Artigo de método

Avanços no perfil metabólico de esferoides tridimensionais de tumores cerebrais para triagem de drogas

DOI:

10.3791/68833

⸱

5 de setembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Innovation and Research, Peking University Third Hospital, 2Cancer Center of Peking University Third Hospital, 3Biobank, Peking University Third Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, estabelecemos uma plataforma de perfil metabólico integrando esferóides de glioma tridimensionais (3D) e normalização baseada em imagem por meio de análise de fluxo extracelular. Essa abordagem permite uma avaliação mais precisa das respostas metabólicas do tumor aos tratamentos medicamentosos e fornece informações sobre os possíveis mecanismos de resistência.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os tumores cerebrais, especialmente os gliomas, são difíceis de tratar devido à sua natureza agressiva, microambiente tumoral complexo e resistência às terapias convencionais. As culturas de células bidimensionais (2D) tradicionais geralmente não conseguem replicar o verdadeiro ambiente tumoral, levando a previsões imprecisas da eficácia do medicamento. A tecnologia de análise de fluxo extracelular, normalmente usada para análise metabólica em tempo real em culturas 2D, mede os principais parâmetros metabólicos, como a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR), fornecendo informações sobre o metabolismo celular. O uso de modelos 3D representa um avanço significativo, pois eles imitam com mais precisão o ambiente tumoral in vivo . O analisador de fluxo extracelular foi adaptado para modelos tridimensionais (3D) de células de glioma, permitindo a análise de vias metabólicas críticas, incluindo glicólise e fosforilação oxidativa, em um contexto fisiologicamente mais relevante.

As células U87 foram semeadas em densidades apropriadas em uma placa de baixa inserção de 96 poços e cultivadas por 5 dias. No dia 5, a formação de esferóides 3D foi observada por meio de imagens de alto conteúdo. Os esferoides formados com sucesso foram então transferidos para uma placa de ensaio metabólico revestida com poli-L-lisina para análise metabólica. Para melhorar a precisão dessas medições, os sistemas de imagem de alto conteúdo avaliam o tamanho da célula 3D, permitindo a normalização precisa dos dados de fluxo extracelular e minimizando as variações metabólicas devido às diferenças no tamanho da célula. Essa abordagem integrada fornece uma análise mais confiável das respostas metabólicas das células de glioma aos tratamentos medicamentosos, revelando mecanismos potenciais de resistência aos medicamentos. Em última análise, essa metodologia oferece informações valiosas sobre a dinâmica metabólica dos gliomas e apóia o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas clinicamente relevantes.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os gliomas, uma forma prevalente e agressiva de tumor cerebral, representam desafios clínicos significativos devido à sua rápida progressão, microambiente tumoral altamente heterogêneo e resistência acentuada às terapias convencionais1. Essas complexidades exigem modelos experimentais fisiologicamente mais relevantes para melhorar a precisão das avaliações terapêuticas. Os sistemas tradicionais de cultura de células bidimensionais (2D) não conseguem recapitular a arquitetura tumoral in vivo e as interações célula-célula2, muitas vezes levando a conclusões enganosas sobre a eficácia do medicamento e a biologia do tumor3.

Para lidar com essas limitações, modelos tumorais tridimensionais (3D) surgiram como uma alternativa superior, oferecendo maior relevância biológica ao imitar as características estruturais e funcionais dos tumores in vivo 4,5. Ao mesmo tempo, a reprogramação metabólica é cada vez mais reconhecida como uma marca registrada da progressão do glioma e da resistência ao tratamento 6,7,8. A análise do fluxo extracelular tornou-se uma técnica amplamente adotada para medição em tempo real dos principais parâmetros metabólicos, como a taxa de acidificação extracelular (ECAR, medindo o efluxo de prótons principalmente da produção de lactato glicolítico) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR, quantificando a utilização de oxigênio mitocondrial na fosforilação oxidativa), fornecendo informações críticas sobre as vias de fosforilação glicolítica e oxidativa 9,10,11.

