Induzindo hipertermia leve direcionada em modelos de tumores murinos por meio da conversão fototérmica de luz infravermelha próxima por nanobastões de ouro intratumorais

Resumo

Este protocolo apresenta técnicas e metodologia necessárias para terapia hipertérmica direcionada em modelos de tumores sólidos. A abordagem aproveita a conversão fototérmica da luz infravermelha próxima por nanobastões de ouro injetados intratumoralmente para induzir o aquecimento localizado dentro do microambiente tumoral.

Resumo

A hipertermia leve (42-48 °C) é uma modalidade terapêutica bem estabelecida que pode induzir a morte controlada de células tumorais e estimular respostas imunes anticancerígenas. No entanto, fornecer calor com precisão ao tecido tumoral, poupando o tecido saudável circundante, continua sendo um desafio significativo. Os métodos tradicionais de hipertermia, como a perfusão isolada de membros, requerem procedimentos complexos e invasivos e apresentam risco substancial de toxicidade local e morbidade do paciente. Em contraste, a terapia fototérmica usando nanopartículas de ouro ativadas por luz infravermelha próxima (NIR) surgiu como uma estratégia promissora e menos invasiva para alcançar a hipertermia localizada. Os nanobastões de ouro (GNRs), em particular, exibem propriedades ópticas sintonizáveis e alta eficiência de conversão fototérmica, tornando-os candidatos ideais para a modulação térmica precisa de locais tumorais. Embora essa técnica tenha se mostrado bastante promissora, especialmente para tumores superficiais e acessíveis, a entrega reprodutível, o confinamento espacial e a segurança continuam sendo áreas ativas de refinamento. Neste protocolo, apresentamos nosso método validado e otimizado para alcançar hipertermia localizada e leve usando injeção intratumoral de GNRs biocompatíveis seguida de exposição a laser NIR direcionada de curta duração. Essa abordagem permite um aquecimento rápido e controlável dentro da faixa terapêutica, promovendo a morte de células tumorais imunogênicas e estimulando respostas imunes inatas, mecanismos particularmente relevantes para tumores imunologicamente "frios". O monitoramento de temperatura em tempo real e a entrega local garantem reprodutibilidade, segurança e exposição sistêmica mínima. Este protocolo simplificado oferece uma plataforma robusta e acessível para estudos pré-clínicos, apoiando esforços mais amplos para aproveitar a hipertermia leve na imunoterapia contra o câncer.

Introdução

Desafios significativos permanecem no tratamento do câncer, incluindo resistência a medicamentos, evasão imunológica e toxicidade fora do alvo, que prejudicam o sucesso a longo prazo das terapias convencionais. Essas limitações impulsionaram o desenvolvimento de estratégias terapêuticas complementares destinadas a superar os mecanismos de resistência, minimizando os danos colaterais ao tecido saudável. A hipertermia leve, definida como a elevação da temperatura do tecido para 42-48 °C, tem sido reconhecida há muito tempo como um complemento eficaz às terapias padrão contra o câncer¹. Historicamente, a hipertermia leve tem sido usada em combinação com cirurgia, quimioterapia ou radioterapia para aumentar a eficácia dessas terapias, aumentando a perfusão tumoral, interrompendo a arquitetura estromal e sensibilizando células malignas a agentes citotóxicos¹. Mais recentemente, com o crescente sucesso da imunoterapia em oncologia, há um interesse crescente em alavancar o potencial imunomodulador inerente da hipertermia leve para melhorar as respostas imunes antitumorais ^1,2,3.

Apesar de seus benefícios clínicos demonstrados, a aplicação mais ampla da hipertermia tumoral permanece limitada devido aos desafios em alcançar o aquecimento localizado, controlável e reprodutível dos tumores, evitando danos ao tecido fora do alvo⁴. As técnicas atuais de hipertermia clínica e experimental, como perfusão regional de membros ou abordagens baseadas em nanopartículas administradas sistemicamente, geralmente sofrem de precisão espacial limitada, captação tumoral variável e potencial de toxicidade sistêmica 2,5,6,7,8,9 . A terapia hipertérmica direcionada é uma modalidade emergente neste campo do tratamento do câncer, projetada para elevar seletivamente as temperaturas do tumor, minimizando os danos ao tecido saudável circundante. Mais especificamente, a entrega direcionada de nanobastões de ouro (GNRs) é um método promissor para superar as limitações atuais de precisão e toxicidade da hipertermia tumoral leve. Os GNRs são particularmente adequados para aplicações fototérmicas devido à sua ressonância plasmônica de superfície sintonizável na região NIR, alta eficiência de conversão fototérmica e perfis de biodistribuição favoráveis em comparação com outras nanoestruturas de ouro^10,11. Sua capacidade de resposta aos comprimentos de onda NIR permite absorção eficiente de luz e aquecimento localizado, mesmo em tecidos mais profundos, com danos mínimos às estruturas circundantes. Como tal, os GNRs podem fornecer maior eficácia, direcionamento e segurança em terapias hipertérmicas.

O objetivo deste método é fornecer um protocolo altamente eficiente, de baixo consumo de recursos e reprodutível para alcançar hipertermia leve mediada por nanobastões de ouro em tumores sólidos. Esta técnica, denominada terapia hipertérmica direcionada mediada por GNR (THT), aborda as principais limitações das abordagens convencionais de hipertermia, combinando injeção direta de GNR intratumoral com ativação de luz NIR externa. Isso garante alta concentração local de nanopartículas, melhorando a reprodutibilidade e a segurança, principalmente para tumores pequenos ou pouco vascularizados que podem não acumular agentes administrados sistemicamente de forma eficiente. Além disso, o emprego de injeção intratumoral direta de GNRs seguida de exposição à luz infravermelha próxima (NIR) garante um aquecimento preciso, controlado e localizado dos tumores, minimizando a exposição sistêmica, a toxicidade e os efeitos fora do alvo associados às técnicas convencionais de hipertermia regional.

