Method Article

Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

DOI:

10.3791/68960

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January 9th, 2026

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1Clinical Medical College, Yangzhou University, 2Department of Gastroenterology, Shanghai Institute of Pancreatic Diseases, Changhai Hospital, National Key Laboratory of Immunity and Inflammation, Naval Medical University, 3Department of Gastroenterology. Affiliated Yueqing Hospital, Wenzhou Medical University

In This Article

Summary

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Este estudo desenvolveu um método simplificado para extrair eficientemente ilhéus primários funcionais e células acinares do pâncreas do camundongo, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação intercelular na patogênese do Diabetes Induzido por Pancreatite Aguda.

Abstract

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Nas pesquisas sobre a patogênese da pancreatite mellitus pós-aguda (PPDM-A), a comunicação bidirecional anormal entre células acinares pancreáticas (PACs) e células das ilhotas é um foco central. No entanto, linhagens celulares imortalizadas não podem replicar condições fisiopatológicas, tornando a extração de células primárias de alta qualidade crucial. Os métodos atuais para extrair ilhéus primários de camundongos baseiam-se principalmente na perfusão pancreática in vivo por meio de canulação dos ductos biliares, que possui uma barreira técnica alta e não é propícia à operação por pesquisadores sem experiência.

Esse estudo modificou o método, eliminando a necessidade de perfusão complexa in vivo . Camundongos grau SPF C57BL/6J (6-8 semanas) foram anestesiados e eutanasiados, seguidos pelo isolamento do pâncreas. O pâncreas foi digerido in vitro com colagenase P; ilhéus primários foram separados por centrifugação com gradiente de densidade de Ficoll, e células acinares foram obtidas por filtração por peneira e centrifugação. A viabilidade e função celular foram avaliadas usando coloração por calcina/iodeto de propidium (Calceína/PI), ensaio de secreção de insulina estimulada por glicose e detecção da atividade da amilase.

Os resultados mostraram que o método modificado era fácil de operar: o rendimento por camundongo era (120 ± 5) ilhéus primários e 1,6-1,95 × células acinares; As taxas de viabilidade das ilhotas e células acinares foram (97,52 ± 0,16%) e (96,55 ± 0,95), respectivamente. Além disso, as ilhotas apresentavam capacidade normal de secreção de insulina, e as células acinares eram sensíveis à estimulação da cerúlea. Esse método é simples e confiável, fornecendo uma estrutura viável para estudar as interações exócrino-endócrinas pancreáticas e a PPDM-A. No entanto, possui limitações, como uma aplicação não validada em ratos.

Introduction

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A pancreatite aguda (PA) pode interromper a função endócrina pancreática por múltiplas vias, como lesão parênquimata pancreática e cascatas inflamatórias, induzindo assim a pancreatite aguda diabetes mellitus (PPDM-A)1,2. Atualmente, a patogênese central da PPDM-A permanece incerta, e a comunicação bidirecional anormal entre os compartimentos endócrino e exócrino do pâncreas é um foco chavede pesquisa 3. Embora linhagens celulares β imortalizadas existentes (por exemplo, INS-1, MIN6) sejam ferramentas comumente usadas para modelos celulares diabéticos in vitro, sua natureza derivada do tumor leva a diferenças significativas em relação às células primárias normais das ilhotas em termos de resposta à glicose e heterogeneidade celular. Como resultado, eles não conseguem realmente replicar o estado fisiopatológico sob o microambiente da pancreatiteaguda 4,5. Portanto, obter ilhotas primárias de alta qualidade e células acinares tornou-se a base técnica central para elucidar o mecanismo de sua interação.