Neste estudo, a análise do fluxo extracelular foi adaptada para analisar esferoides de glioma 3D, permitindo a investigação de vias metabólicas em um contexto que se assemelha muito às condições tumorais in vivo . As células de glioma U87 foram semeadas a uma densidade de 1.500 células por poço em placas transparentes de fundo redondo de 96 poços de fixação ultrabaixa e cultivadas por 5 dias a 37 ° C com 5% de CO2 para facilitar a formação de esferóides. Imagens de alto conteúdo foram empregadas para confirmar a morfologia esferóide e avaliar o tamanho da célula. Antes da análise metabólica, esferoides de células 3D densas e circulares com um diâmetro de aproximadamente 220 μm foram transferidos para placas de ensaio pré-revestidas com poli-L-lisina para garantir a adesão e a estabilidade da medição. É importante ressaltar que a normalização dos dados metabólicos com base no tamanho do esferóide foi conduzida por meio de imagens integradas de alto conteúdo, reduzindo a variabilidade e aumentando a confiabilidade dos dados.

Essa plataforma integrada, combinando cultura 3D, tecnologia de análise de fluxo extracelular e normalização baseada em imagem, permite uma avaliação mais precisa das respostas metabólicas do glioma a intervenções terapêuticas. Este estudo fornece uma estrutura robusta para estudar os fundamentos metabólicos da resistência aos medicamentos e contribui para o desenvolvimento de estratégias de tratamento mais eficazes e clinicamente traduzíveis para gliomas.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: As especificações completas de todos os reagentes e consumíveis estão detalhadas na Tabela de Materiais.

1. Cultura de células 2D

  1. Manter as células U87 em meio essencial mínimo (MEM) suplementadas com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) em condições estéreis. Execute procedimentos de passagem padrão quando as células atingirem 80% de confluência.
    NOTA: Durante todo o processo de cultura, monitore de perto o estado celular e exclua as células que exibem crescimento anormal ou alterações morfológicas de experimentos subsequentes.
  2. Semear células U87 em placas de cultura de células de 10 cm e incubar em uma incubadora de cultura de células estéreis a 37 ° C com 5% (v / v) de CO2 e 90-95% de umidade relativa.
    NOTA: O meio deve ser substituído regularmente para manter as condições ideais de crescimento.

2. 3D formação de esferóides celulares

  1. Preparação experimental
    1. Revise todo o fluxo de trabalho na Figura 1 antes de iniciar os procedimentos experimentais.
      CUIDADO: Cumpra rigorosamente as técnicas assépticas durante todo o experimento para garantir a saúde celular e evitar a contaminação.
  2. Dissociação e contagem celular
    1. Remova o meio gasto da placa de cultura de células e lave as células U87 três vezes com 9 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (3 mL por lavagem). Descarte os reagentes usados em uma solução de alvejante a 20-25% (v/v) para inativar todos os materiais bioativos.
    2. Adicione 1 ml de solução de tripsina à cápsula e incube a 37 °C durante 2-3 min. Neutralize a tripsina com 2 mL de DMEM contendo 10% de FBS pré-aquecido a 37 ° C, uma vez que todas as células sejam destacadas sob observação microscópica.
    3. Transferir a suspensão celular para um tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar a 200 × g durante 3 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS. Pipetar as células suavemente para garantir uma suspensão celular uniforme. Em seguida, conte por meio de um hemocitômetro ou contador de células automatizado e registre a contagem inicial de células.
      NOTA: Manuseie as células com cuidado durante a lavagem e adição de mídia para evitar danos mecânicos. A força de pipetagem pode ser controlada para evitar a formação de bolhas, o que pode afetar a viabilidade celular e a precisão da contagem.
  3. Diluição da suspensão celular
    1. Pré-aqueça o meio não utilizado a 37 °C. Manter as suspensões celulares à temperatura ambiente (RT; 25 ± 2 °C) durante 30 min.
    2. Com base na contagem inicial de células, diluir a suspensão celular com DMEM contendo 10% de FBS até um volume final de 20 mL, garantindo aproximadamente 200.000 células.
      NOTA: Antes da diluição final, pipetar suavemente a suspensão celular para evitar a sedimentação. O meio não utilizado foi mantido a 37 °C e as suspensões celulares foram incubadas em RT. Se 96 poços com 1.500 células por poço fossem semeados, um volume total de 22 mL era preparado para compensar o excesso. A suspensão de células diluídas foi transferida para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL e bem misturada.
  4. Semeadura celular em placas de 96 poços de fixação ultrabaixa
    1. Misturar bem a suspensão celular final através de uma pipeta de 200 μL. Adicione 200 μL da suspensão (1.500 células/poço) lentamente a cada poço de uma placa transparente de 96 poços de fixação ultrabaixa de fundo redondo ao longo da borda.
      NOTA: Para eficiência, considere o uso de uma pipeta multicanal.
    2. Descarte qualquer suspensão restante depois que todos os poços estiverem cheios para evitar contaminação.
  5. Centrifugação
    1. Sele bem a placa com parafilme para evitar vazamentos durante a centrifugação. Centrifugue a mistura a 200 × g por 2 min para peletar as células no fundo de cada poço.
    2. Remova a placa da centrífuga, remova cuidadosamente o parafilme e coloque a placa em uma incubadora de CO2 a 37 °C, 5%.

