palco. Certifique-se de que a lamínula esteja voltada para o objetivo.
   3. Foque a amostra usando campo claro ou DIC e, em seguida, mude para o modo de fluorescência. Configure a aquisição espectral. A Tabela 3 suplementar relata as configurações de aquisição para experimentos de microscopia confocal espectral mostrados aqui.
      1. Atribua os lasers corretos.
         NOTA: Alguns lasers podem excitar vários fluoróforos. Portanto, pode não ser necessário ter um laser exclusivo para cada fluoróforo.
      2. Selecione um divisor de feixe apropriado para as linhas de laser que estão sendo usadas. Permita que todos os detectores capturem o máximo possível do espectro. Ajuste o tamanho do orifício para 1 UA para um corte óptico ideal.
   4. Otimize a configuração do laser
      1. Usando uma seção corada com todos os marcadores, inicie o modo de varredura contínua com lasers em baixa potência. Ajuste a intensidade de cada laser até que os marcadores possam ser identificados em um bom SBR.
         NOTA: Embora isso não permita um ajuste preciso para fluoróforos espectralmente sobrepostos, ajudará a minimizar o número de vezes que as lâminas coradas individualmente devem ser trocadas para o microscópio.
      2. Use seções de coloração única para ajustar as intensidades do laser para cada fluoróforo. Alterne iterativamente de seções de coloração única de volta para a seção com todos os marcadores até que o sinal de cada marcador possa ser visualizado sem supersaturação.
         NOTA: Sempre que uma configuração de intensidade ou ganho do laser for ajustada, revisite as lâminas de coloração única otimizadas anteriormente para garantir que o sinal permaneça ideal. Para a separação ideal, os níveis de intensidade do sinal devem ser o mais semelhantes possível entre os marcadores, especialmente entre os marcadores que colocalizam. Se possível, recomenda-se usar uma amostra replicada ou uma região indesejada para otimizar as configurações do microscópio antes de obter imagens da amostra experimental. Isso é especialmente importante ao colorir com DAPI (para evitar o risco de fotoconversão) ou fluoróforos que fotobranqueiam rapidamente (por exemplo, PE).
   5. Execute as etapas 7.1.8 a 7.1.14.

8. Remoção da lamínula (aplica-se apenas a slides, não a lamínula com câmara)

1. Mergulhe a lâmina em PBS e deixe a lamínula se soltar. Não tente forçar a lamínula, pois isso pode deformar o tecido, causando problemas de alinhamento em rodadas de imagem subsequentes ou descolamento completo da lâmina. Use um recipiente grande o suficiente para caber no slide e certifique-se de que ele possa ser completamente submerso em PBS.

9. Branqueamento e ciclagem de fluoróforo

1. Apenas para vidro de cobertura com câmara: aspire o máximo possível de mídia de montagem usando uma pipeta, tomando cuidado para não danificar o tecido.
   NOTA: Inclinar a câmara para o lado pode facilitar a aspiração.
2. Lave 3x com ~1 mL (lamínula com câmara) ou ~100 μL (lâminas) de PBS por 2 min até que a mídia de montagem seja totalmente removida.
3. Preparar a solução de branqueamento na hotte. Pesar 10 mg de LiBH₄ diretamente em um béquer seco usando uma microespátula. Adicione cuidadosamente 10 mL de água ultrapura diretamente no béquer contendo LiBH₄ e misture até dissolver completamente para fazer a solução de branqueamento.
   NOTA: Prepare-se imediatamente antes de usar para obter a máxima reatividade.
   CUIDADO: LiBH₄ é extremamente inflamável, portanto, esta etapa requer extremo cuidado - certifique-se de que a hotte seja usada corretamente (ou seja, caixilho na altura adequada, EPI adequado, etc.) e trabalhe apenas com <10 mg de LiBH₄ de cada vez. Certifique-se de que o copo esteja completamente seco antes de adicionar LiBH4 - não fazer isso pode resultar em incêndio.
4. Adicionar ~100 μL de solução clareadora, usando uma pipeta de vidro Pasteur, a cada seção de tecido e incubar à temperatura ambiente na capela de exaustão por 15 min. Use 2 mL de solução clareadora para lâminas de câmara.
5. Se branquear corantes BV (por exemplo, BV421, BV510, etc.), mova cuidadosamente o poço para um microscópio epifluorescente. Selecione o filtro DAPI, foque a amostra e ilumine-a na potência máxima.
   1. Use a objetiva 5x para um maior campo de iluminação. Abaixe o stage o mais baixo possível para evitar danos às objetivas e à carcaça.
6. Transvase a solução de LiBH₄ para fora do poço com uma pipeta de vidro Pasteur e adicione-a de volta ao copo da solução de LiBH₄ .
   NOTA: Este é agora o desperdício LiBH₄; A solução não pode ser armazenada para uso futuro.
7. Lave as lâminas 3x com tampão de diluição e incube por ~ 3 min. O volume total é de 2 mL para as lâminas da câmara.
8. Adicione a mistura de anticorpos e core de acordo com o protocolo normal (Etapas 6.3 - 6.8).
9. Adicionar 2N H₂SO₄ gota a gota aos resíduos LiBH₄ na hotte, misturando regularmente.
   CUIDADO: LiBH₄ irá borbulhar agressivamente. Essas bolhas são gás H₂ sendo liberado do LiBH₄; H₂ é muito inflamável, portanto, tome muito cuidado nesta etapa e adicione H₂SO₄ muito lentamente.
10. Despeje-o em uma almofada absorvente quando a solução não borbulhar mais. Lave o copo com água ultrapura e despeje-o na almofada absorvente.
    CUIDADO: Coloque a resguardo absorvente em um saco de risco químico/biológico, prenda-a e descarte de acordo com as diretrizes locais de risco químico.

