Artigo de método

Análises da Rede de RNA Endógena Competitiva em Ratos com Oclusão da Artéria Cerebral Média com Base na Expressão de lncRNA, miRNA e mRNA

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DOI:

10.3791/68876

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7 de outubro de 2025

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1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

Neste artigo

Resumo

Este estudo usou análises de bioinformática e validação experimental para investigar sistematicamente os papéis regulatórios e os mecanismos subjacentes de RNAs longos não codificantes (lncRNAs) que funcionam como RNAs endógenos competitivos (ceRNAs) no AVC isquêmico.

Resumo

Este estudo tem como objetivo investigar os papéis regulatórios e os mecanismos subjacentes dos lncRNAs que atuam como ceRNAs no AVC isquêmico. Com base na hipótese do ceRNA, lncRNAs, miRNAs e mRNAs foram identificados como componentes de uma rede regulatória envolvida no AVC. Os principais lncRNAs da sub-rede resultante foram selecionados para análise detalhada. A análise de enriquecimento funcional usando Ontologia Genética e mapeamento de vias através da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto revelou interações críticas dentro da rede de ceRNA associada ao lncRNA. As principais vias, incluindo sinalização de cálcio, sinalização de junção comunicante e interação com o receptor de ligante neuroativo, foram validadas usando a análise de Western blot. A rede de ceRNA construída compreendeu 334 lncRNAs, miRNAs e mRNAs, com análise de enriquecimento funcional prevendo seus papéis biológicos. Três lncRNAs com alto grau de centralidade foram selecionados para construir uma sub-rede representativa de ceRNA. A análise de Western blot revelou que, em comparação com o grupo simulado, os níveis de expressão de proteínas-chave - CaMKII, calmodulina, CX36, PKC, CX43, GRIA3, GABRA6 e NPY1R foram significativamente regulados negativamente no grupo modelo, enquanto a expressão de CaN foi significativamente regulada positivamente (P < 0,05). Esses achados sugerem que os lncRNAs estão significativamente envolvidos na patogênese do AVC. Em conclusão, os lncRNAs que atuam como ceRNAs desempenham papéis regulatórios críticos na patogênese do AVC isquêmico.

Introdução

O acidente vascular cerebral isquêmico, um distúrbio neurológico prevalente, leva a danos cerebrais permanentes, incapacidade a longo prazo ou morte 1,2,3,4. MicroRNAs (miRNAs ou miR), RNAs longos não codificantes (lncRNAs) e RNAs mensageiros (mRNA) formam redes regulatórias mediadas por RNA 5,6,7,8. Essas moléculas regulam as funções celulares por meio de vários mecanismos complexos 9,10 são cada vez mais reconhecidos como contribuintes para a fisiopatologia do AVC isquêmico. No entanto, apesar de sua crescente associação com a condição, os papéis precisos desses RNAs não codificantes permanecem obscuros. Uma investigação mais aprofundada de novos RNAs não codificantes é essencial para esclarecer os mecanismos moleculares subjacentes ao AVC isquêmico.

Os lncRNAs atuam como reguladores-chave da expressão gênica durante o início e a progressão de várias condições patológicas. Servindo como RNAs endógenos concorrentes (ceRNAs), os lncRNAs se ligam a miRNAs para exercer efeitos regulatórios específicos11. Wei et al. relatam que o lncRNA AK038897 atua como um ceRNA visando o miR-26a-5p, modulando assim a proteína quinase 1 associada à morte (DAPK1) para exacerbar a lesão cerebral de isquemia-reperfusão12. Estudos mostram que o RNA não codificante longo SNHG1 (lncRNA SNHG1) funciona como um ceRNA para regular doenças cerebrovasculares, modulando a via de sinalização HIF-1α / VEGF por meio da interação com o miR-18a13. Estudos adicionais mostram que o gene 3 do RNA não codificante longo expresso maternalmente (lncRNA MEG3) modula a apoptose neuronal através da cascata de sinalização miR-21/PDCD414. Embora numerosos lncRNAs, miRNAs e mRNAs tenham sido identificados por meio de sequenciamento de alto rendimento ou análise de microarray, as funções dessas moléculas no AVC permanecem obscuras, e o estabelecimento sistemático de redes regulatórias mediadas por RNA é urgentemente necessário.

Portanto, este estudo tem como objetivo construir uma rede abrangente de lncRNA-miRNA-mRNA com base na hipótese do ceRNA usando dados coletados anteriormente e analisar sub-redes de ceRNA selecionadas por meio do enriquecimento da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) para entender melhor as funções do lncRNA. Os resultados podem revelar que vários lncRNAs funcionam como ceRNAs, potencialmente regulando miRNAs específicos e seus mRNAs alvo. O enriquecimento de GO pode destacar os principais processos biológicos, como desenvolvimento celular, transdução de sinal e regulação do ciclo celular, enquanto o enriquecimento de vias pode revelar seu envolvimento em vias relacionadas ao AVC, respostas imunes e metabolismo. Essas descobertas podem destacar os papéis potenciais dos lncRNAs em diversos processos celulares e mecanismos de doenças.

