Identificação bioinformática de biomarcadores candidatos associados à periodontite em células-tronco periodontais tratadas com citocinas

Resumo

O estudo atual tem como objetivo explorar genes desregulados por meio de análise bioinformática em células-tronco do ligamento periodontal tratadas com citocinas. ERC2-IT1 com aumento e EPB41L4A-AS1 com redução foram identificadas como moléculas-chave nessas células, que podem servir como biomarcadores candidatos potencialmente associados à periodontite.

Resumo

O objetivo principal do presente estudo foi investigar o possível mecanismo molecular subjacente às células-tronco periodontais induzidas por citocinas (PDLSCs). Os dados de microarrays do conjunto de dados GSE260558 foram recuperados do banco de dados omnibus de expressão gênica (GEO). Após a normalização, os genes desregulados foram identificados. Em seguida, os diferentes mRNAs expressos (DE-mRNAs) foram submetidos a análises de enriquecimento da ontologia gênica (GO) e da enciclopédia de genes e genomas de Kyoto (KEGG). Posteriormente, os genes hub foram selecionados com base na rede de interação proteína-proteína (PPI). Por fim, as redes reguladoras competitivas de RNA endógeno (ceRNA) contendo genes hub foram estabelecidas usando o site ENCORI. Um total de 739 lncRNAs diferentes expressos (DE-lncRNAs) e 809 mRNAs expressos diferentes (DE-mRNAs) foram identificados usando o pacote limma na linguagem de programação R. Depois, as análises GO e KEGG demonstraram que os DE-mRNAs estavam intimamente associados à inflamação e à formação de matriz extracelular em PDLSCs tratados com citocinas. Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi construída para DE-mRNAs, e genes hub foram obtidos avaliando o grau. Um total de 12 genes hub regulados em alta e 12 genes hub regulados para baixo foram rastreados. Esses genes hub regulados para alta e para baixo foram então usados para construir uma rede reguladora de ceRNA, respectivamente. Nessas redes, ERC2-IT1 com aumento e EPB41L4A-AS1 com redução foram considerados lncRNAs-chave na periodontite. Em conclusão, a análise bioinformática revelou vários genes-chave e uma rede reguladora de ceRNA que participaram da progressão dos PDLSCs induzidos por citocinas. Embora este estudo tenha identificado vários biomarcadores candidatos relacionados à periodontite, é necessária uma validação experimental adicional em modelos animais ou amostras clínicas.

Introdução

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, a periodontite é reconhecida como a sexta doença inflamatória crônica mais prevalente, onipresente e irreversível entre os humanos ^1,2. Na era atual, afeta quase 15% da população^{mundial 1,2,3}. Foi relatado que a periodontite está fortemente correlacionada com uma variedade de fatores, como idade, gênero, práticas de higiene bucal, estado de tabagismo, etnia, status socioeconômico inferior e uma variedade de doenças sistêmicas ^2,3,4,5. A periodontite, que apresenta uma prevalência notavelmente alta entre adultos mais velhos, é patologicamente provocada por alterações disbióticas na microbiota subgingival que adere aos dentes ^6,7. Se não for tratada, essa condição acaba levando à destruição óssea, movimento dentário e à infeliz perda dos^dentes. Consequentemente, é urgente uma compreensão abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes à periodontite e a identificação de marcadores diagnósticos para a doença.

A complexidade estrutural e interativa do tecido periodontal é amplamente considerada um dos fatores significativos que contribuem para a grande dificuldade encontrada no processo de regeneração^{periodontal 9,10}. Entre a diversa gama de células-tronco mesenquimatosas (MSCs) utilizadas para a regeneração periodontal, as células-tronco do ligamento periodontal (PDLSCs) têm demonstrado ser uma fonte altamente confiável para a formação de novas estruturas semelhantes ao cemento no ambiente^{in vivo 11,12}. Nos estudos pré-clínicos recentes conduzidos, o tratamento baseado em PDLSCs apresentou resultados extremamente promissores no campo da regeneração de tecidos^13,14. Comparado ao tecido gengival do paciente, a análise transcriptômica dos PDLSCs apresentou maior orientação funcional e potencial de transformação^{terapêutica 13,14}.