10. Processamento pós-aquisição de imagem

1. Abra a imagem de referência (da etapa 7.1.14) no software Zen clicando em Arquivo > Abrir > Selecionar imagem de referência.
   NOTA: As etapas de processamento de imagem pós-aquisição podem ser executadas em pacotes de software de código aberto. (por exemplo, ImageJ).
2. Ajuste o brilho e o contraste para otimizar a faixa dinâmica clicando em Processamento > Intensidade > Contraste Esticar > Aplicar > Automático.
3. Altere o tipo de pixel para 32 bits clicando em Processamento > imagem > Converter tipo de pixel > 32 bits (Float).
4. Normalize a imagem de referência clicando em Intensidade do > de processamento > Normalizar (pixels saturados = 0%) > Aplicar.
5. Suavize a imagem de referência clicando em Processamento > Suavizar > Gaussiano > insira o raio (por exemplo, 2-5 px) > Aplicar (Figura Suplementar 1B).
   NOTA: Otimize o raio de desfoque gaussiano tentando valores diferentes. Para saber a divisão de valor correta (calculadora de imagem de > de processo), a imagem de referência bruta pela imagem processada e a imagem resultante devem ter intensidade uniforme (todos os pixels aproximadamente o mesmo valor).
6. Abra a imagem de vários blocos a ser corrigida clicando em Arquivo > Abrir > selecionar imagem de vários blocos.
7. Aplique a correção de costura e sombreamento usando a referência processada clicando em Processamento > Costura com os seguintes parâmetros.
   1. Marque a caixa de mesclagem. Marque a caixa de sombreamento correta e, no menu suspenso, escolha a imagem de referência processada (etapa 10.5). Mantenha todos os outros parâmetros iguais.
      NOTA: Os parâmetros podem precisar de ajuste para obter os melhores resultados.
   2. No menu Entrada/Saída, escolha a imagem de vários blocos como entrada e a referência de sombreamento como referência.
   3. Pressione o botão Aplicar na parte superior e uma nova imagem com costura e sombreamento corrigidos será gerada (Figura Suplementar 1D).
      NOTA: A correção de costura (Figura Suplementar 1I-J) é necessária para garantir a precisão do alinhamento da imagem posteriormente no processo.
   4. Salve a imagem corrigida clicando em Arquivo > Salvar > Selecionar pasta.