Várias melhorias importantes são oferecidas em relação aos métodos de análise de rede de ceRNA existentes na pesquisa de AVC isquêmico, conforme apoiado por comparações com estudos relacionados: primeiro, integrar a validação em várias camadas, combinando a construção da rede com a verificação da via funcional; ao contrário de Li et al.15, que se concentra principalmente no perfil bioinformático de redes de ceRNA relacionadas ao sistema imunológico usando dados públicos de transcriptoma, constroem uma rede de ceRNA compreendendo 334 lncRNAs, miRNAs e mRNAs e validam vias críticas de sinalização (sinalização de cálcio, sinalização de junção comunicante e interação ligante-receptor neuroativo) por meio da análise de Western blot, abordando a limitação da dependência excessiva de previsões in silico, como visto em Fan et al.16, que constrói uma rede de ceRNA associada ao circRNA, mas carece de validação experimental das vias a jusante, e confirma a relevância funcional da rede prevista quantificando a expressão de proteínas (por exemplo, CaMKII, CX36, GRIA3) no modelo e no grupo simulado; foco em lncRNAs centrais com alta importância topológica, aumentando a especificidade dos achados; ao contrário de Cheng et al.17, que constrói uma rede de ceRNA lncRNA-miRNA-mRNA com 3 lncRNAs, 2 miRNAs e 24 mRNAs, mas não prioriza os principais reguladores, identificam 3 lncRNAs com alto grau de centralidade para construir uma sub-rede representativa, garantindo que os insights mecanicistas sejam ancorados nos nós mais influentes e melhorando a interpretabilidade em comparação com redes mais amplas e menos focadas, como as descritas em Li et al.18, que inclui 62 lncRNAs, mas carece de análise de sub-rede direcionada; fornecer parâmetros experimentais detalhados para melhorar a reprodutibilidade: usar 500 ng-1 μg de RNA total extraído de tecidos cerebrais (6 ratos por grupo: 20 modelos MCAO e 20 controles operados por simulação) para preparação da biblioteca, com número de integridade de RNA (RIN) > 8,0 para garantir a qualidade, um detalhe não especificado em Wang et al.19, que valida biomarcadores de circRNA, mas omite as especificações de entrada de RNA; empregar ratos machos SPF SD (220 ± 30 g) com MCAO, um modelo amplamente utilizado, mas observe explicitamente suas limitações, ele não replica totalmente a complexidade vascular ou as respostas imunes do AVC isquêmico humano, conforme destacado em Li et al. - e mitiga isso estratificando ratos por escores neurológicos (1-3) para padronizar a gravidade do infarto; reconhecer as limitações do estudo: a rede de ceRNA pode não capturar modificações pós-traducionais, e o tamanho da amostra para validação de Western blot (n = 6 por grupo) pode ser expandido, com trabalhos futuros para incluir coortes maiores e análises proteômicas para resolver essas lacunas.

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Protocolo

Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Experimental da Universidade de Medicina Chinesa de Anhui (número de licença: AHUCM-rats-2024006) e conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e os padrões de uso de animais da JoVE. Quarenta ratos machos com FPS SD (220 g ± 30 g) foram usados neste estudo. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Animais experimentais

  1. Alojar os animais no Centro Experimental Animal em condições experimentais padrão. Mantenha um ciclo claro/escuro de 12 horas, troque a roupa de cama diariamente e forneça acesso gratuito a comida e água.
  2. Eutanasiar os animais no final do experimento administrando 150 mg/kg de pentobarbital sódico por injeção intraperitoneal para induzir um estado anestésico profundo (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Confirme a anestesia profunda pela ausência de resposta reflexiva ao beliscão da pata, monitore a respiração para garantir a perda completa dos sinais vitais e, em seguida, prossiga com a decapitação.