Muitos cânceres retratam mecanismos complexos e diversos de escape imunológico, permitindo-lhes resistir à imunoterapia por vários meios, mais evidentemente, por meio de infiltração deficiente de células imunológicas no microambiente tumoral ^2,4,5. A hipertermia leve oferece uma solução sinérgica quando usada em combinação com imunoterapias. Além dos efeitos citotóxicos diretos, a hipertermia leve induz preferencialmente a morte celular imunogênica (CDI), levando à liberação de antígenos associados ao tumor (TAAs) e padrões moleculares associados a danos (DAMPs)^1,2. Esses sinais ativam as vias imunes inatas, aumentam a apresentação do antígeno tumoral, promovem a maturação das células dendríticas e aumentam o priming das células T, aumentando a infiltração das células imunes no microambiente tumoral ^1,6,12. Em nossos próprios modelos pré-clínicos, essa técnica de THT mediada por GNR funcionou para ativar as respostas imunes locais e aumentar a infiltração imune do tumor¹³. Quando combinada com terapia intratumoral de interleucina-2 (IL-2) ou inibição sistêmica do checkpoint anti-PD1, essa técnica de THT mediada por GNR aumentou ainda mais a imunidade antitumoral e superou a monoterapia isolada em modelos de câncer de mama e melanoma¹³. Esses resultados são consistentes com um crescente corpo de evidências que apóia a sinergia entre hipertermia mediada por nanopartículas e imunoterapia em tumores sólidos, incluindo câncer de mama 14,15,16 e tumores cerebrais^17,18. Em suma, ao converter tumores imunologicamente "frios" em "quentes", o THT mediado por GNR pode melhorar a capacidade de resposta às imunoterapias, incluindo inibidores de checkpoint ^1,2,12.

O protocolo THT mediado por GNR apresentado aqui é intensivo em poucos recursos, tecnicamente simples e amplamente adaptável a tumores subcutâneos ou superficiais. Essa técnica é particularmente apropriada para pesquisadores que trabalham com modelos murinos de tumores subcutâneos ou superficiais, incluindo melanoma e câncer de mama. No entanto, com pequenas modificações, pode ser estendido a outros tipos de tumores e sítios anatômicos. Além disso, essa técnica oferece uma plataforma versátil para integrar a hipertermia espacialmente controlada em estudos pré-clínicos de câncer, particularmente aqueles que investigam estratégias de aprimoramento da imunoterapia e procuram explorar a hipertermia leve para melhorar a resposta ao tratamento ou superar a resistência aos tratamentos de imunoterapia. Além disso, o conhecimento e o equipamento necessários para a implementação dessa técnica são acessíveis e adaptáveis a uma variedade de ambientes de saúde, aumentando sua viabilidade em uso clínico mais amplo³.

Neste manuscrito, fornecemos instruções detalhadas passo a passo para implementar nosso protocolo THT mediado por GNR em modelos de camundongos usando um sistema de laser NIR operando a 860 nm. O sucesso deste protocolo depende da ativação eficiente de tecidos profundos de nanobastões de ouro usando o comprimento de onda apropriado da luz infravermelha próxima. Também destacamos considerações processuais para obter dosagem hipertérmica leve consistente, segura e eficaz em modelos de tumores murinos, como monitoramento preciso em tempo real da temperatura interna do tumor durante todo o procedimento. Este método baseia-se e reúne aspectos de abordagens de hipertermia de nanopartículas relatadas anteriormente, oferecendo uma alternativa abrangente, validada, altamente precisa e reprodutível para a pesquisa pré-clínica do câncer. No geral, este protocolo oferece um método biologicamente seguro, econômico e de baixa toxicidade para fornecer hipertermia localizada no tumor, com forte potencial para aumentar a eficácia das imunoterapias contra o câncer existentes e ampliar a utilidade clínica da hipertermia em oncologia.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Universitário de Animais de Laboratório da Universidade de Dalhousie, de acordo com as diretrizes dos padrões éticos do Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Todas as diretrizes internacionais, nacionais e institucionais aplicáveis para o cuidado e uso de animais foram seguidas. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais usados neste protocolo.

1. Requisitos de laser e instalações de tratamento

1. Acesso seguro a um sistema de laser totalmente calibrado capaz de fornecer luz em um comprimento de onda de 860 ± 10 nm com uma intensidade de até 4.000 mA. Certifique-se de que o sistema a laser tenha mecanismos de desligamento adequados.
   NOTA: Neste estudo, utilizamos um laser personalizado. O modelo usado neste protocolo possui uma chave de habilitação a laser, um botão de parada de emergência e um jumper de intertravamento (o jumper conectado também pode ser conectado a uma chave de segurança que é usada para conformidade de segurança, por exemplo, acesso à porta para uma sala de laser Classe 4).
2. Conecte uma sonda de temperatura calibrada e implantável para monitoramento de temperatura intratumoral capaz de transmitir dados de temperatura ao vivo por meio do software de gravação de termopar apropriado.
3. Prepare uma sala de laser designada que atenda aos padrões de segurança exigidos para a classe de laser. Certifique-se de que haja uma área de trabalho desobstruída, com boa ventilação, iluminação adequada e todas as superfícies reflexivas cobertas. Restrinja o acesso à sala durante a operação do laser para evitar exposição não intencional. Certifique-se de que todo o pessoal envolvido no estudo seja totalmente treinado em operação a laser e protocolos de segurança e use EPI e proteção ocular adequados.
4. Estabeleça um espaço de trabalho dentro da sala de laser que acomode uma máquina anestésica próxima à configuração do laser. Certifique-se de que o laser esteja montado com segurança, mas ajustável, com o sujeito experimental podendo ser posicionado a aproximadamente 1-2 cm da fonte do feixe de laser para garantir o direcionamento preciso do local do tumor.
5. Use uma câmera termográfica em um tripé, posicionada para capturar leituras de temperatura da superfície do assunto, durante a exposição a laser.