Os métodos atuais para isolar ilhéus primários de camundongos baseiam-se principalmente na tecnologia de canulação de ductos, que envolve localização precisa e canulação do ducto biliar para injetar solução de colagênase no parênquima pancreático para perfusãoin vivo 6,7. No entanto, para isolar ilhéus primários de camundongos neonatais, Huang et al.8 obtiveram excelentes resultados usando digestão in vitro sem perfusão pancreática in vivo. Com base na experiência prática de nossa equipe de pesquisa, realizar a perfusão pancreática ideal por meio da canulação dos ductos biliares é um desafio de ser realizada rápida e eficazmente sem treinamento especializado. Inspirados pelo método de isolar ilhéus primários de camundongos neonatais, nossa equipe modificou o protocolo de extração para torná-lo mais simples e acessível para pesquisadores sem experiência em perfusão. Essa abordagem modificada também oferece uma alternativa mais simples para isolar ilhéus primários de camundongos jovens ou daqueles com ductos biliares delicados. Além disso, esse método oferece vantagens tanto na eficiência de isolamento (quantidade) quanto na pureza (qualidade) das ilhotas e células acinares. Ele permite que pesquisadores conduzam experimentos dentro do mesmo contexto patológico e fisiológico, facilitando uma análise aprofundada do mecanismo de interação entre ilhotas e células acinares.

O método exige controle rigoroso do tempo de digestão pancreática; Picar o pâncreas antes da digestão também é uma etapa crucial. Além disso, deve se prestar atenção à intensidade da dispersão mecânica do tecido pancreático após a digestão. Esses fatores afetam a quantidade e a qualidade das ilhotas isoladas e células acinares. Esse método não foi validado em ratos e não pode ser ampliado para produção no momento.

Protocol

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Procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética ou pelo Comitê de Ética do Centro de Animais de Laboratório do Hospital Changhai (Aprovação nº: CHEC (A.E)-2025-026). Camundongos grau SPF C57BL/6J (6-8 semanas, pesando 18-25 g, machos ou fêmeas, n = 3) foram mantidos em um ciclo de 12 horas claro/escuro com livre acesso a comida (dieta de manutenção) e água.

Resíduos cortantes, como seringas e agulhas, devem ser coletados nos recipientes dedicados ao laboratório e descartados por órgãos profissionais qualificados. De acordo com as Diretrizes para Conduta Ética no Cuidado e Uso de Animais Não Humanos em Pesquisa, carcaças de camundongos devem ser colocadas no congelador dedicado do laboratório e incineradas por órgãos profissionais.

1. Preparação de reagentes

NOTA: Soluções como meio de gradiente de densidade estéril devem ser coletadas no "Tambor de Coleta de Resíduos Químicos" do laboratório. Todos os resíduos químicos devem ser descartados por agências profissionais qualificadas, conforme organizado pelo laboratório.

  1. Preparação da solução de colagenase P
    1. Em um tubo centrífugo de 50 mL, pesa sequencialmente 25 mg de colagênase P, 42 mg de cloreto de cálcio anidro e 0,02 g de inibidor de tripsina. Adicione 45,5 mL da Solução Salada Balanceada de Hank e 500 μL de solução HEPES, depois faça um vórtice até dissolver completamente. Esterilize a solução por filtração através de um filtro de 0,22 μm e transfira a solução filtrada para um novo tubo estéril de centrífuga de 50 mL. Isso gera uma solução de P de colagenase de 0,5 mg/mL, que é usada para a digestão subsequente do tecido pancreático.
  2. Tratamento da solução de gradiente de densidade estéril
    1. Filtre a solução do gradiente de densidade estéril por um filtro de 0,22 μm para esterilização, depois transfira-a para um novo tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Rotule claramente as informações da solução e armazene-as a 4 °C para uso posterior. Doravante, é referido como "Ficoll".
  3. Preparação do buffer de parada e do meio completo
    1. Adicione 10% de soro fetal bovino (FBS) e solução de 1% de penicilina-estreptomicina ao meio DMEM em branco e ao meio RPMI-1640, respectivamente, para preparar o meio completo DMEM e o meio completo RPMI-1640 (também o buffer de parada para a digestão pancreática). Rotule claramente as informações da solução e armazene a 4 °C para uso posterior.
  4. Preparação de soluções de glicose com diferentes concentrações
    1. Em um tubo de centrífuga de 50 mL, adicione 50 mL de tampão de bicarbonato Krebs-Ringer HEPES (KRBH) e 0,25 g de Albumina Sérica Bovina (BSA)-V para preparar uma solução de KRBH contendo 0,5% de BSA. Em seguida, em 28,33 mL da solução de KRBH contendo 0,5% de BSA, adicione 168 μL de glicose (1 M) e 1,5 mL de solução de cloreto de cálcio (50 mM) para preparar uma solução de glicose de 5,6 mM. Em 9,28 mL da solução de KRBH contendo 0,5% de BSA, adicione 220 μL de glicose (1 M) e 500 μL de solução de cloreto de cálcio (50 mM) para preparar uma solução de glicose de 22 mM.