3. Revestimento de poli-D-lisina das placas de ensaio metabólico

NOTA: A microplaca de ensaio metabólico é uma microplaca especializada projetada para adesão de esferóides celulares durante a análise de fluxo extracelular.

  1. Prepare uma solução de revestimento dissolvendo 5 mg de poli-D-lisina em 50 mL de água estéril. Homogeneizar.
  2. Adicionar 30 μL da solução de revestimento a cada alvéolo da placa de ensaio metabólico. Garanta a ausência de bolhas agitando suavemente ou aspirando o excesso de solução.
  3. Incubar a placa e cobri-la durante 20 min a RT. Aspirar a solução de revestimento e lavar os alvéolos duas vezes com 200 μL de água estéril.
  4. Seque a placa ao ar por pelo menos 30 min e depois aqueça a 37 °C sem CO2 por 30 min para estabilizar o revestimento.
  5. Adicione 175 μL de meio pré-aquecido a cada poço e mantenha a placa a 37 ° C em uma incubadora livre de CO2 até que esteja pronta para a transferência de esferóides celulares.

4. Monitoramento do crescimento de esferóides

  1. Transfira as placas esferoides para um sistema de imagem de alto conteúdo após 5 dias de cultura.
  2. Parâmetros de imagem de configuração: Defina a temperatura para 37 °C e o CO2 para 5% e ajuste o tipo de placa, canais e faixa de foco.
  3. Adquira imagens esferóides por meio de um microscópio confocal com objetivas de 10x e um software de imagem.
  4. Identifique poços contendo esferóides intactos (por exemplo, Figura 2A-C) e registre suas posições para transferência. Exclua poços com esferóides irregulares (por exemplo, Figura 2D)."

5. Tratamento esferóide

NOTA: O tratamento medicamentoso foi realizado em esferoides 3D maduros para avaliar as respostas metabólicas.

  1. Atribuição de grupo de esferóides
    1. Atribua esferoides intactos a dois grupos:
      Grupo controle: 6 poços replicados
      Grupo de tratamento: 6 poços replicados (tratados com fenofibrato)
  2. Preparação da solução medicamentosa
    1. Preparar a solução de trabalho de fenofibrato em meio fresco pré-aquecido na concentração óptima (por exemplo, 100 μM).
      NOTA: Os grupos de tratamento foram reconstituídos em DMSO 100% para criar soluções de estoque, que foram posteriormente diluídas em meio fresco pré-aquecido. Os grupos de controle receberam a mesma concentração final de DMSO (0,1% v/v) que estava presente nas amostras tratadas com drogas. A concentração final foi determinada por meio de ensaios de dose-resposta.
  3. Substituição de mídia
    1. Aspirar 100 μL de meio de cada poço lentamente ao longo da parede.
      NOTA: Evite entrar em contato com o fundo do poço para evitar distúrbios esferóides.
    2. Adicione 100 μL de meio fresco aos alvéolos de controle.
    3. Adicione 100 μL de solução de trabalho de fenofibrato aos poços de tratamento.
  4. Incubação pós-tratamento
    1. Retorne a placa suavemente a 37 ° C em uma incubadora de CO5 a 5% 2 . Cultura por 72 h.
  5. Avaliação morfológica
    1. Avalie a integridade dos esferoides seguindo o procedimento de imagem na etapa 4.