2. Cultura celular e inoculação (injeção de células tumorais)

1. Selecione modelos de camundongos apropriados com base no tipo de tumor de interesse, seguindo técnicas padronizadas de preparação e manutenção de cultura de células de laboratório. Para seguir este protocolo, selecione camundongos BALB/c fêmeas de 6 a 8 semanas de idade para inoculação do tumor CT26.
   NOTA: Camundongos imunocompetentes ou imunocomprometidos de diferentes idades e cepas podem ser usados, dependendo dos requisitos do estudo.
2. Cultive a linhagem celular de câncer CT26 em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor (FBS), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 2 mM de glutamina. Mantenha as células a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO₂. Renove o meio a cada 2-3 dias e subcultive células a 70-80% de confluência usando uma proporção de divisão de 1:4 a 1:10. Use células dentro das primeiras passagens (por exemplo, ≤10 passagens) para garantir um crescimento consistente e eficiência de inoculação. Expanda as culturas conforme necessário para obter o número necessário de células para inoculação.
   NOTA: O número de células necessárias por camundongo varia de acordo com o modelo, por exemplo, para o modelo de câncer colorretal murino CT26, precisamos de 5 × 10⁵ células por camundongo.
3. Separar as células aderentes usando tripsinização e lavar 2x com 1x PBS estéril. Ressuspenda em uma solução estéril 1x PBS para atingir a concentração desejada de 5 × 10⁶ células/mL. Conservar a suspensão celular num tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml em gelo durante um máximo de 1 h antes da injeção.
4. Antes da injeção, anestesiar camundongos usando uma câmara de indução com isoflurano vaporizado a 4% a uma taxa de fluxo de 0,8 L / min. Uma vez anestesiado, reduza o isoflurano para 2% e mantenha a anestesia com um cone nasal durante o procedimento de inoculação. Confirme a profundidade da anestesia usando um teste de pinça do dedo do pé para garantir a ausência de resposta à dor. Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento e minimizar possíveis danos ao laser.
5. Raspe o local da injeção (por exemplo, o flanco esquerdo para este modelo heterotópico CT26) usando um barbeador elétrico e limpe a área com um lenço umedecido com álcool para remover detritos e desinfetar a pele. Aperte a pele no local da injeção e injete 100 μL da suspensão celular a 5 ×^{10 6} células / mL por via subcutânea usando uma agulha de 26 G e uma seringa de 1 mL. Após a injeção, remova o camundongo do cone do nariz e devolva-o à gaiola para recuperação em um cobertor de aquecimento por 1 h.

3. Crescimento e medição do tumor

1. Comece as medições diárias do tumor, geralmente começando no dia 7 após a injeção, usando um paquímetro de medição do tumor. Meça as dimensões do tumor em três eixos: largura, comprimento e altura e calcule os volumes do tumor usando uma fórmula de volume tumoral elipsóide de π/6 × comprimento × largura × altura.
2. Planeje iniciar o THT mediado por GNR assim que os tumores atingirem um volume aproximado de 50 mm³ (± 20 mm³).
   NOTA: Para o nosso modelo CT26, esse volume tumoral foi alcançado entre os dias 10 e 12 após a injeção de células tumorais).
3. Antes do tratamento a laser, garantir a atribuição aleatória de camundongos em grupos de controle e tratamento. O grupo de tratamento receberá uma injeção intratumoral de GNR seguida de exposição ao laser; e o grupo controle receberá uma injeção intratumoral de PBS (mesmo volume da injeção de GNR) em vez de GNRs, seguida de exposição ao laser.