2. Indução do modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) em ratos

  1. Induza a anestesia administrando uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% na dose de 40 mg / kg20 (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Avalie a profundidade do anestésico usando a pinça do dedo do pé e os reflexos da córnea.
    1. Monitore continuamente a frequência respiratória e cardíaca durante todo o procedimento. Aplique pomada ocular estéril à base de óleo mineral imediatamente após a indução da anestesia para proteção ocular21.
  2. Uma vez totalmente anestesiado, faça uma incisão no pescoço na linha média e exponha cuidadosamente a artéria carótida comum direita (ACC), a artéria carótida interna (ACI) e a artéria carótida externa (ACE). Sob visualização direta, use instrumentos microcirúrgicos apropriados (por exemplo, fórceps e tesouras) para separar suavemente o tecido conjuntivo circundante e expor totalmente cada artéria.
    1. Após expor as artérias, ligar a ECA e a CCA usando suturas cirúrgicas. Amarre nós cirúrgicos seguros para obstruir o fluxo sanguíneo e minimizar o sangramento durante os procedimentos subsequentes. Garanta a tensão adequada para criar um campo estável para a inserção da sutura.
    2. Faça uma pequena incisão na bifurcação da ECA e da ACI usando tesoura oftálmica para preparar a inserção da sutura. Selecione uma sutura de náilon com um diâmetro de 0,25 mm e um comprimento de 18 mm a partir da ponta da extremidade arredondada (em forma de bola). Insira a sutura através do local da incisão na junção ECA-ICA e avance-a suavemente ao longo da ICA até uma profundidade de aproximadamente 18,5 mm ± 0,5 mm para ocluir a artéria cerebral média e induzir isquemia cerebral focal.
    3. Prenda a sutura de náilon inserida ao tecido circundante ou vasos sanguíneos usando suturas cirúrgicas para evitar o deslocamento. Após manter a MCAO por 2 h, induzir lesão de isquemia/reperfusão. Use uma pinça cirúrgica fina para agarrar suavemente a sutura de náilon e retire-a lentamente aproximadamente 5 mm para restaurar parcialmente o fluxo sanguíneo cerebral e induzir a lesão de reperfusão. No grupo simulado, ligar apenas a artéria carótida sem inserir um êmbolo de fio22.
  3. Uma semana após o estabelecimento bem-sucedido do modelo MCAO, anestesiar profundamente os ratos. Uma vez que não haja resposta ao beliscão da pata, decapite rapidamente e colha os cérebros. Enxágue os tecidos cerebrais com solução salina normal e armazene-os em uma geladeira a -80 ° C para criopreservação23.
  4. Escore de função neurológica
    1. Avalie a função neurológica usando o método de pontuação de Longa para determinar o sucesso do modelo MCAO24. Às 24 h pós-reperfusão, avaliar a função neurológica em cada rato e atribuir uma pontuação com base nos seguintes critérios: Pontuação 0: ausência de défice neurológico observável; Escore 1: flexão do membro torácico esquerdo durante a suspensão da cauda, membro torácico não totalmente estendido; Escore 2: flexão do membro torácico esquerdo durante a suspensão da cauda com resistência acentuadamente reduzida no lado afetado (esquerdo) quando colocado em uma superfície plana; Escore 3: igual ao escore 2, com movimentos circulares ou involuntários adicionados ao engatinhar; Escore 4: inconsciência ou morte em 24 horas.
      NOTA: Uma pontuação mais alta indica um distúrbio comportamental mais grave e maior comprometimento neurológico.
  5. Calcule o volume do infarto cerebral usando a coloração de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC)
    1. Corte cada cérebro de rato ex vivo ao longo do plano coronal em cinco fatias de igual espessura. Certifique-se de que cada fatia tenha precisamente 2.0 mm ± 0.1 mm de espessura. Mergulhe totalmente as seções em solução de coloração TTC a 2% (p / v) recém-preparada.
      1. Envolver o recipiente de coloração em folha de alumínio para proteger a solução da luz e incubar as amostras numa incubadora de temperatura constante a 37 °C ± 0,5 °C durante 30 minutos. Após a coloração, observe a coloração rosa-vermelha no tecido cerebral normal, enquanto as áreas infartadas isquêmicas permanecem não coradas (brancas) devido à perda da atividade da desidrogenase.
    2. Transfira fatias de cérebro coradas com TTC para uma solução de paraformaldeído a 4% (p / v) e fixe a 4 ° C por 24 h para preservar a morfologia do tecido. Após a fixação, capturar imagens digitais dos cortes usando um sistema de imagem de alta resolução. Registre e arquive os dados 24 h após a fixação.
    3. Use o software ImageJ para quantificar o volume do infarto e o volume total do tecido cerebral para cada grupo de ratos após a coloração TTC. Calcular a percentagem corrigida do volume do enfarte utilizando a seguinte fórmula25:
      Volume do infarto corrigido (%) = {[volume total da lesão − (volume do hemisfério esquerdo − volume do hemisfério direito)] / volume do hemisfério direito} × 100%.
    4. Use o software GraphPad Prism para visualizar e analisar estatisticamente os volumes de infarto corrigidos por meio de um teste t não pareado. Defina a significância estatística como P < 0,05.

3. Sequenciamento de RNA de alto rendimento

  1. Selecione tecidos cerebrais de três ratos em cada grupo. Remova o RNA ribossômico (rRNA) do total de amostras de RNA usando o Kit de Remoção de rRNA Ribo-Zero de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Construa bibliotecas complementares de DNA (cDNA) usando o Kit de Preparação de Biblioteca de RNA TruSeq seguindo o protocolo padrão. Use bibliotecas de cDNA purificadas para geração e sequenciamento de clusters.
  2. Use os dados principais gerados anteriormente26, que forneceram todas as bibliotecas e conjuntos de dados de sequenciamento para este estudo, sem depender de bibliotecas recém-construídas. Concentre o trabalho atual na análise de fusão integrada desses conjuntos de dados existentes sem gerar novas bibliotecas de RNA-seq ou dados de sequenciamento.
    1. Confirme a aprovação dos comitês de ética institucionais relevantes para o estudo anterior. Realizar sequenciamento de alto rendimento para avaliar sistematicamente o perfil de expressão de miRNA em ratos com MCAO, aderindo a protocolos padronizados conforme descrito anteriormente27.
      NOTA: Os dados de controle de qualidade para a biblioteca de sequenciamento de RNA são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