2. Isolamento de ilhéus pancreáticos e células acinares pancreáticas (PACs)

NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos devem passar por esterilização por autoclave.

  1. Adicione a Solução Equilibrada de Sal do Hank e a solução de colagenase P à placa de 12 poços. E adicione 3 mL de solução de colagenase P em um tubo centrífugo de 50 mL para a digestão subsequente.
    NOTA: Adicione 2 mL de Solução Balanceada de Sal Hank's em três poços e 2 mL de solução de colagenase P em um poço.
  2. Pese e anestesie o camundongo com injeção intraperitoneal de 1,25% de tribromoetanol em dose de 0,025 mL/g antes da cirurgia, verifique o status anestésico beliscando a almofada do rato: a profundidade da anestesia é determinada por uma diminuição gradual da frequência respiratória e sem resposta ao beliscão das almofadas. Uma vez confirmada a anestesia profunda, eutanasie os camundongos por luxação cervical. Imerga os camundongos em etanol a 75% por 5 minutos para desinfecção, depois transfira-os para um gabinete de biossegurança para isolamento pancreático.
    NOTA: O tribromoetanol (1,25%) é fornecido como solução pré-preparada na compra; Não é necessário preparar manualmente. Os pesquisadores devem usar luvas e máscaras durante todo o experimento. Se houver contato com a pele durante a injeção de tribromoetanol a 1,25%, limpe imediatamente o reagente residual com etanol anidro, enxágue com água corrente por 5 minutos e aplique hidratante para aliviar o ressecamento. Nenhum produto químico corrosivo está envolvido neste estudo. Reagentes químicos de resíduo, como 1,25% de tribromoetanol, devem ser coletados em recipientes selados dedicados rotulados como "Resíduos Químicos Perigosos".
  3. Faça uma incisão abdominal em formato de "V" para abrir a cavidade abdominal do camundongo. O órgão linfoide vermelho-escuro na região hipocondríaca esquerda é o baço, e o órgão branco ligado ao baço é o pâncreas. Realize cuidadosamente uma dissecação contundente do pâncreas ao longo da borda inferior do estômago e da junção pancreaticoduodenal.
  4. Lave o tecido pancreático isolado na Solução Salada Equilibrada de Hank e remova as fixações mesentéricas residuais, o baço e o tecido adiposo peripancreático.
  5. Mova o pâncreas pré-processado para uma placa de 12 poços contendo 2 mL de solução de colagenase P. Segure o pâncreas no lugar com uma pinça usando a mão esquerda e utilize uma seringa de 1 mL com a mão direita para injetar solução de colagenase P no parênquima pancreático até que o tecido pancreático pareça translúcido e edematoso.
    NOTA: O volume da solução de P de colanase para perfusão é de 600-800 μL.
  6. Corte o pâncreas rapidamente em pedaços de tecido de 1-2 mm³ com tesoura cirúrgica.
    NOTA: O tamanho das peças de tecido é aproximadamente igual ao diâmetro interno de uma ponta padrão de pipeta de 200 μL.
  7. Corte a ponta distal de 1 a 1,5 cm de uma ponta de pipeta de 1 mL (para aumentar a abertura) e use essa ponta modificada para transferir os pedaços do tecido pancreático junto com 2 mL de solução de colagenase P para um tubo centrífugo de 50 mL pré-carregado com 3 mL de solução de colagnase P.
  8. Incube o tubo da centrífuga em banho-maria a 37 °C por 12 minutos, agitando suavemente o tubo a cada 5-6 minutos durante esse período.
    NOTA: O objetivo de agitar o tubo da centrífuga é garantir o contato total entre o tecido pancreático e a solução de colagenase P.
  9. Adicione 10 mL de meio completo RPMI-1640 para encerrar o efeito digestivo da solução de colagenase P.
  10. Pipete o pellet repetidamente com uma pipeta Pasteur de 5 mL (15-20 movimentos de subida e descida) até que não restem grandes aglomerados de tecido evidentes.
  11. Adicione 10 mL de meio completo RPMI-1640, depois centrifuge a 180 × g por 2 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  12. Resuspenda o projétil com 20 mL de médio completo RPMI-1640. Filtre a suspensão por um peneirado de 40 malhas, depois centrifuge a 180 × g por 2 minutos a 4 °C.
  13. Descarte o sobrenadante delicadamente, adicione 20 mL de solução Ficoll para resuspender o comprimido e adicione lentamente 15 mL de meio completo RPMI-1640.
    NOTA: Neste ponto, pode-se observar uma interface líquida clara.
  14. Centrifuge suavemente a 640 × g por 20 minutos a 25 °C.
    NOTA: Evite tremores violentos durante a centrifugação para evitar interrupções na interface.
  15. Remova cuidadosamente o tubo da centrífuga e aspire a camada superior de médio vermelho usando uma pipeta Pasteur de 5 mL. Depois, aspire cuidadosamente o líquido contendo os ilhéus na interface da camada líquida e transfira-o para um novo tubo centrífugo de 50 mL. Adicione 20 mL de meio completo RPMI-1640, centrifuge a 180 × g por 2 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  16. Resuspenda o projétil com 20 mL de meio completo RPMI-1640, centrifuge a 180 × g por 2 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  17. Ressuspenda o pellet com 10 mL de meio completo RPMI-1640 e transfira-o para uma placa de cultura celular de 60 mm.
  18. Sob um microscópio biológico invertido (ampliação 100x), escolha manualmente ilhéus usando uma pipeta de 20 μL. Transfira as ilhotas selecionadas para uma placa de cultura celular de 24 poços pré-carregada com 500 μL de meio completo RPMI-1640 por poço.
  19. Descarte a camada de solução de Ficoll, ressuspenda o pellet (a partir da etapa 2.15) com 10 mL de meio completo DMEM, filtre por um filtro de célula de 100 μm, centrifuge a 180 × g por 2 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  20. Ressuspenda o pellet com 10 mL de meio completo DMEM, centrifuge a 180 × g por 2 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet com 5 mL de meio completo DMEM para experimentos subsequentes.