4. Conversão fototérmica da luz NIR usando GNRs intratumorais

1. Em uma cabine de segurança biológica estéril, use uma seringa de 0,3-1 mL com uma agulha de 31 G para extrair o volume apropriado de GNRs com base em cada volume de tumor.
2. Anestesiar o camundongo da mesma maneira que para injeção de células cancerígenas (com um cone nasal fornecendo isoflurano a 2% a uma taxa de fluxo de 0,8 L / min e confirmar a profundidade adequada da anestesia usando o teste de pinça do dedo do pé).
3. Uma vez anestesiado, reduza o isoflurano para 2% e coloque o camundongo em decúbito ventral na plataforma do laser, mantendo a anestesia usando um cone nasal. Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento e minimizar possíveis danos ao laser.
4. Raspe o excesso de pelos ao redor do tumor, se necessário, para garantir a exposição da superfície da pele ao laser. Use etanol para desinfetar a superfície do tumor, limpando qualquer pelo/detritos.
   NOTA: Neste estudo, usamos GNRs otimizados para absorção a 860 nm. Se estiver usando um produto GNR diferente do sugerido aqui, certifique-se de que a entrega do comprimento de onda NIR do laser seja otimizada de acordo com o espectro de absorção da GNR.
5. Antes da exposição ao laser, injete GNRs intratumoralmente a uma concentração de 1 μg / mm³ de volume tumoral. Se necessário, divida a injeção entre dois locais intratumorais para garantir a distribuição eficiente de GNRs dentro do tumor.
   NOTA: Neste vídeo de protocolo, foram usados GNRs na concentração de 2 μg/μL; portanto, para um tumor de 50 mm³ , 25 μL de GNRs foram injetados no tumor. Certifique-se de limpar qualquer excesso de GNRs na superfície da pele após as respectivas injeções.
6. Para camundongos do grupo controle, administrar uma injeção intratumoral de PBS estéril do volume equivalente usado para o(s) grupo(s) de injeção GNR (por exemplo,., injetar 25 μL de PBS no caso de um tumor de 50 mm³).
7. Desinfete a sonda de temperatura intratumoral com etanol e insira-a suavemente no meio da massa tumoral.
8. Aplique uma camada uniforme de gel de aloe vera com aproximadamente 5 mm de espessura sobre a superfície do tumor para evitar ulceração da pele e minimizar o risco de lesão térmica durante o tratamento.
9. Certifique-se de que o laser esteja ajustado para se alinhar diretamente acima do meio do tumor. Use a tabela de pesquisa de irradiância (Tabela 1) para determinar a altura apropriada do laser com base no diâmetro do feixe de laser necessário para cobrir a área de superfície do tumor. Otimize a altura do laser com base no diâmetro do tumor para garantir um fornecimento consistente de energia.
   NOTA: Em nosso experimento, um tumor com 1,3 cm de diâmetro exigiu uma altura de laser de 1,5 cm).
10. Ligue a fonte de resfriamento elétrico a laser e térmica (TEC) e, em seguida, conecte o sistema a laser à fonte de alimentação (adaptado de acordo com o protocolo do fabricante). Ligue a fonte de resfriamento elétrico térmico; aguarde até que o LED azul acenda e a temperatura da fonte TEC do laser estabilize em 25 °C após 30 s.
11. Use a tabela de pesquisa de irradiância (Tabela 1) para obter uma irradiância alvo de 1 W/^cm2 ± 0.2 W/^cm2 ajustando a saída de corrente do laser (gire o botão da fonte de laser para o ponto de ajuste de corrente desejado).
    NOTA: Em nosso experimento, uma altura de laser de 1,5 cm, um diâmetro de feixe de 1,3 cm e a corrente de laser de 1.800 mA resultaram em um valor de irradiância de 0,82 W/^cm2, que foi otimizado para este modelo de tumor.
    A partir deste ponto, certifique-se de que todos os indivíduos na sala de operação do laser usem óculos de segurança a laser certificados para o comprimento de onda da luz usada.
12. Configure a câmera térmica adjacente à plataforma do laser, direcionada ao mouse, para monitorar a temperatura da superfície da pele durante o procedimento a laser.
13. No software de gravação de termopar, crie um novo file e clique no botão de gravação . Certifique-se de que o gráfico de temperatura versus tempo do tumor interno esteja sendo exibido em tempo real.
14. Gire a chave de segurança para ativar a saída da fonte de laser. Comece a administração do laser pressionando o pedal.
    NOTA: Neste protocolo, um controlador Raspberry Pi é a interface interna entre o pedal e a fonte de laser.
15. Verifique e certifique-se de que o software de computador detecte um aumento na temperatura do tumor assim que o tumor injetado na GNR for exposto ao feixe de laser.
    NOTA: A temperatura interna do tumor começará a aumentar no momento do início do laser, levando aproximadamente 15 s a 2 min para entrar na faixa de hipertermia alvo de 42 °C, dependendo do tamanho e tipo de modelo do tumor.
16. Mantenha a temperatura interna do tumor na faixa hipertérmica (entre 42 °C e 48 °C) por 5 minutos completos. Monitore continuamente a temperatura interna do tumor e, se ela se aproximar de 48 °C, tire o pé do pedal e deixe a temperatura cair novamente. Procure essa queda na temperatura em tempo real no gráfico de exibição de temperatura versus tempo. Quando a temperatura interna do tumor cair para ~43 °C, reative a administração do laser pressionando o pedal novamente. Continue este padrão de pedal de laser liga/desliga para manter a temperatura interna do tumor na faixa hipertérmica apropriada por 5 minutos completos e monitore o gráfico de exibição de temperatura versus tempo.
    1. Se a temperatura do tumor cair abaixo de 42 °C em qualquer momento durante o período de hipertermia de 5 minutos, aumente o tempo de hipertermia para compensar o tempo perdido. Por exemplo, se a temperatura cair abaixo de 42 °C por 20 s, adicione 20 s ao final do tempo inicial de 5 minutos. Alguns tumores injetados com GNRs podem não atingir 48 °C, e o ciclo liga/desliga do laser não será necessário.
       NOTA: Em camundongos de controle injetados intratumoralmente com PBS, os tumores não atingirão a faixa hipertérmica. Se desejado, o ciclo liga/desliga do laser para camundongos controle deve seguir o mesmo padrão estabelecido para o grupo tratado com GNR, apesar da esperada falta de resposta hipertérmica.
17. Durante a manutenção da hipertermia tumoral, monitore continuamente a temperatura da superfície da pele para garantir que ela permaneça abaixo de 50 °C. Independentemente da temperatura interna do tumor, se a temperatura da superfície da pele atingir 50 °C, desligue o laser para permitir o resfriamento. Se a temperatura interna não puder atingir a faixa hipertérmica desejada sem fazer com que a temperatura da pele exceda 50 °C, reduza a potência do laser e/ou aplique aloe vera adicional no local do tumor para ajudar a dissipar o calor. Após 5 min na faixa hipertérmica, solte o pedal para interromper a administração do laser e permitir que a temperatura interna do tumor caia para ~37 °C e desligue a chave de segurança do laser.
    NOTA: É importante minimizar os danos à pele que podem levar à ulceração do tumor, mantendo a temperatura da pele abaixo de 50 °C¹⁹.
18. Monitore a sonda de temperatura interna do tumor, permitindo que a temperatura do tumor caia para aproximadamente 37 °C. Remova suavemente a sonda de temperatura do tumor e limpe o gel de aloe vera restante na superfície do tumor.
19. Remova o camundongo do anestésico do cone nasal e monitore a excitação do animal antes de devolvê-lo à gaiola. Coloque a gaiola parcialmente em uma almofada térmica a 37 °C durante o período de recuperação após o procedimento, permitindo que os camundongos se movam entre áreas mais quentes e mais frias, conforme necessário, para regular a temperatura corporal. Monitore cada mouse para garantir o retorno ao comportamento normal antes de devolvê-los às suas instalações de alojamento.