4. Análise de expressão diferencial de RNAs longos não codificantes, microRNAs e RNAs mensageiros

  1. Obtenha anotações para genes codificadores de proteínas, miRNAs e lncRNAs de Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html), miRBase (https://www.mirbase.org/) e NONCODE (http://www.noncode.org/), conforme apropriado 28,29,30. Quantifique a expressão gênica usando StringTie31 (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/).
    1. Monte as leituras alinhadas de cada amostra em transcriptomas usando o assembler StringTie. Use o módulo de mesclagem StringTie para integrar os assemblies de transcriptoma de todas as amostras, gerando um conjunto unificado de transcrições consistentes em toda a coorte. Use este transcriptoma mesclado para estimar a abundância de transcritos32.
    2. Realizar a quantificação de genes codificadores de proteínas e lncRNAs aplicando a normalização da Média Aparada de Valores M (TMM) e calculando Fragmentos por Kilobase de transcrição por milhão de leituras mapeadas (FPKM) para cada transcrito33,34.
  2. Realize a análise de expressão diferencial usando o pacote edgeR (https://bioconductor.org/) para identificar lncRNAs (DELs), miRNAs (DEMis) e mRNAs (DEMs) diferencialmente expressos entre os grupos MCAO e controle. Converta a matriz de contagem bruta filtrada em um objeto edgeR DGEList. Estime a dispersão comum e atribua o mesmo valor de dispersão a cada gene ou miRNA.
    1. Realize um teste exato para comparar a expressão gênica entre os grupos. Recupere a alteração de log 2 vezes (log2FC), a contagem de logs por milhão (logCPM), os valores P e os valores P ajustados pela taxa de descoberta falsa (FDR) para cada gene35 expresso diferencialmente. Defina a significância estatística como P < 0,05 com um limite de mudança de dobra de |log2(FC)| > 1.

5. Predição de alvos longos de RNA não codificante e RNA mensageiro de microRNAs diferencialmente expressos

  1. Recupere as sequências de DEMis e DELs dos bancos de dados apropriados. Use as ferramentas de previsão de interação miRNA-lncRNA miRanda36 e RNAhybrid37 para identificar possíveis interações entre DEMis e DELs. Obtenha pares de interação miRNA-mRNA do banco de dados miRWalk 3.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)38

6. Construção da rede reguladora de RNA longo não codificante - microRNA - mensageiro

  1. Construir a rede reguladora lncRNA-miRNA-mRNA com base na hipótese ceRNA39,40.
    1. Calcule o coeficiente de correlação de Pearson (PCC) entre DELs e DEMs. Selecione os pares lncRNA-mRNA para análise posterior se o PCC > 0,99 e o P < 0,01.
    2. Para cada par lncRNA-mRNA co-expresso, identifique miRNAs compartilhados direcionados a ambos os transcritos. Use esses miRNAs compartilhados para construir a rede de co-expressão miRNA-mRNA-lncRNA.
    3. Use o Cytoscape (https://cytoscape.org/) para construir e visualizar a rede de interação lncRNA-miRNA-mRNA41,42. Siga esses passos:
      1. Use o plug-in CytoNCA para calcular a centralidade de intermediação (BC), a centralidade de proximidade (CC) e a centralidade de grau (DC) para cada nó.
      2. Selecione genes com pontuações de centralidade que excedam os valores medianos de todas as três métricas para construir a sub-rede chave final.
      3. Use o plug-in CytoHubba para identificar os 10 principais genes centrais na rede de interação proteína-proteína e extraia os principais nós identificados na Etapa 2.
      4. Calcule o grau do nó para cada componente da rede de ceRNA.

7. Análises de enriquecimento funcional

  1. Realize análises de enriquecimento das vias GO e KEGG para investigar melhor a função do RNA43. Use o pacote clusterProfiler (https://bioconductor.org/) para visualizar os resultados do enriquecimento44.

8. Análise de Western blot para detectar os níveis de expressão de proteínas-chave envolvidas em vias relacionadas ao lncRNA - ceRNA