6. Transferência de esferóides celulares

  1. Remova cuidadosamente a placa de baixa fixação contendo esferoides do sistema de imagem e coloque-a em uma superfície estéril dentro de um gabinete de biossegurança. Coloque a placa de ensaio revestida com poli-L-lisina adjacente uma à outra para transferência.
  2. Apare a ponta de uma pipeta de 20 μL para facilitar a aspiração suave dos esferoides celulares sem danos.
  3. Aspire suavemente cada esferóide intacto do fundo do poço e transfira-o para o poço correspondente da placa celular, permitindo que ele assente por 20 s. Confirme a adesão pela ausência de fragmentos flutuantes sob microscopia de 10×.
  4. Repita para todos os esferóides e verifique a eficiência da transferência por meio do sistema de imagem descrito na etapa 4.

7. Ensaio metabólico

  1. Desgaseificação de amostras
    1. Coloque a placa de ensaio esferóide tratada com medicamento em uma câmara de hidratação pré-equilibrada a 37 ° C desprovida de CO2.
      NOTA: A desgaseificação contínua foi realizada por 1 h com rigoroso controle ambiental para garantir a precisão da medição metabólica.
  2. Preparação de reagentes e administração de medicamentos
    1. Paralelamente, prepare o reagente e carregue o medicamento durante o período de desgaseificação de 1 h.
      NOTA: O objetivo principal deste experimento é avaliar o estresse mitocondrial; Todos os procedimentos devem ser meticulosamente alinhados com esse objetivo. Protocolos específicos devem ser seguidos para tipos experimentais distintos para garantir a precisão e confiabilidade dos dados.
    2. Preparação de medicamentos: Use os seguintes compostos:
      Oligomicina (inibidor do complexo V mitocondrial)
      Cianeto de carbonila-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP, desacoplador)
      Uma mistura de rotenona (um inibidor do complexo I) e antimicina A (um inibidor do complexo III)
      NOTA: Os medicamentos foram obtidos do Kit de Teste de Estresse Mitocondrial usado neste estudo. Alguns compostos são bioperigosos; Protocolos rígidos de biossegurança (equipamentos de proteção individual e preparação para emergências) devem ser usados.
    3. Formulação de medicamentos
      1. Prepare as soluções de estoque dos medicamentos em pó conforme mostrado na Tabela 1.
      2. Diluir as soluções-mãe até às concentrações de trabalho especificadas no quadro 2.
        NOTA: As soluções são completamente agitadas ou agitadas para garantir a homogeneidade entre os gradientes de concentração.
  3. Carregamento de compostos em cartuchos de sonda de detecção
    NOTA: O cartucho de sonda de detecção é um cartucho descartável contendo sondas de biossensor para medição em tempo real de oxigênio e pH.
    1. Ativação do cartucho da sonda (deve preceder o carregamento do composto):
      NOTA: Garanta a ativação do sensor concluindo estas etapas pelo menos 12 h antes de usar:
      1. Adicionar 200 μL da solução calibrante a cada poço da placa de hidratação.
      2. Posicione o cartucho da sonda de detecção cuidadosamente na placa de hidratação, garantindo a imersão completa de todas as sondas na solução calibrante.
      3. Incube a unidade montada em uma incubadora livre de CO37 °C 2 por 12-24 h para ativar os sensores.
        NOTA: A imersão incompleta ou hidratação insuficiente causa desvio de medição (erro de ±15% de OCR).
    2. Use pipetas multicanal ou eletrônicas para fornecer volumes precisos aos poços, evitando gotículas residuais nas bordas dos poços.