Resultados

O objetivo deste protocolo THT mediado por GNR é aquecer tumores sólidos de forma consistente e confiável até a faixa hipertérmica leve desejada de 42-48 °C. As principais etapas desse procedimento são descritas na Figura 1. O sucesso deste protocolo depende do estabelecimento e manutenção de hipertermia leve controlada e reprodutível dentro de um determinado modelo de tumor sólido. Os GNRs usados foram sintetizados usando um método patenteado livre de CTAB, no qual o sal de ouro foi reduzido em uma solução surfactante proprietária para promover o crescimento de cristais em forma de bastonete. Após a síntese, os surfactantes nativos foram amplamente substituídos por PEG de baixo peso molecular para aumentar a biocompatibilidade. Os GNRs resultantes eram uniformes em tamanho (51,1 ± 10,8 nm por 12,2 ± 1,9 nm), tinham um comprimento de onda de excitação ideal de 860 ± 10 nm e estavam livres de endotoxinas detectáveis.

Para garantir o aquecimento adequado do tumor e o rastreamento preciso da temperatura, uma sonda de temperatura intratumoral deve ser inserida no centro do tumor. Além disso, monitorar a temperatura da superfície da pele durante todo o procedimento usando um termovisor é crucial. É possível, especialmente para tumores de menor volume, que os GNRs injetados intratumoralmente possam se difundir para o espaço peritumoral e/ou subcutâneo ao redor do tumor. Após a exposição à luz NIR, isso pode causar aquecimento da pele acima dos níveis fisiológicos básicos, e se a pele atingir temperaturas acima de níveis hipertérmicos leves (superiores a 50 °C), isso pode levar a danos à pele, como crostas e/ou ulceração¹⁹. A aplicação de uma camada de gel de aloe vera na superfície do tumor é uma importante medida de precaução para ajudar a regular a temperatura da superfície da pele e evitar danos térmicos durante a exposição ao laser NIR. Em qualquer caso, recomenda-se monitorar a área tratada quanto a sinais de ulceração durante as 48 h após THT. A Figura 2 mostra uma representação visual da configuração sugerida para otimizar o gerenciamento da temperatura do tumor, mostrando a localização da sonda de temperatura interna do tumor e da camada de gel de aloe vera em relação à sonda de laser NIR.

O sucesso relativo deste protocolo experimental pode ser determinado a partir da observação do gráfico de temperatura versus tempo do tumor interno durante a operação do laser. Para camundongos injetados intratumoralmente com GNRs, espera-se que os tumores aqueçam na faixa hipertérmica leve (42-48 ° C) dentro de 15 s a 2 min. Uma vez que a temperatura interna do tumor tenha entrado na faixa hipertérmica leve, espera-se que ele se estabilize dentro da faixa apropriada ou exija um ciclo liga/desliga da administração do laser para garantir que a temperatura interna do tumor não suba acima de 48 °C (como mostrado na Figura 3A). A manutenção bem-sucedida da hipertermia leve por 5 min é considerada um resultado positivo. Para camundongos injetados intratumoralmente com PBS, não se espera que os tumores aqueçam na faixa hipertérmica. A exposição à luz NIR em um comprimento de onda de 860 nm não é suficiente por si só para causar aquecimento do tecido na faixa hipertérmica leve, e espera-se que os tumores de controle se estabilizem em torno de 39-40 ° C. A Figura 3B mostra um gráfico de temperatura do tumor interno versus tempo entre GNR e camundongos controle (injetados com PBS) durante o procedimento de 5 minutos. Se um tumor injetado em GNR não conseguir atingir a faixa hipertérmica após a exposição à luz NIR ou não puder ser mantido na faixa hipertérmica apropriada por 5 minutos completos, isso é considerado um resultado negativo.

A análise adicional a jusante para determinar o sucesso deste protocolo THT mediado por GNR envolve a medição de alterações no volume do tumor após o procedimento. O THT mediado por GNR realizado com sucesso causa morte de células tumorais direcionadas e ativação de respostas imunes anticancerígenas, o que leva à regressão do tumor e redução do volume tumoral associado¹³. A Figura 4 mostra as alterações no volume do tumor após THT mediado por GNR para dois modelos de câncer murino de flanco subcutâneo (modelo de câncer colorretal heterotópico B16 e CT26) e um modelo de câncer murino de almofada de gordura mamária (câncer de mama 4T1). Em cada modelo, uma redução significativa no volume do tumor em comparação com os controles é evidente 48-72 h após o procedimento de THT mediado por GNR. Espera-se que a linha do tempo e a magnitude da redução do volume do tumor após o procedimento variem dependendo da cepa do camundongo e do modelo de câncer. Além da redução do tumor, observamos uma potente resposta imune inata dentro de 48 h de THT mediada por GNR, caracterizada pelo aumento da expressão de genes envolvidos na via STING-cGAS e pela regulação positiva e ativação de células dendríticas, macrófagos e células NK nos modelos B16F10 e 4T1¹³. Notavelmente, em um modelo de tumor 4T1 bilateral, o THT habilitado para GNR induziu uma resposta imune sistêmica, como evidenciado pelo aumento da infiltração de células T CD8⁺ em tumores contralaterais não tratados¹³. Essas descobertas apóiam ainda mais o potencial dessa abordagem para provocar efeitos anticancerígenos citotóxicos diretos e imunomoduladores mais amplos.