11. Alinhamento da imagem

1. Converta as imagens processadas de qualquer formato em que estejam (.czs, .tif, etc.) para o formato Imaris usando a ferramenta Imaris File Converter.
   NOTA: A ferramenta pode ser baixada e instalada seguindo as instruções neste site (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter).
2. Inicie a ferramenta de registro de extensões Imaris para registrar (alinhar) as imagens de todas as rodadas em uma imagem com todos os canais.
   NOTA: Para instalar a ferramenta e alinhar as imagens com sucesso, siga as instruções no seguinte website (https://github.com/niaid/imaris_extensions).
3. Clique no botão Imaris Extensions . Selecione Utilitários SimpleITK > Exportar configurações de canal para CSV.
4. Clique em Procurar, navegue até uma imagem .ims (de uma das rodadas), selecione-a e clique em Abrir.
5. Clique em Exportar e escolha um local para salvar o arquivo CSV. Insira um nome e clique em Salvar.
6. Abra o arquivo CSV salvo e verifique se os nomes dos canais estão corretos. Edite se necessário.
7. Se forem feitas edições, vá para Extensões Imaris > Utilitários SimpleITK > Definir configurações de canal em lote.
   NOTA: Esta etapa não é necessária se nenhuma edição foi feita na etapa anterior.
8. Clique em Procurar, navegue até o arquivo CSV, selecione-o e clique em Abrir. Clique em Avançar e, em seguida, em Procurar novamente para selecionar a mesma imagem .ims e clique em Abrir.
9. Clique em Configurar para aplicar as alterações. Repita as etapas 11.3 a 11.8 para todas as imagens de rodadas diferentes.
10. Depois que os canais estiverem nomeados corretamente, vá para Extensões Imaris > Algoritmos SimpleITK > Registro Afim de Pilhas Z Usando um Canal Comum.
11. Clique em Procurar, navegue até a pasta que contém todas as rodadas, selecione todas as imagens e clique em Abrir.
12. Clique em Avançar, selecione o canal de registro (canal fiducial). Para este protocolo, foi utilizado o canal DAPI. Em seguida, escolha a imagem fixa.
    NOTA: Escolha um canal/marcador que permaneça constante ao longo das rodadas e seja resistente a produtos químicos ou fotobranqueamento (por exemplo, corantes nucleares como DAPI). Em seguida, escolha a imagem fixa.
13. Clique em Configurações avançadas de registro, marque todas as caixas, exceto Máscara automática, e defina a suavização gaussiana sigma como 5.0.
14. Clique em Concluído e, em seguida, em Registrar para executar o alinhamento. Quando o registro estiver concluído, clique em Reamostrar e Salvar Imagem Combinada.
15. Após a reamostragem, selecione o canal fiducial e clique em Calcular correlação. Os arquivos de saída incluem uma imagem output.ims alinhada, dois PDFs mostrando a qualidade do alinhamento antes e depois do registro, um arquivo JSON contendo as configurações usadas para o registro e um arquivo TXT com o log de todo o processo.

12. Alinhamento da imagem

1. Segmentar células/objetos usando CellPose (v2.5)²⁵
2. Para cada conjunto de dados de coloração única, gere uma máscara de segmentação a partir do próprio canal de detecção do marcador (Exemplo: para a coloração única de CD20, gere a máscara a partir do canal de detecção AF488 (o canal pretendido para CD20)).
3. Aplique a máscara de segmentação da etapa 2 a todos os canais no mesmo conjunto de dados (no exemplo CD20, a máscara derivada de AF488 é aplicada a AF488 para medir o sinal verdadeiro e a todos os outros canais de detecção para medir o sangramento).
4. Extraia intensidades e áreas por objeto em Python usando scikit-image (regionprops_table) e NumPy.
5. Relação sinal-fundo (SBR)
   1. Calcule a intensidade média do objeto em todas as ROIs segmentadas no canal de detecção pretendido do marcador.
   2. Defina a intensidade do plano de fundo como a intensidade média de todos os pixels fora das ROIs no mesmo campo de visão, excluindo preenchimento de valor zero ou pixels fora dos limites.
      Calcule SBR como:
      
   3. Visualize distribuições SBR com gráficos de violino, mostrando valores por objeto como pontos (ou valores por campo, quando indicado).
6. Quantificação de sangramento
   1. Para cada canal não pretendido, calcule o sangramento (%) usando as mesmas ROIs da máscara na etapa 12.2:
      
   2. NOTA: as entradas diagonais são iguais a 100%, pois no canal pretendido de uma imagem de mancha única, o numerador e o denominador são idênticos (sinal de marcador verdadeiro medido em seu próprio canal).

Resultados

Dois desafios fundamentais enfrentados pelas técnicas de imagem de imunofluorescência são a ligação não específica de sondas de anticorpos conjugados com fluoróforo e a autofluorescência tecidual. Este protocolo foi projetado para ajudar a distinguir um sinal verdadeiro do fundo para otimizar as técnicas de imunofluorescência multiplexada.

O bloqueio da heparina reduz a ligação não espec...