      NOTA: Como a estimulação aguda do medicamento não é necessária, siga as sequências de carga padrão.
    3. Coloque a placa da sonda em uma superfície estável após o carregamento para evitar distúrbios durante o transporte.
      NOTA: A precisão do carregamento afeta significativamente os resultados.
  4. Configuração de software
    1. Inicie o software e selecione o protocolo de ensaio de teste de estresse mitocondrial.
    2. Atribua grupos de acordo com o agrupamento experimental predefinido.
    3. Defina o nome do arquivo e clique em Iniciar Execução.
  5. Calibração de cartuchos de sonda de detecção.
    1. Insira cuidadosamente a placa da sonda carregada no slot do instrumento de acordo com o prompt do sistema.
    2. Inicie a calibração (15-20 min). Manter condições estáveis; Evite vibrações.
    3. Remova a placa de hidratação imediatamente após a calibração (seguindo as instruções na tela).
      NOTA: Remova a tampa da placa antes da calibração.
  6. Perfil metabólico de esferoides 3D
    1. Transfira a placa de ensaio esferóide 3D desgaseificada para o slot de medição do instrumento. Garanta o alinhamento preciso com o conjunto de sondas, confirmando o seguinte: (i) Guias de ranhura de correspondência de canto da placa; (ii) O poço A1 está alinhado com a posição indexada; iii) Inexistência de espaço visível entre a placa e a superfície do instrumento
    2. Clique em Iniciar para iniciar os ensaios de estresse mitocondrial (duração: ~1,5 h). Monitore os parâmetros do instrumento por toda parte.
      NOTA: Remova as tampas das placas de ensaio esferóide 3D antes da medição.
  7. Análise de dados
    1. Análise de imagem
      1. Transfira placas de ensaio esferoides 3D para um sistema de imagem de alto conteúdo.
        NOTA: As imagens foram adquiridas conforme descrito na etapa 4. Os exames de imagem revelaram que a maioria dos esferoides permaneceu intacta, enquanto uma minoria sofreu danos durante o processo de transferência, como mostra a Figura 3.
      2. Analise os dados morfológicos (por exemplo, área, comprimento, largura) dos esferoides celulares por meio do software Harmony versão 5.2, seguindo as etapas 7.7.1.3-7.7.1.7.
      3. Aplique o módulo Região de textura grosseiramente para separar os esferoides 3D do plano de fundo, dividindo o conteúdo da imagem em três clusters com base nas características de textura dos objetos nas imagens.
      4. Aplique o módulo Localizar região da imagem para refinar a separação de esferoides 3D pré-isolados por meio de características de tamanho baseadas em volume para remover impurezas e reter esferoides intactos.
      5. Meça os parâmetros morfológicos dos esferoides 3D através do módulo Propriedades de Morfologia .
      6. Aplique o módulo Selecionar população para filtrar os esferoides de células 3D genuínos.
      7. Exporte os resultados dos dados morfológicos, conforme mostrado na Tabela 3.
    2. Processamento de dados
      NOTA: Normalize os dados da célula por meio de parâmetros das saídas de imagem para minimizar artefatos experimentais.
      1. Abra os dados metabólicos brutos através do software de análise.
      2. Selecione a opção de normalização para acessar a interface de edição do modo de normalização.
      3. Insira a área da seção transversal dos esferoides contidos em cada poço correspondente da placa de ensaio no campo Valores de normalização .
      4. Defina o parâmetro do fator de escala como 1.000.000.
      5. Clique no botão Aplicar para finalizar o processo de normalização. Os resultados finais são mostrados na Figura 4.