Tabela 1: Tabela de pesquisa de irradiância. Tabela com valores de irradiância (W/cm²) para diferentes configurações de saída de corrente do laser (mA) e distâncias de trabalho (cm). A tabela é usada para determinar a altura apropriada do laser com base no diâmetro do feixe necessário para cobrir a superfície do tumor e atingir uma irradiância alvo de 1 W/cm² ± 0,2 W/cm². Os valores destacados em verde indicam níveis ideais de irradiância próximos a 1 W/cm². Esta tabela de irradiância é específica para o Laser LDX e foi fornecida pelo fabricante. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura 1: Esquema gráfico do procedimento THT mediado por GNR. Metodologia de terapia hipertérmica direcionada mediada por nanobastões de ouro para tumores de flanco subcutâneo em modelo murino. Após o estabelecimento de um tumor palpável (aproximadamente 50 mm³) e anestesia com camundongos, (1) injete GNRs intratumoralmente a uma concentração de 1 μg / mm³, (2) insira a sonda de temperatura intratumoral no meio da massa tumoral, (3) aplique uma camada de ~ 5 mm de gel de aloe vera na superfície do tumor, (4) inicie a administração de laser NIR e (5) mantenha a temperatura interna do tumor na faixa hipertérmica leve (42 ° C-48 ° C) por 5 min. Abreviaturas: GNR = nanobastão de ouro; THT = terapia hipertérmica direcionada; NIR = infravermelho próximo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Representação visual da configuração experimental. Um camundongo BALB/c portador de um tumor colorretal heterotópico com uma sonda de temperatura intratumoral inserida centralmente e uma camada tópica de gel de aloe vera aplicada diretamente abaixo da exposição ao feixe de laser infravermelho próximo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Gráficos de temperatura interna em tempo real. Perfil(es) representativo(s) de temperatura interna do tumor ao longo do tempo (em ms) registrado pela sonda de temperatura interna durante a exposição do tumor ao laser NIR. (A) Padrão de ciclagem de laser NIR ligado / desligado em um camundongo injetado com GNR necessário para manter a temperatura interna do tumor em uma faixa hipertérmica leve (42 ° C-48 ° C) por 5 min. Isso destaca a importância do monitoramento rigoroso da temperatura interna do tumor e do ciclo de administração do laser para manter a faixa hipotérmica durante todo o procedimento. (B) Diferença média na temperatura interna do tumor entre camundongos injetados com GNR (n = 15) e controle (injetados com PBS) (n = 8) durante 5 min de exposição ao laser NIR. Os tumores de camundongos injetados com PBS não são aquecidos em uma faixa hipotérmica leve e se estabilizam em torno de 39-40 ° C, apesar de receberem o mesmo tempo de exposição ao laser NIR que o grupo injetado com GNR, cujos tumores atingem temperaturas hipertérmicas de 42-48 ° C. Abreviaturas: GNR = nanobastão de ouro; NIR = infravermelho próximo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Gráficos de volume tumoral após THT mediado por GNR. O THT mediado por GNR induz o encolhimento do volume do tumor em vários modelos de câncer murino dentro de 48-72 h após o tratamento. (A) Medições do volume tumoral no modelo 4T1 (câncer de mama) após THT mediado por GNR (n = 24 PBS, n = 28 THT). (B) Medições do volume tumoral no modelo B16-F10 (Melanoma) seguindo THT mediado por GNR (n = 19 PBS, n = 23 THT). (C) Medições do volume tumoral no modelo CT26 (câncer colorretal) após THT mediado por GNR (n = 9 PBS, n = 9 THT). Uma redução ou desaceleração do crescimento do volume tumoral dentro de 48-72 h após o tratamento é indicativa de um resultado positivo. Os dados de volume do tumor para o modelo CT26 no ponto de tempo '24 h pré' não são mesclados - os valores são semelhantes e se sobrepõem. As barras de erro representam SEM. * p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Etapas críticas dentro do protocolo
O projeto e a implementação desta técnica THT mediada por GNR fornecem a capacidade de conduzir aquecimento direcionado, preciso, de baixo consumo de recursos e reprodutível de tumores sólidos in vivo. Uma das principais vantagens deste sistema reside em sua precisão espacial e controle térmico, que permite o tratamento localizado sem danificar o tecido circundante. Uma etapa crítica para uma conversão fototérmica bem-sucedida é garantir a compatibilidade entre os GNRs usados e a fonte de luz NIR. Neste estudo, usamos GNRs otimizados para absorção a 860 nm. Nesse comprimento de onda, a luz penetra no tecido de forma eficaz e o calor é gerado seletivamente em tumores contendo GNR, enquanto o tecido saudável circundante permanece próximo à temperatura fisiológica²⁰. Além disso, ao realizar este protocolo, o monitoramento preciso em tempo real da temperatura interna do tumor é crucial para confirmar que uma faixa hipertérmica leve foi alcançada e que o tratamento está sendo administrado de forma consistente. A colocação de uma sonda de temperatura intratumoral, conforme mostrado na Figura 2, permite o monitoramento em tempo real da dose térmica do tumor, conforme visto na Figura 3B.