Tecnologia bioinformática e métodos de análise bioinformática capacitam pesquisadores a identificar potenciais processos biológicos e associações com estatísticas proteômicas, genômicas e^{metabolômicas 15,16}. Além disso, a natureza de alta produtividade da tecnologia de bioinformática também permite que pesquisadores analisem conjuntos de dados biológicos em grande escala, como aqueles gerados a partir de sequenciamento de próxima geração e experimentos de^{microarrays 17,18}. Essa capacidade permite a identificação de potenciais biomarcadores para diagnóstico e prognóstico de doenças^19,20. Por exemplo, uma desintegrina e metaloproteinase 28 (ADAM28) e um domínio semelhante à desintegrina e metaloprotease com motivos de trombospondina tipo I como 3 (ADAMTSL3) foram identificados como novos biomarcadores em tecidos gengivais de pacientes com periodontite por meio de uma análise abrangente baseada na tecnologia de^{bioinformática 21}. Além disso, vários genes relacionados à ferroptose, incluindo o coativador do receptor nuclear 4 (NCOA4), o transportador de solutos 1A5 (SLC1A5) e a proteína de choque térmico B1 (HSPB1), foram relatados como apresentando melhor valor diagnóstico na^{periodontite 22}. No entanto, o mecanismo molecular da periodontite merece uma exploração mais aprofundada. No presente estudo, os pesquisadores buscam utilizar tecnologia de bioinformática para investigar genes hub em PDLSCs induzidos por citocinas e discernir potenciais processos e vias biológicas ligadas à periodontite. A análise bioinformática de PDLSCs tratados com citocinas captura programas transcricionais impulsionados por inflamação relevantes para a disfunção dos PDLSC, que abordam a diferença entre a disfunção da PDLSC e a periodontite. Esses genes e vias centrais em PDLSCs induzidos por citocinas oferecem insights valiosos sobre os mecanismos unificados subjacentes à periodontite.

Protocolo

1. Conjunto de Dados

Essa análise utilizou dados públicos e não envolveu sujeitos humanos ou animais, em conformidade com as diretrizes éticas institucionais e do JoVE. Todas as informações relacionadas às plataformas utilizadas estão disponíveis na Tabela de Materiais.

1. Selecione um total de 6 amostras (GSM8119437, GSM8119438, GSM8119439, GSM8119440, GSM8119441 e GSM8119442) do conjunto de dados GSE260558 (National Center of Biotechnology Information Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE260558) para análise de bioinformática.
2. Nessas amostras, cultive células-tronco do ligamento periodontal (PDLSCs) em meio normal ou em meio contendo citocinas inflamatórias por 7 dias.
3. Extraia o RNA total dos PDLSCs e submete-o ao sequenciamento de alta^{taxa 23}. O processo de análise bioinformática é mostrado na Figura 1.

2. Identificação de DEGs

1. Analise os perfis de expressão de lncRNA e mRNA usando o software limma (versão: 3.46.0) conforme descrito^{anteriormente 24}.
2. Realize comparações par a par entre citocinas e grupos normais.
3. Use a correção da taxa de falsas descobertas (FDR) com corte padrão de < 0,05 para identificar genes significativamente expressos de forma diferencial. Use os valores p ajustados (FDR) para controlar a proporção de falsos positivos entre os resultados estatisticamente significativos.
4. Use um corte ajustado do valor P de < 0,05 e um limiar de variação de dobra de > 1 para identificar lncRNAs ou mRNAs significativamente desregulados.
5. Apresente a expressão diferencial de genes em plots vulcânicos (ggplot2: versão 3.4.1), que foram gerados usando o software R (versão 4.0.4).
6. Liste os 10 principais lncRNAs e mRNAs desregulados em tabelas.

3. Análise de enriquecimento funcional

1. Realize a análise de enriquecimento GO dos DE-mRNAs usando o banco de dados online DAVID (Banco de Dados para Anotação, Visualização e Descoberta Integrada, https://david.ncifcrf.gov/).
   1. Submeta os genes desregulados ao site e selecione termos GO, incluindo função molecular (MF), processos biológicos (BP) e componentes celulares (CC), para realizar a análise GO.
   2. Submeta os genes desregulados para o plugin Cytoscape (versão: 3.8.2) ClueGO [16]+ e para o aplicativo Cluepedia.
   3. Aplique a correção de Benjamini-Hochberg para múltiplas comparações e defina o limiar de significância em um valor P ajustado < 0,05.
   4. Baixe os resultados do Cytoscape. Classifique os enriquecimentos em ordem decrescente com base no valor P e apresente os 5 melhores enriquecimentos em cada categoria.
2. A Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) é um recurso valioso de banco de dados para compreender as funções e impactos de alto nível dos sistemas biológicos (http://www.genome.jp/kegg/).
   1. Realize a análise KEGG de forma semelhante, escolhendo KEGG-PATHWAY no site.
   2. Defina o limiar de significância em um valor P ajustado < 0,05 e apresente os 10 principais enriquecimentos deste estudo. Realize essas análises de enriquecimento de acordo com os estudos ^{relatados 25,26}.