3. Detecção de viabilidade de ilhéus pancreáticos e células acinares

  1. Transfira as ilhotas isoladas e um número apropriado de células acinares para placas de cultura celular de 12 poços/24 poços contendo 1 mL de meio completo RPMI-1640 e 1 mL de meio completo DMEM, respectivamente. Coloque as placas em uma incubadora de células de CO₂ a 37 °C e 5% por 15 minutos para equilibrar.
  2. Centrifuge as placas de cultura celular de 12 poços/24 poços a 180 × g por 30 s a 25 °C. Enquanto isso, prepare o reagente de coloração de acordo com as instruções do Kit de Viabilidade e Citotoxicidade de Células de Calceína/Prodídio de Iodeto (Calceína/PI) (proteja da luz durante a preparação).
  3. Descarte cuidadosamente o meio, lave as ilhotas e células acinares uma vez com soro tampão fosfatado (PBS), depois centrifuge sob as mesmas condições da etapa 3.2.
  4. Descarte o PBS e ressuspenda as ilhotas e células acinares com o reagente de coloração preparado. Envolva a placa de cultura com papel alumínio (para proteger da luz) e incube em uma incubadora de células de CO₂ a 37 °C e 5% por 30 minutos.
  5. Em um ambiente protegido pela luz, capture imagens usando um microscópio de fluorescência (ampliação de 100x) e realize análise de viabilidade celular via ImageJ.

4. Ensaio de amilase acinar

  1. Semeie as células acinares em uma placa de 12 poços com densidade de 1,5 × 106 células/poço com 1 mL de meio. Configure as células controle (Ctrl) e estimuladas com cerúleo (10 nM, 20 nM, 50 nM; rotuladas como C10, C20, C50). Após 30 minutos de estimulação, colete supernadantes para detectar a atividade da amilase conforme as instruções do fabricante.