Solução de problemas da técnica
Dependendo do modelo in vivo e do tipo de tumor, pequenas modificações no protocolo podem ser necessárias para otimizar os resultados. Por exemplo, nos modelos de melanoma murino, câncer colorretal e câncer de mama referenciados na Figura 4, otimizamos a concentração de GNR para volume tumoral em 1 μg/mm³. Também otimizamos a eficiência deste protocolo conduzindo a exposição ao laser NIR diretamente após a injeção de GNR, pois não foram observadas diferenças na eficácia do tratamento ao comparar esta injeção e o tempo de tratamento com intervalos mais longos de 0,5, 1, 4, 18 ou 24 h. Para modelos de tumor que variam do(s) nosso(s) modelo(s) em termos de fisiopatologia do tumor ou localização corporal, uma concentração diferente de GNR, injetada em um ponto de tempo diferente, pode ser ideal para atingir e/ou permanecer dentro da faixa hipertérmica. Após este procedimento, medições diárias do volume do tumor devem ser realizadas para registrar alterações no volume do tumor. A regressão do tumor dentro de 2-3 dias é um indicador positivo do sucesso do tratamento.

Devido à natureza do protocolo a laser, queimaduras e ulcerações superficiais da pele são um fator de risco potencial, principalmente em peles pigmentadas ou sensíveis. Ajustes na saída de corrente do laser podem ser necessários para manter um equilíbrio adequado entre a superfície da pele e a temperatura interna do tumor, dependendo do modelo in vivo usado. Por exemplo, descobrimos que, devido às diferenças no teor de água e pigmento de melanina na pele²¹, os camundongos C57Bl / 6 requerem administração de laser NIR em uma corrente mais baixa em comparação com os camundongos BALB / c, para manter a temperatura da pele abaixo de 50 ° C. Ao modificar a saída de corrente do laser, certifique-se de que a altura do laser seja ajustada de acordo para manter uma irradiância alvo de 1 W/^cm2 ± 0.2 W/^cm2 enquanto ainda cobre a maior parte da superfície do tumor com o diâmetro do feixe de laser. Como alternativa, a aplicação de gel de aloe vera adicional pode ajudar a diminuir a temperatura da pele durante o procedimento sem afetar drasticamente a temperatura interna do tumor. Manter a temperatura adequada da superfície da pele por meio de modificações necessárias é importante para minimizar o risco de ulceração, que tem sido observada como um potencial efeito colateral desse tratamento. Ao fazer modificações na camada de gel de aloe vera, certifique-se de interromper momentaneamente a administração do feixe de laser NIR. Nos dias seguintes ao protocolo de laser, certifique-se de que os camundongos estejam sendo monitorados de perto quanto a possíveis queimaduras e/ou ulcerações.

Limitações do THT mediado pela GNR
Uma grande preocupação de segurança que deve ser abordada ao realizar este procedimento é o uso de óculos de segurança a laser certificados para o comprimento de onda da luz usada durante a operação do laser. O sistema a laser deve incluir recursos de segurança integrados, como um intertravamento com chave, para evitar ativação acidental. No entanto, equipamentos de proteção individual adicionais - óculos de segurança a laser particularmente apropriados - são necessários para proteger contra a exposição potencial de feixes refletidos ou dispersos. O olho é o mais vulnerável a lesões causadas por um feixe de laser, sendo as queimaduras na retina uma grande preocupação com os lasers NIR²². Por fim, todo o pessoal que opera o laser deve ter treinamento adequado.

Este protocolo optou pela injeção intratumoral de GNRs em vez de uma injeção sistêmica para minimizar a toxicidade do sistema, limitar a distribuição de nanopartículas em órgãos fora do alvo, como fígado, baço e rins, e aumentar a precisão, eficácia e perfil de segurança do tratamento hipertérmico. No entanto, como este protocolo requer injeções intratumorais de GNRs, ele pode ser limitado em sua capacidade de induzir hipertermia em certos modelos de tumor. Até agora, comprovamos a eficácia desse método em tumores de coxim adiposo subcutâneo e mamário, ambos próximos à superfície da pele e facilmente acessíveis em termos de injeção de GNR e exposição à luz NIR. Dificuldades logísticas podem surgir no direcionamento de tumores que residem dentro de cavidades corporais, como o peritônio, ou ao tentar atingir locais metastáticos de um tumor primário. Uma modificação potencial neste protocolo pode envolver a injeção sistêmica de GNR, desde que as nanopartículas sejam projetadas ou modificadas para garantir o acúmulo eficiente nos locais do tumor antes da exposição ao NIR²³. Além disso, é possível que a injeção intratumoral de GNR possa resultar em distribuição desigual de nanopartículas no tumor, afetando a uniformidade do aquecimento. No entanto, não se espera que o aquecimento não uniforme do tumor tenha um grande impacto no grau de eficácia do tratamento, uma vez que o resultado primário deste protocolo THT mediado por GNR é a indução do CDI para ativar a imunidade anticancerígena. Por fim, a leitura da temperatura intratumoral depende da localização da sonda de temperatura dentro do tumor. O meio do tumor é o local ideal para a sonda refletir com precisão a temperatura média geral do tumor. No entanto, se for difícil garantir e/ou confirmar a inserção de uma sonda central devido ao tamanho e/ou formato do tumor, pode ser necessário registrar usando duas ou mais sondas de temperatura em locais diferentes.

Importância em relação aos métodos existentes
Este manuscrito fornece um protocolo abrangente, otimizado e reprodutível para THT mediado por GNR em tumores sólidos e superficialmente acessíveis. Em comparação com outros métodos de indução de hipertermia, essa técnica oferece vantagens distintas, a saber, é pouco intensiva em recursos, espacialmente precisa e associada a toxicidade sistêmica mínima. Embora o uso de GNRs para terapia fototérmica esteja bem documentado, ainda há uma variabilidade significativa na literatura sobre como esses protocolos são implementados. Os principais elementos processuais, como duração da irradiação NIR, escolha de ferramentas de monitoramento térmico (sondas de termopar ou câmera térmica), preparação da solução GNR e métodos de injeção GNR, geralmente variam entre os estudos.