8. Eliminação de resíduos

  1. Descarte todos os resíduos experimentais (meios, reagentes, consumíveis e suspensões celulares) de acordo com os protocolos de gerenciamento de resíduos de laboratório e risco biológico. Autoclave ou desinfete quimicamente os resíduos bioativos antes do descarte para evitar a contaminação ambiental.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As três etapas mais críticas no processo de detecção do metabolismo energético de esferoides de células 3D são a cultura de esferoides de células 3D, o processo de transferência de esferoides e a imagem e quantificação de esferoides após a detecção (Figura 1). Além disso, observar o estado dos esferóides celulares é muito importante. Quando os experimentos foram conduzidos de acordo com os procedimentos experimentais acima mencionados, os esferoides foram detectados no5º dia (

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A adaptação da análise de fluxo extracelular a modelos de glioma 3D representa um avanço metodológico crítico no estudo do metabolismo de células tumorais. Embora as culturas 2D tradicionais tenham servido por muito tempo como base para a experimentação in vitro , elas não conseguem capturar a arquitetura espacial, as interações célula-célula e célula-matriz e os gradientes de oxigênio e nutrientes característicos dos tumores in vivo 12. Essas ca...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China, com os números de concessão 82471329 e 82001248.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Prato de 10 cmCorning430167
Tubo de centrífuga de 15 mLCorning430791
Tubo de centrífuga de 50 mLCorning430828
Calceína, AMInvitrogenC1430
Condessa 3Thermo FisherContador automático de células
Soro fetal bovinoGibcoA5669701
Harmonia 5.2PerkinElmerSoftware de imagem
Hoechst 33342SolarbioC0031
MEM EBSS MédioHyCloneSH30024.01
Opereta CLSPerkinElmerSistema de análise de imagem de alto conteúdo
PBSHyCloneSH30256.01
Bromidrato de poli-D lisinaSigma Pág. 7280
Placas de 96 poços de fixação ultrabaixa de fundo redondoCorning4515
Software de desktop Seahorse WaveAgilent
Cavalo-marinho XFe96AgilentMáquina de teste metabólico extracorpóreo
Sorvall ST8RThermo FisherCentrifuga
TRIPSINA 0,25% EDTAGibco25200072
Linha celular U87MG Infraestrutura Nacional de Recursos Celulares
XF 1,0 M Solução de Glicose, 50 mLAgilent103577-100
XF 100 mM Solução de piruvato, 50 mLAgilent103578-100
XF 200 mM Solução de Glutamina, 50 mLAgilent103579-100
Solução Calibrante XF 500 mL Agilent100840-000
Kit de teste de estresse XF Cell MitoAgilent103015-100
Meio XF DMEM, pH 7,4, 500 mLAgilent103575-100
XFe96/XF Pro Fluxpak-Matriz de Sondas de DetecçãoAgilent103792-100
XFe96/XF Pro Fluxpak-Placas de Ensaio MetabólicoAgilent103792-100

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacol Res. 171, 105780(2021).
  2. Crowley, A. E. 85th annual report on medical education in the United States. Executive summary. Jama. 254 (12), 1553-1554 (1985).
  3. Zhang, X., et al. Nutritionally physiological cell culture medium and 3D culture influence breast tumor proteomics and anticancer drug effectiveness. Pharmacol Res. 210, 107519(2024).
  4. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
  5. Bahl, R., et al. Growing desmoplastic three-dimensional pancreatic cancer spheroids from coculture. J Vis Exp. 211, e66625(2024).
  6. Faubert, B., Solmonson, A., Deberardinis, R. J. Metabolic reprogramming and cancer progression. Science. 368 (6487), eaaw5473(2020).
  7. Baksh, S. C., Finley, L. W. S. Metabolic diversity drives cancer cell invasion. Nature. 605 (7911), 627-628 (2022).
  8. Yoshida, G. J. Metabolic reprogramming: The emerging concept and associated therapeutic strategies. J Exp Clin Cancer Res. 34, 111(2015).
  9. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).
  10. Hong, X., Muñoz-Cánoves, P. Measuring oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in muscle stem cells using a Seahorse analyzer: Applicability for aging studies. Methods Mol Biol. 2640, 73-88 (2023).
  11. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  12. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  13. Rybkowska, P., et al. The metabolic changes between monolayer (2D) and three-dimensional (3D) culture conditions in human mesenchymal stem/stromal cells derived from adipose tissue. Cells. 12 (1), 178(2023).
  14. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  15. Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).
  16. Juarez-Moreno, K., Chávez-García, D., Hirata, G., Vazquez-Duhalt, R. Monolayer (2D) or spheroids (3D) cell cultures for nanotoxicological studies? Comparison of cytotoxicity and cell internalization of nanoparticles. Toxicol In Vitro. 85, 105461(2022).
  17. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. Elife. 9, e52904(2020).
  18. Beaufort, I. N., et al. Author commentary on Ilse N. Beaufort et al. Endoscopy. 56 (5), v6(2024).
  19. Liu, D., Chen, S., Win Naing, M. A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development. Biotechnol Bioeng. 118 (2), 542-554 (2021).
  20. Trettner, K. J., Hsieh, J., Xiao, W., Lee, J. S. H., Armani, A. M. Nondestructive, quantitative viability analysis of 3D tissue cultures using machine learning image segmentation. APL Bioeng. 8 (1), 016121(2024).
  21. Dominijanni, A. J., Devarasetty, M., Forsythe, S. D., Votanopoulos, K. I., Soker, S. Cell viability assays in three-dimensional hydrogels: A comparative study of accuracy. Tissue Eng Part C Methods. 27 (7), 401-410 (2021).

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