5. Ensaio de liberação de insulina estimulada por glicose

  1. Seme 10 ilhotas por poço em uma placa de 24 poços. Estabilize as ilhotas em meio RPMI-1640 completo por 2 horas, depois descarte o meio.
  2. Incube as ilhotas em 1 mL de solução de glicose de 5,6 mM por 1 hora. Colete o sobrenadante depois.
  3. Lave os ilhotes com o buffer KRBH. Em seguida, incube as ilhotas em solução de glicose de 22 mM por 1 hora e colete novamente o sobrenadante.
  4. Detecte as concentrações de insulina nos dois supernadantes (das condições de baixa glicose e alta glicose) usando um Kit ELISA de Insulina (INS de Rato). Calcule o Índice de Insulina Estimulada pela Glicose (GSI):
    GSI = Concentração de insulina em meio com alta glicose / Concentração de insulina em meio com baixa glicose

Results

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Após a centrifugação por gradiente de densidade de solução de Ficoll, ilhéus foram observados próximos à interface entre a camada líquida transparente e incolor e o meio, com PACs presentes como sedimento no fundo do tubo (Figura 1).

Sob um microscópio óptico, ilhéus eram tipicamente arredondados ou ovais e de cor marrom-dourada, com rendimento estável de (120 ± 5) ilhéus por camundongo (Figuras 2A,B). Os PACs recém-isolados eram esféricos e distribuídos principalmente em clusters (3-8 células acinar por cluster). As extremidades apicais das células acinares eram de cor mais escura, com grânulos de zimógeno claramente visíveis; Nenhum grânulo ou estrutura vesicular foi observado ao redor das células, e o fundo da solução era claro. O rendimento das células acinares variou de 1,6 a 1,95 × 10⁷ células por camundongo [(1,77 × 107) ± (1,75 × 106)] (Figura 2C,D).

Os resultados da coloração por Calceína/PI de ilhéus e células acinares são mostrados na Figura 3A: Células coloridas com Calceína (verde) representavam a maioria, enquanto células coloridas por PI (vermelho) eram raras. A análise quantitativa das imagens de coloração viva/morta foi realizada usando o ImageJ. Os resultados mostraram que as taxas de viabilidade dos ilhéus isolados e das células acinares foram (97,52 ± 0,16)% e (96,55 ± 0,95)%, respectivamente (Figura 3B).

A atividade basal amilase das células acinares pancreáticas isoladas foi de (0,79 ± 0,01) U/mL. Após estimulação com ceruleína em concentrações de 10 nM, 20 nM e 50 nM, as atividades amilases das células acinares foram (1,45 ± 0,03) U/mL, (1,65 ± 0,05) U/mL e (1,39 ± 0,02) U/mL, respectivamente. Resultados unidirecionais da ANOVA indicaram que, em comparação com o grupo controle (Ctrl), todos os grupos estimulados com ceruleína apresentaram diferenças significativas na atividade da amilase (todos os P < 0,001). Além disso, uma diferença significativa na atividade da amilase foi observada entre os grupos de 20 nM e 10 nM da ceruleína (P < 0,001) (Figura 4A).

Quando estimulada com solução de glicose de 5,6 mM, a secreção de insulina dos ilhéus isolados foi (0,27 ± 0,04) ng/mL/ilhéu/h. Quando estimulada com solução de glicose de 22 mM, a secreção de insulina das ilhotas isoladas foi (0,94 ± 0,04) ng/mL/ilhéu/h, com um GSI de 3,44. Os resultados indicam que as ilhotas isoladas exibem uma resposta típica e eficaz à secreção de insulina sob estimulação com soluções de glicose de diferentes concentrações (Figura 4B).

Membros da nossa equipe de pesquisa observaram que a quantidade e qualidade de ilhotas isoladas e células acinares estão intimamente relacionadas ao tempo de digestão, que requer controle rigoroso durante a operação e é menos afetado por diferentes operadores. Enquanto isso, as flutuações no rendimento e viabilidade também estão intimamente relacionadas à dissecação completa do pâncreas e à separação mecânica do tecido pancreático, que requer atenção durante a operação.