Discussão

O Spectral IBEX, uma adaptação do protocolo IBEX, aborda com sucesso duas questões-chave na imagem de imunofluorescência: ligação não específica e autofluorescência. O tratamento de tecidos altamente eosinofílicos com heparina e o uso de separação espectral para eliminar a autofluorescência e a sobreposição espectral entre os canais aumentaram significativamente a detecção do sinal verdadeiro acima do fundo. Capturar todos os marcadores em uma única passagem reduz o tempo de aquisição, o...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de ácido sulfúrico 2N (H2SO4)	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
Béquer de 500 mL	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
Placa de 6 poços	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
BCL-6 - Alexa Fluor 647	BD em Biociências	561525	Fator de diluição 1:100
Kit de Fixação/Permeabilização de Citofix/Citoperm BD	BD em Biociências	554722
Microscópio de dissecação de bancada	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
Albumina Sérica Bovina (BSA)	SIGMA-ALDRICH	A4503
CD11c - Alexa Fluor 700	BD em Biociências	561352	Fator de diluição 1:100
CD138/Syndecan-1 - PE	BioLegend	356503	Fator de diluição 1:200
CD20 - Alexa Fluor 488	Invitrogen	53020282	Fator de diluição 1:100
CD21 - Alexa Fluor 532	NovusBio	NBP2-60733AF532	Fator de diluição 1:100
CD23 - PE	BioLegend	338507	Fator de diluição 1:200
CD3 - iFluor 594	AAT Bioquest	100320C0	Fator de diluição 1:100
CD31 - Alexa Fluor 700	BioLegend	303134	Fator de diluição 1:100
CD34 - iFluor 594	AAT Bioquest	103400C0	Fator de diluição 1:100
CD38 - Alexa Fluor 700	BioLegend	303523	Fator de diluição 1:100
CD4 - Alexa Fluor 647	BioLegend	300520	Fator de diluição 1:100
CD45 - Alexa Fluor 532	ThermoFisher Scientific	58045942	Fator de diluição 1:100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647	BioLegend	353113	Fator de diluição 1:100
Adesivo de Alúmen e Gelatina de Cromo	Oferta de Novos Chegados	1033A
Cryomold	Fisher Scientific & nbsp;	NC9511236	Além disso, o Catálogo nº 50-465-347 para amostras maiores
Slide de calibração DAPI	Agar Scientific	AG2273
Solução DAPI, 1 mg/mL	ThermoFisher Scientific	62248	Fator de diluição 1:3000
E-cadherina/CD324 - Alexa Fluor 647	BioLegend	147307	Fator de diluição 1:100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594	BioLegend	324228	Fator de diluição 1:100
Tubos Eppendorf/Falcon	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Pinças	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
FoxP3 - eFluor 660	ThermoFisher Scientific	50577382	Fator de diluição 1:100
Portas de microscópio de extremidade fosca	ChemScience	GEW45-2575-W
GL7 - Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	53590282	Fator de diluição 1:100
Heparina sal sódico	SIGMA-ALDRICH	H3393	10KU
HLA-DR - PE	NovusBio	NB100-77855PE	Fator de diluição 1:200
Human TruStain FcX (Solução para Bloqueio de Receptores Fc)	BioLegend	422302	Fator de diluição 1:100
Câmara de umidade	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
Balde de gelo com tampa	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
IgD - Alexa Fluor 488	BioLegend	348215	Fator de diluição 1:100
IL4Ra/CD124 - PE	BioLegend	144803	Fator de diluição 1:200
Conversor de Arquivos Imaris	Instrumentos OXFORD	N/A	Cobrir qualquer formato de arquivo de imagem para o formato .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)
Isopentano (2-Metilbutano)	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
Ki-67 - Alexa Fluor 488	BD em Biociências	558616	Fator de diluição 1:100
Kimberly-Clark Kimberly-Clark Kimtech Science Kimwipes Limpadores Delicados de Tarefa, 1-Camada	Ciência Kimtech	06-666
Pinças grandes (ou seja, 25 cm de comprimento)	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
Nitrogênio líquido	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
Borohidreto de lítio (LiBH4)	SIGMA-ALDRICH	222356
MECA-79 - Alexa Fluor 488	Invitrogen	53603680	Fator de diluição 1:100
Tampa de lâmina de microscópio Vidro nº 1 22x50 mm	Fisher Scientific & nbsp;	12-542A
Água Milli-Q	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
MUC2 - Alexa Fluor 488	NovusBio	NB120-11197AF488	Fator de diluição 1:100
Cobertura Coberta Camerada Nunc Lab-Tek	ThermoFisher Scientific	155380
Caneta PAP	Abcam	AB2601
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
Bisturi	N/A	N/A	O que estiver disponível/usado no laboratório
Extensões SimpleITK Imaris	N/A	N/A	Software usado para alinhar imagens de diferentes rodadas (https://github.com/niaid/imaris_extensions)
Sacarose	SIGMA-ALDRICH	S0389
Composto Tecido-Tecido O.C.T.	Sakura Finetek USA	4583
Triton X-100	SIGMA-ALDRICH	X100
Zeiss LSM 980	Microscopia ZEISS	N/A	O sistema de imagem utilizado neste estudo
Zen Blue	Microscopia ZEISS	N/A	O software usado para processamento de imagens pós-aquisição