4. Rede PPI

1. Prediga e construa interações proteína-proteína (PPI) usando a ferramenta de busca para recuperação de genes interagentes (STRING, versão 12.0).
2. Submeta 318 mRNAs com regulação máxima ou 465 mRNAs com regulação negativa no site do STRING para construir a rede de IBPs.
3. Exporte os dados de interação da rede PPI e envie os dados para o software Cytoscape.
4. Esconda o nó individual na rede PPI. Baixe a rede de PPI presente neste estudo.
5. Calcule as propriedades topológicas da rede, incluindo a distribuição de graus, usando o aplicativo CentiScaPe, um plug-in do Cytoscape.
6. Quantifique a topologia local de cada gene somando o número de seus genes adjacentes e conte as interações para um dado nó.
7. Classifice todos os genes da rede PPI em ordem decrescente com base no grau de conectividade.
8. Selecione os 12 genes com maior aumento e 12 com maior baixa nesta lista ranqueada como os genes centrais.

5. rede reguladora miRNA-mRNA

NOTA: O banco de dados ENCORI (versão 12.0, https://rnasysu.com/encori/) foi usado para prever associações regulatórias entre microRNAs (miRNAs) e DE-lncRNAs (ou genes hub).

1. Submeta os genes hub com aumento ou para baixo para o ENCORI, e defina o critério de corte do programa ≥5 no total seis programas, incluindo PITA, RNA22, miRmap, miRanda, PicTar e TargetScan, para a análise de predição no ENCORI.
2. Baixe os miRNAs previstos e submeta para ENCORI para obter potenciais lncRNAs.
3. Baixe as LNCRAs previstas e identifique as lncRNAs sobrepostas entre o passo 5.2 e a Figura 2.
4. Submeta os genes hub, miRNAs obtidos na seção 5.1 e lncRNAs obtidos na etapa 5.3 ao software Cytoscape (versão 3.4.0) para construir a rede de ceRNA.

Resultados

Identificação de DEGs
O software limma R foi usado para analisar os perfis diferenciais de expressão de lncRNAs e mRNAs. As diferenças entre os dois grupos foram determinadas por um teste t não pareado. Como mostrado no diagrama do vulcão (Figura 2), um total de 739 lncRNAs diferentes expressos (DE-lncRNAs, valor p<0,05, |log2FC|>1) foram identificados. Entre esses DE-lncRNAs, 340 lncRNAs com regulação negativa e 399 lncRNAs com ...

Discussão

As células-tronco do ligamento periodontal (PDLSCs) são consideradas células-chave que desempenham um papel crucial na supressão do dano periodontal tanto na progressão quanto na recuperação da periodontite^32,33. Uma quantidade considerável de evidências demonstrou claramente que a incubação sob condição inflamatória tem potencial para acelerar significativamente a senescência dos PDLSCs^34,35

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
R	Fundação R para Computação Estatística	4.0.4	Ambiente open-source central para computação estatística. Serve como base para todas as análises subsequentes. Normalmente usado com RStudio.
Limma	Comunidade Biocondutora (Desenvolvedores Principais: Walter & Instituto Eliza Hall)	3.46.0	Pacote especializado para análise de expressão diferencial de microarrays e RNA-seq.
Citoscape	Consórcio Cytoscape	3.8.2	Plataforma de código aberto para visualização de rede. Requer instalação separada; suporta plugins como ClueGO e cytoHubba via App Store.
STRING	Laboratório Europeu de Biologia Molecular	12	O maior banco de dados do mundo para interações proteína-proteína (PPI) previstas e conhecidas. Acessado via web ou plugin Cytoscape; fornece escores de confiança.
ENCORI	Universidade Sun Yat-sen	3	Banco de dados público focado em redes de ceRNA (miRNA-mRNA-lncRNA).