Por exemplo, outros métodos exigiram doses mais longas (20 min)²⁴ ou múltiplas (4 x 15 min)²⁵ de exposição ao NIR para obter resultados semelhantes aos nossos. Além disso, a maioria dos protocolos usa sondas termopares ou câmeras térmicas, mas raramente combina as duas ferramentas^26,27. Além disso, as soluções GNR são frequentemente preparadas com CTAB 28,29,30, e seu método de entrega varia entre injeções sistêmicas ^24,30 e injeções intratumorais³¹, o que pode afetar sua dispersão/localização dentro do TME. Como tal, um método abrangente e adaptável para THT mediado por GNR que otimize e melhore os protocolos atuais ainda não foi estabelecido.

Nosso protocolo aborda essas deficiências integrando os componentes mais eficazes e reprodutíveis da literatura em uma abordagem única e padronizada. Especificamente, usamos monitoramento térmico duplo (termopar e câmera térmica) para garantir o fornecimento de calor preciso e seguro; empregamos injeção intratumoral de GNRs livres de CTAB para maximizar a localização do tumor e minimizar a toxicidade; e incorporamos o uso de gel de aloe vera para proteger contra queimaduras superficiais da pele. Além disso, os GNRs usados neste protocolo são otimizados para conversão fototérmica eficiente em 860 nm NIR, permitindo a obtenção rápida de temperaturas hipertérmicas amenas em segundos. Uma vez atingida essa faixa de temperatura, ela pode ser mantida de forma estável durante os 5 minutos de tratamento, que determinamos ser suficiente para induzir a morte celular imunogênica e a ativação imunológica. O próprio comprimento de onda NIR de 860 nm também fornece um equilíbrio favorável entre a profundidade de penetração do tecido e a segurança, aumentando ainda mais a janela terapêutica desse método.

Em resumo, nosso protocolo oferece uma alternativa consolidada, validada e biologicamente eficaz às abordagens existentes de hipertermia mediada por GNR e preenche uma lacuna crítica no campo, fornecendo um método totalmente detalhado e adaptável adequado para pesquisa pré-clínica de câncer e desenvolvimento de terapia combinada.

Aplicações futuras da técnica
Por fim, embora este protocolo possa ser facilmente combinado com vários tratamentos contra o câncer, é particularmente adequado para aumentar a eficácia das imunoterapias, dada a capacidade inerente do THT de estimular a imunidade anticancerígena. Ao induzir a morte celular imunogênica, promover a liberação de antígenos específicos do tumor e aumentar o número de células imunes inatas recrutadas para o TME dentro de 48 horas após o tratamento, o THT mediado por GNR ajuda a "resensibilizar" tumores imunologicamente frios para detecção e ataque pelo sistema imunológico¹³. Como resultado, essa técnica pode ser usada para melhorar a eficácia das imunoterapias no tratamento de cânceres que podem ter desenvolvido resistência anteriormente, oferecendo uma estratégia potencial para superar as barreiras do tratamento do câncer e a progressão da doença¹³.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% de tripsina	Thermo Fisher Científico	25200-056
10 mL de Stripette	Fisher Científico	7200574
Tubo Falcon de 15 mL	Corning	352095
Seringa de 1 ml	BD Biociências	3331431
Agulha de 28 G	BD Biociências	1298811
Linha celular de câncer de mama 4T1	Coleção American Type Culture	CRL-2539
5 mL de Stripette	Fisher Científico	7200573
Tubo Falcon de 50 mL	Fisher Científico	14-432-22
70% de etanol	Álcoois Comerciais	36195
Gel de aloe vera	Marca de Vida	57800985495
Linhagem celular de melanoma B16-F10	Coleção American Type Culture	CRL-6475
Biorender	BioRender	N/A
Gabinete Bisafety	Nuaire	N/A
Óculos de segurança a laser classe 4	visão a laser	F22. Pág. 5P18.5000	Utilizamos um quadro P22 com um filtro P5P18
Incubadora CO2 (37 > C, 5% CO2)	Nuaire	N/A
Corning 1-200 µ L Tubo Racked Universal Fit  Dicas	Corning	4865
Pipeta Filtrada Corning  Pontas, 30 µ L	Fisher Científico	07-200-265
Linha celular colorretal murina CT26	Coleção American Type Culture	CRL-2638
DPBS	Thermo Fisher Científico	10010-049
Tubos Eppendorf	Thermo Fisher Científico	3451
Camundongos BALB/c fêmeas	Charles River Laboratories (Montreal, Canadá)	028
Fêmea C57Bl/6	Charles River Laboratories (Montreal, Canadá)	027
Soro fetal bovino	Invitrogen científico Thermo Fisher	12483020
GNR	Sona Nanotech Inc	N/A
Sonda de temperatura intratumoral	ÔMEGA	HYP1-30-1/2-T-G-60-SMP-M	Sonda de termopar modelo HYP-1
IsoTip 1000 µ L Pipeta Filtrada Universal Dicas	Corning	4809
Laser LDX (Modelo: LDX-3520-860-HHLFC)	Minnetronix	N/A	Corrente do laser com ponto de ajuste máximo em 4600 mA
Optixcare Lubrificante para os olhos	Aventix	N/A
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Científico	15140148
Prisma 10.6.0	Bloco de gráficos	N/A
RPMI 1640 Médio	Thermo Fisher Científico	11875119
Software de Registro de Dados de Termopar TC-08	Tecnologia Pico	PicoLog V5.25.3
Câmera térmica	HIKmicro	EA-1086922
Placa de cultura de tecidos 100 x 20 mm	Fisher Científico	877222
Solução Trypan Blue 0,4%	Thermo Fisher Científico	15250061
Paquímetro de medição de tumor	Giles scientificMitutoyo corporation	500-321