  1. Sob anestesia profunda, remova rapidamente todo o cérebro. Após remover cuidadosamente as meninges e vasos sanguíneos, isole o tecido cortical na área infartada do rato45. Use uma tesoura fina para cortar o tecido em pedaços pequenos, garantindo que cada pedaço pese entre 50 mg e 100 mg. Transfira as amostras de tecido pesadas para tubos de homogeneização pré-resfriados.
    1. Prepare o tampão de lise de proteína em uma proporção de volume de PMSF para tampão de lise RIPA de 1:100 (concentração final de 1 mM PMSF). Adicione o tampão de lise na proporção de 200 μL por 20 mg de tecido. Homogeneizar bem as amostras utilizando um homogeneizador de vidro esterilizado por calor até que o tecido esteja finamente decomposto.
    2. Incube os homogeneizados no gelo por 30 min, agitando suavemente a cada 10 min para facilitar a lise completa. Centrifugar as amostras a 28.656,6 × g durante 15 min a 4 °C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante que contém proteínas totais, sem perturbar o sedimento.
  2. Adicione 5× tampão de carga de eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE) à amostra de proteína na proporção de 1:4 (1 volume de tampão 5× para 4 volumes de amostra de proteína). Após a diluição, a concentração final de trabalho do tampão de carregamento SDS-PAGE é de 1×.
    1. Misture bem e aqueça em banho-maria fervente por 10 min para desnaturar completamente as proteínas. Deixe as amostras esfriarem até a temperatura ambiente. Carregue 30 μg de cada amostra nos poços de gel SDS-PAGE.
    2. Realize a eletroforese em dois estágios: aplique 80 V por 30 min para resolver as proteínas através do gel de empilhamento, depois aumente para 120 V por 1 h para separar as proteínas no gel de resolução.
  3. Prepare papel de filtro pré-cortado e membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) para corresponder ao tamanho do gel. Mergulhe a membrana de PVDF em metanol por 3 min para ativá-la. Mergulhe a membrana de PVDF e o papel de filtro no tampão de transferência por 5 min.
    1. Monte o sanduíche de transferência na seguinte ordem (de cima para baixo): placa anódica, três camadas de papel de filtro, membrana de PVDF, gel, três camadas de papel de filtro, placa catódica. Garanta o alinhamento adequado das camadas de gel, membrana e papel de filtro. Remova todas as bolhas de ar em cada etapa para garantir uma transferência uniforme.
  4. Imediatamente após a transferência de proteína, enxágue a membrana de PVDF em tampão de lavagem ocidental por 5 min para remover o tampão de transferência residual. Bloqueie a membrana à temperatura ambiente por 2 h com agitação suave em tampão de bloqueio ocidental contendo 5% de leite em pó desnatado ou use 5% de BSA se detectar proteínas fosforiladas.
  5. Após o bloqueio, incubar a membrana com o anticorpo primário (1:1000) a 4 °C durante a noite, agitando suavemente. No dia seguinte, incubar a membrana com o anticorpo secundário (1:10.000) durante 2 h à temperatura ambiente.
  6. Realize a detecção quimioluminescente em uma sala escura para evitar interferência de luz. Coloque o lado da proteína da membrana de PVDF no centro da placa de exposição no sistema de imagem automática.
    1. Misture volumes iguais de reagente ECL A e reagente ECL B em um tubo de centrífuga limpo imediatamente antes do uso. Aplique a solução ECL misturada uniformemente na superfície da membrana para iniciar a reação luminescente.
    2. Após 1-2 min de incubação à temperatura ambiente, remova suavemente o excesso de líquido sem perturbar a superfície da membrana. Ajuste os parâmetros de exposição no sistema de imagem de acordo com a intensidade da luminescência para otimizar a captura do sinal.

9. Análise estatística

  1. Analise os resultados do Western blot usando o software ImageJ para quantificar os valores de cinza da banda. Use o GraphPad Prism para análise estatística de dados experimentais. Expresse todos os dados como média ± desvio padrão (x ± DP). Avalie as diferenças estatísticas entre os grupos usando um teste t não pareado.
    1. Insira os dados dos dois grupos de amostras independentes na tabela de dados do software, com cada grupo correspondendo a uma coluna separada e as amostras independentes umas das outras. Verifique a normalidade selecionando "Testes de normalidade e simetria" na função "Analisar" e aplicando o teste de Shapiro-Wilk a ambos os grupos.
    2. Se P > 0,05 para ambos os grupos, considere os dados normalmente distribuídos. Com base nisso, selecione Teste t não pareado em testes t na função Analisar para executar a análise. Defina a significância estatística como P < 0,05.

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Resultados

Os resultados experimentais da verificação da taxa de sucesso de cada grupo de modelos de ratos são mostrados na Figura 1. Após a modelagem, a pontuação da função neurológica foi realizada nos ratos (Figura 1A). O grupo modelo exibiu déficits neurológicos graves, e aqueles com pontuações variando de 1 a 3 foram incluídos em experimentos subsequentes. As Figuras 1B e C mostram os resultados da coloração TTC, com vermelho representand...

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Discussão

Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patogênese do AVC e identificar potenciais alvos diagnósticos e terapêuticos, análises de RNA-Seq e RNA-Seq pequeno (sRNA-Seq) foram realizadas em tecidos cerebrais de ratos após MCAO. Este estudo tem como objetivo principal investigar as complexas redes regulatórias envolvendo lncRNAs, miRNAs e mRNAs. Uma análise abrangente dos conjuntos de dados de RNA-Seq e sRNA-Seq de tecidos cerebrais de ratos induzidos por MCAO foi conduzida p...

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Divulgações

Os autores afirmam que não há interesses conflitantes.