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Figura 1: Resultados da centrifugação por gradiente de densidade de solução de Ficoll. A camada de ilhotas está localizada na interface entre a camada de líquido transparente e incolor e o meio de cultura. O precipitado na parte inferior do tubo da centrífuga são os PACs. Abreviação: PACs: células acinares pancreáticas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Características morfológicas e quantitativas de ilhotas e PACs. (A) Morfologia de ilhéus isolados do tecido pancreático de camundongo. Barra de escala = 100 μm. (B) Análise quantitativa do número de ilhéus isolados do tecido pancreático de camundongo (n = 3). (C) Morfologia dos PACs isolados do tecido pancreático de camundongo. Barra de escala = 100 μm. (D) Análise quantitativa do número de PACs isolados do tecido pancreático de camundongo (n = 3). Todos os dados foram expressos como média ± SD. Abreviação: PACs: células acinares pancreáticas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Avaliação de viabilidade de ilhotas e PACs. (A) Coloração por fluorescência de iodeto de calceína/propidium para avaliar a viabilidade de ilhotas e PACs de camundongos. Verde: células vivas. Vermelho: células mortas. Barra de escala = 100 μm. (B) Análise quantitativa da viabilidade de ilhotas e PACs (n = 3). Todos os dados foram expressos como média ± DS. Abreviações: PACs: células acinares pancreáticas; PI = iodeto de propidium. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Avaliação da atividade amilase dos PACs e da capacidade de secreção de insulina dos ilhéus. (A) Atividade amilase dos PACs sob estimulação com diferentes concentrações de ceruleína (Ctrl: Grupo controle; C10, C20 e C50: As concentrações de cerúlea foram 10 nM, 20 nM e 50 nM (n = 3). (B) Análise quantitativa das concentrações de secreção de insulina estimulada pela glicose (n = 3). Todos os dados foram expressos como média ± SD. ***P < 0,001. Abreviações: GSI = Índice de insulina estimulada por glicose; PACs: células acinares pancreáticas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussion

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Nos últimos anos, o diabetes mellitus pós-pancreatite (PPDM) recebeu amplaatenção 1, 9, 10. Investigar os mecanismos moleculares pelos quais as PACs afetam a secreção do hormônio das ilhotas no contexto da AP é de grande importância.

A patogênese da AP está principalmente associada à ativação excessiva de enzimas pancreáticas nas células acinares, o que leva à autodigestão do tecidopancreático 11,12. Embora linhagens celulares como AR42J, 266-6 (linhagens celulares acinares) e MIN6, INS-1 (linhagens celulares β) estejam atualmente disponíveis, esses modelos celulares in vitro não conseguem replicar totalmente a complexidade fisiológica das células acinares primárias e ilhéus 4,5. Portanto, isolar células acinas primárias e ilhotas é crucial para estudos aprofundados sobre a interação entre os compartimentos exocrino e endócrino do pâncreas. Atualmente, métodos para isolamento de ilhotas estão bem estabelecidos; No entanto, a maioria não atende às necessidades de pesquisa para estudar a interação entre ilhéus e células acinarespancreáticas 6,7,8.

Esse protocolo experimental otimiza o procedimento de perfusão pancreática, reduzindo a barreira técnica, permitindo assim que pesquisadores sem treinamento especializado em canulação dos ductos biliares conduzam experimentos. Enquanto isso, garante a quantidade e qualidade de ilhotas isoladas e células acinares, fornecendo um método simples e rápido para o isolamento simultâneo de ilhéus primários de camundongos e células acinares pancreáticas primárias.

Embora esse método simplifique o processo de isolamento de ilhéus, etapas importantes ainda exigem controle rigoroso para garantir altos rendimentos e separação eficaz das ilhotas e das células acinares pancreáticas. Essas etapas incluem perfusão pancreática adequada, perturbação adequada dos tecidos (garantindo uma minagem completa), digestão pancreática (controle preciso do tempo de digestão e agitação manual durante a digestão) e pipetagem mecânica (controle do número e da intensidade dos movimentos de pipeta). Antes da seleção das ilhéutas, ilhéus ressuspensos devem ser estabilizados em uma incubadora celular por aproximadamente 10 minutos para facilitar a colheita das ilhotas mais eficiente.