Agradecimentos

Este manuscrito foi apoiado pelo Projeto de Financiamento de Candidatos da Reserva de Líderes Acadêmicos da Província de Anhui (No.2022H287), Projeto Chave de Pesquisa em Saúde da Província de Anhui (Referência: AHWJ2022a013), Projeto Chave de Pesquisa em Ciências Naturais do Colégio Provincial de Anhui (NO.2023AH050745) e Projeto de Talentos Excepcionais de Higiene e Saúde da Província de Anhui (NO. ahsjhmypygc20230074).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de coloração TTC a 2% (p/v)Pequim Kangle Clone Biotecnologia Co., Ltd. 20230805Coloração TTC
Solução de paraformaldeído a 4% (p/v)BeyotimePág. 0099Tecido cerebral fixo
40 ratos machos SD de grau SPFHagzhou Ziyuan Laboratório de Criação de Animais Co., LtdSCXK [zhe] 2024-0004animal de laboratório
5% de leite em pó desnatadoPhygene CientíficoPH1519WB
sistema de eletroforese de agaroseBiotecnologia Co. de Pequim Liuyi, Ltd.DYCP-44PWB
instrumento de exposição automáticaXangai Peiqing Technology Co., Ltd.JS-M6PWB
Medidor de exposição automáticoXangai Peiqing Technology Co., LTDJS-M6PWB
Máquina de gelo automáticaChangshu Cidade Xueke Electric Appliance Co., LTDIMS-20WB
CalmodulinaAfinidadeRolamento 49B2443WB
CamKIIAfinidade14G0796WB
centrifugaHaimen Qilinbeier Instrument Manufacturing Co., Ltd.LX 300WB
Pacote clusterProfilerBiocondutorclusterProfiler_4.17análises de enriquecimento
CX36ZENBION24AP24WB
CX43ZENBIOM08NO01WB
Kit de quimioluminescência ultrassensível ECLBiosharpBL520BWB
Forno de secagem termostático elétrico ao arInstrumento científico Co. de Shanghai Sanfa, LTDDHG-9070WB
Aparelho de eletroforeseXangai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)EPS300WB
aparelho de eletroforeseXangai Tanon Ciência & Fornecedor:Technology Co., Ltd.EPS300WB
tanque de eletroforeseXangai Tanon Ciência & Fornecedor:Technology Co., Ltd.VE-180WB
GABRA6Afinidade46V5371WB
IgG anti-rato de cabraZs-BIO142637WB
IgG anti-coelho de cabraZs-BIO139931WB
GRIA3Afinidade0C33051WB
Centrífuga refrigerada de alta velocidadeEquipamento Co. do instrumento de Anhui Jiawen, LTDJW-3021HRWB
Sistema HiSeq 2500Illumina/Sequenciamento de RNA de alto rendimento
Software ImageJInstitutos Nacionais de SaúdeImageJ 1.54kColoração TTC
Agitador de aquecimento magnéticoCidade de Changzhou e fábrica de instrumentosJJ-79-1WB
MicropipetaAlemanha Eppendorf/WB
Micro centrífuga de temperatura normalHaimen Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300LX300WB
NPY1RAfinidade2D38248WB
pipetaEppendorf0.5-10ulWB
PKCAfinidade17E3745WB
marcador de proteína pré-coradoBiosharpBL712CWB
Membrana em PVDFMilliporeIPVH00010WB
Kit de remoção de rRNA Ribo-ZeroIllumina, San Diego, Califórnia, EUA/Extração de RNA
Lisado RIPABiosharpBL504AWB
Pentobarbital sódicoPequim Think-Far Technology Co., Ltd.MERCKanestésico
instrumento de membrana de transferênciaXangai Tanon Ciência & Fornecedor:Technology Co., Ltd.VE-186WB
Aparelho transmembranaXangai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)VE-186WB
β-actinaZs-BIO19AW0505WB

Referências

  1. Marquez-Ortiz, R. A., et al. Neuroimmune support of neuronal regeneration and neuroplasticity following cerebral ischemia in juvenile mice. Brain Sci. 13 (9), 1337(2023).
  2. Han, M., Ma, B., She, R., Xing, Y., Li, X. Correlations between serum cxcl9/12 and the severity of acute ischemic stroke, a retrospective observational study. Neuropsychiatr Dis Treat. 19, 283-292 (2023).
  3. Wang, J., Shan, A., Shi, F., Zheng, Q. Molecular and clinical characterization of ang expression in gliomas and its association with tumor-related immune response. Front Med (Lausanne). 10, 1044402(2023).
  4. Ma, W., et al. Effects of ischemic postconditioning and long noncoding RNAs in ischemic stroke. Bioengineered. 13 (6), 14799-14814 (2022).
  5. Deng, Y., et al. High-throughput sequencing to investigate lncRNA-circRNA-miRNA-mRNA networks underlying the effects of beta-amyloid peptide and senescence on astrocytes. Front Genet. 13, 868856(2022).
  6. Li, R. B., Yang, X. H., Zhang, J. D., Cui, W. Gas6-as1, a long noncoding RNA, functions as a key candidate gene in atrial fibrillation-related stroke determined by ceRNA network analysis and WGCNA. BMC Med Genomics. 16 (1), 51(2023).
  7. Shu, J., Yang, L., Wei, W., Zhang, L. Identification of programmed cell death-related gene signature and associated regulatory axis in cerebral ischemia/reperfusion injury. Front Genet. 13, 934154(2022).
  8. Zou, J. B., et al. Reconstruction of the lncRNA-miRNA-mRNA network based on competitive endogenous RNA reveal functional lncRNAs in cerebral infarction. Sci Rep. 9 (1), 12176(2019).
  9. Zheng, H. Y., et al. Longitudinal transcriptome analyses show robust T cell immunity during recovery from COVID-19. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 294(2020).
  10. Lu, Z., Deng, M., Ma, G., Chen, L. Trim38 protects h9c2 cells from hypoxia/reoxygenation injury via the traf6/tak1/nf-κb signalling pathway. PeerJ. 10, e13815(2022).
  11. Zhang, C., et al. Long noncoding RNAs in intracerebral hemorrhage. Front Mol Neurosci. 16, 1119275(2023).
  12. Wei, R., Zhang, L., Hu, W., Wu, J., Zhang, W. Long noncoding RNA ak038897 aggravates cerebral ischemia/reperfusion injury via acting as a cerna for mir-26a-5p to target dapk1. Exp Neurol. 314, 100-110 (2019).
  13. Retraction: LncRNA snhg1 regulates cerebrovascular pathologies as a competing endogenous RNA through hif-1α/vegf signaling in ischemic stroke. J Cell Biochem. 126 (4), e70017(2025).
  14. Yu, Z., et al. Tnf-α stimulation enhances the neuroprotective effects of gingival MSCs-derived exosomes in retinal ischemia-reperfusion injury via the meg3/mir-21a-5p axis. Biomaterials. 284, 121484(2022).
  15. Li, Y., et al. Profiling immune cell-related gene features and immunoregulatory ceRNA in ischemic stroke. Mol Biomed. 5 (1), 72(2024).
  16. Fan, R., et al. Integrated analysis of circRNA-associated ceRNA network in ischemic stroke. Front Genet. 14, 1153518(2023).
  17. Cheng, L., Zhao, Y., Ke, H. Comprehensive analysis of lncRNA-miRNA-mRNA cerna network in ischemic stroke. Heliyon. 10 (9), e29651(2024).
  18. Li, S., et al. Construction of lncRNA-mediated ceRNA network for investigating immune pathogenesis of ischemic stroke. Mol Neurobiol. 58 (9), 4758-4769 (2021).
  19. Wang, X. Z., et al. Construction of circRNA-mediated immune-related ceRNA network and identification of circulating circRNAs as diagnostic biomarkers in acute ischemic stroke. J Inflamm Res. 15, 4087-4104 (2022).
  20. Movassaghi, S., et al. Effect of pentoxifylline on ischemia-induced brain damage and spatial memory impairment in rats. Iran J Basic Med Sci. 15 (5), 1083-1090 (2012).
  21. Saund, J., Dautan, D., Rostron, C., Urcelay, G. P., Gerdjikov, T. V. Thalamic inputs to dorsomedial striatum are involved in inhibitory control: Evidence from the five-choice serial reaction time task in rats. Psychopharmacology (Berl). 234 (16), 2399-2407 (2017).
  22. Fei, C., et al. Effects of tao hong si wu decoction on circular rna expression profiles in rats with middle cerebral artery occlusion. Chinese Pharmacological Bulletin. 40 (05), 954-963 (2024).
  23. Ma, R., et al. Correlation of thrombin and lc3II/I expression in different ischemic phases and different brain regions in the MCAO model rats. J Hunan Univ Chinese Med. 42 (06), 899-905 (2022).
  24. Li, S., et al. Regulation of nr4a1 by taohong siwu decoction inhibits endothelial cell apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injury. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120285(2025).
  25. Ji, Z. J., et al. Neuroprotective effect of taohong siwu decoction on cerebral ischemia/reperfusion injury via mitophagy-NLRP3 inflammasome pathway. Front Pharmacol. 13, 910217(2022).
  26. Duan, X., et al. RNA sequencing for gene expression profiles in a rat model of middle cerebral artery occlusion. Biomed Res Int. 2018, 2465481(2018).
  27. Duan, X., et al. Identification and functional analysis of microRNAs in rats following focal cerebral ischemia injury. Mol Med Rep. 19 (5), 4175-4184 (2019).
  28. Zerbino, D. R., et al. Ensembl 2018. Nucleic Acids Res. 46 (D1), D754-D761 (2018).
  29. Ji, X., et al. A comprehensive rat transcriptome built from large-scale RNA-seq-based annotation. Nucleic Acids Res. 48 (15), 8320-8331 (2020).
  30. Zheng, Y., et al. Npinter v5.0: NcRNA interaction database in a new era. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D232-D239 (2023).
  31. Oliveira, L. A., et al. The widespread misuse of stringtie's gene identifier tags as de facto gene symbols does not allow consistent gene identification in published research. Gene. 954, 149440(2025).
  32. Pertea, M., et al. Stringtie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nat Biotechnol. 33 (3), 290-295 (2015).
  33. Zaghlool, A., et al. Characterization of the nuclear and cytosolic transcriptomes in human brain tissue reveals new insights into the subcellular distribution of RNA transcripts. Sci Rep. 11 (1), 4076(2021).
  34. Zhang, W., et al. Transcriptomic data of peach varieties with different chilling requirement levels. BMC Genom Data. 25 (1), 99(2024).
  35. Chamorro Petronacci, C. M., et al. Identification of prognosis-associated microRNAs in HNSCC subtypes based on the TCGA dataset. Medicina (Kaunas). 56 (10), 535(2020).
  36. Wang, X., et al. Exosomes activate hippocampal microglia in atrial fibrillation through long-distance heart-brain communication. BMC Cardiovasc Disord. 24 (1), 627(2024).
  37. Jiang, P., et al. Circrna-phf21a_0002 promotes pyroptosis to aggravate hepatic ischemia/ reperfusion injury by sponging let-7b-5p. Heliyon. 10 (16), e34385(2024).
  38. Faraldi, M., et al. Circulating biomarkers associated with walking performance in elderly subjects: Exploring miRNAs, metabolic and inflammatory biomarkers. Geroscience. 47 (3), 3977-3996 (2025).
  39. Jiang, H., et al. Reconstruction and analysis of the lncRNA-miRNA-mRNA network based on competitive endogenous RNA reveal functional lncRNAs in rheumatoid arthritis. Mol Biosyst. 13 (6), 1182-1192 (2017).
  40. Alipour, S., et al. Innovative targets of the lncRNA-miRNA-mRNA network in response to low-dose aspirin in breast cancer patients. Sci Rep. 12 (1), 12054(2022).
  41. Ono, K., et al. Cytoscape web: Bringing network biology to the browser. Nucleic Acids Res. 53 (W1), W203-W212 (2025).
  42. Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  43. Huckvale, E. D., Moseley, H. N. B. Predicting the pathway involvement of all pathway and associated compound entries defined in the Kyoto Encyclopedia of genes and genomes. Metabolites. 14 (11), (2024).
  44. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. Clusterprofiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  45. Ueno, Y., et al. Axonal outgrowth and dendritic plasticity in the cortical peri-infarct area after experimental stroke. Stroke. 43 (8), 2221-2228 (2012).
  46. Arkelius, K., et al. Lox-1 and mmp-9 inhibition attenuates the detrimental effects of delayed rt-PA therapy and improves outcomes after acute ischemic stroke. Circ Res. 134 (8), 954-969 (2024).
  47. Hou, L., et al. Itgam is a critical gene in ischemic stroke. Aging (Albany, NY). 16 (8), 6852-6867 (2024).
  48. Miao, M., Lyu, M., Zhong, C., Liu, Y. Correlation between mmp9 promoter methylation and transient ischemic attack/mild ischemic stroke with early cognitive impairment. Clin Interv Aging. 18, 1221-1232 (2023).
  49. Li, W., et al. Clec7a knockdown alleviates ischemic stroke by inhibiting pyroptosis and microglia activation. J Integr Neurosci. 23 (12), 219(2024).
  50. Shi, Y., et al. C5ar1 mediates the progression of inflammatory responses in the brain of rats in the early stage after ischemia and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 12 (21), 3994-4006 (2021).
  51. Yan, Y., Chen, L., Zhou, J., Xie, L. Snhg12 inhibits oxygen-glucose deprivation-induced neuronal apoptosis via the mir-181a-5p/negr1 axis. Mol Med Rep. 22 (5), 3886-3894 (2020).
  52. Wei, X. Y., et al. Long noncoding RNA RPL34-AS1 ameliorates oxygen-glucose deprivation-induced neuronal injury via modulating miR-223-3p/igf1r axis. Hum Cell. 35 (6), 1785-1796 (2022).
  53. Zhou, X., et al. Long noncoding RNA norad protects against cerebral ischemia/reperfusion injury-induced brain damage, cell apoptosis, oxidative stress, and inflammation by regulating miR-30a-5p/ywhag. Bioengineered. 12 (2), 9174-9188 (2021).
  54. Gao, H., et al. Long noncoding RNA Peg13 alleviates hypoxic-ischemic brain damage in neonatal mice via mir-20a-5p/xiap axis. Neurochem Res. 47 (3), 656-666 (2022).
  55. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  56. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-seq by poly (a) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15 (1), 419(2014).
  57. Wang, C., et al. The construction and analysis of lncRNA-miRNA-mRNA competing endogenous RNA network of Schwann cells in diabetic peripheral neuropathy. Front Bioeng Biotechnol. 8, 490(2020).
  58. Pillai-Kastoori, L., et al. Antibody validation for Western blot: By the user, for the user. J Biol Chem. 295 (4), 926-939 (2020).
  59. Liu, Q., et al. Mir-190a potentially ameliorates postoperative cognitive dysfunction by regulating tiam1. BMC Genomics. 20 (1), 670(2019).
  60. Vella, D., Zoppis, I., Mauri, G., Mauri, P., Di Silvestre, D. From protein-protein interactions to protein co-expression networks: A new perspective to evaluate large-scale proteomic data. EURASIP J Bioinform Syst Biol. 2017 (1), 6(2017).
  61. Panfil, K., Deavours, A., Kirkpatrick, K. Effects of the estrous cycle on impulsive choice and interval timing in female rats. Horm Behav. 149, 105315(2023).
  62. Ouyang, S., et al. Comprehensive bioinformatics analysis to reveal key RNA targets and hub competitive endogenous RNA network of keratoconus. Front Genet. 13, 896780(2022).
  63. Chen, X., et al. Cx3cl1/cx3cr1 axis attenuates early brain injury via promoting the delivery of exosomal microRNA-124 from neuron to microglia after subarachnoid hemorrhage. J Neuroinflammation. 17 (1), 209(2020).
  64. Karim, M. R., et al. Explainable AI for bioinformatics: Methods, tools and applications. Brief Bioinform. 24 (5), bbad236(2023).
  65. Shainer, I., et al. Transcriptomic neuron types vary topographically in function and morphology. Nature. 638 (8052), 1023-1033 (2025).

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