É importante notar que durante a perfusão pancreática, melhores resultados são alcançados quando vesículas de líquido mais claras são injetadas; Todo o tecido pancreático deve estar totalmente perfuso, mas o tempo de perfusão deve ser controlado em 1-2 minutos. Se for detectada baixa viabilidade celular, ajuste o tempo de contato entre o tecido pancreático e a colagenase P (incluindo o tempo de perfusão e o tempo de digestão em banho-maria). Além disso, preste atenção aos danos mecânicos durante o isolamento — por exemplo, evite força excessiva ao dispersar tecido pancreático. A técnica asséptica deve ser mantida durante todo o isolamento das ilhotas e células acinares para evitar contaminação. Reagentes preparados devem ser filtrados por um filtro de 0,22 μm. O processo de isolamento deve ser realizado em um gabinete de biossegurança, e todos os instrumentos e consumíveis usados durante o isolamento devem ser estéreis. Os dois meios completos preparados também contêm solução de 1% de penicilina-estreptomicina.

Para anestesia de camundongo: fixe a pele do pescoço do camundongo com o polegar e o indicador esquerdos, e apoie o abdômen com o anelar e o mindinho (mantendo uma postura de cabeça para baixo e abdômen para cima para expor a cavidade abdominal). Segure a seringa com a mão direita, insira-a em um ângulo de 30° na pele do abdômen inferior esquerdo do rato (1 cm da virilha e 0,5 cm da linha média), injete o anestésico lentamente e pressione o local da injeção com um cotonete estéril por 10 segundos após a retirada da agulha para evitar vazamento do medicamento. Só eutanasie o camundongo por luxação cervical depois que ele estiver totalmente anestesiado.

Se for picado por uma agulha contaminada (exposto a sangue ou tecido de camundongo) ou mordido por um rato, esprema imediatamente a área ao redor da ferida na pia mais próxima (esprema da extremidade proximal para a distal da ferida para expulsar uma pequena quantidade de sangue), enxágue continuamente a ferida com água corrente por 15 minutos e depois desinfete com etanol 75% ou 0,5% povidona-iodo.

Os resultados dos ensaios de atividade da amilase em células acinares mostraram que as células acinares pancreáticas isoladas apresentavam baixo nível de ativação basal e eram sensíveis à estimulação da ceruleina: a atividade da amilase aumentou gradualmente com o aumento da concentração de cerúleina, atingiu o nível mais alto em 20 nM de ceruleína e diminuiu levemente quando a concentração de ceruleína era de 50 nM. Os resultados do ensaio de secreção de insulina estimulada por glicose mostraram que os ilhéus isolados apresentaram uma resposta típica e eficaz à secreção de insulina sob estimulação com soluções de glicose de diferentes concentrações. Esses resultados indicam que as células acinares e ilhotas extraídas por este protocolo são adequadas para experimentos in vitro subsequentes.

O procedimento de isolamento de ilhotas e células acinares deste protocolo experimental é fácil de operar. Resultados experimentais mostram que as ilhotas e células acinares isoladas por esse protocolo apresentam excelente quantidade e viabilidade. Além disso, vários membros da nossa equipe validaram esse protocolo usando múltiplos mouses; Os resultados da validação indicam que possui boa reprodutibilidade, dados confiáveis e flutuações mínimas no rendimento celular. No entanto, esse protocolo também possui certas limitações. Embora dependa pouco das habilidades técnicas do operador, ainda exige que ele tenha conhecimentos básicos de anatomia do camundongo para dissecar completamente o pâncreas do camundongo — isso é pré-requisito para todo o processo de isolamento. Ao isolar tecidos pancreáticos de vários camundongos simultaneamente, a quantidade de solução de colagenase P e outros reagentes deve ser ajustada de acordo. Além disso, o isolamento simultâneo de mais de dois camundongos não é recomendado: a diferença de tempo entre o processamento dos tecidos pancreáticos de diferentes camundongos durante dissecação, perfusão e trituração afetará o tempo de contato entre o tecido pancreático e a colagenase P, prejudicando assim a eficiência e viabilidade do isolamento celular. Assim, sua aplicação em larga escala pode ser limitada. Além disso, esse protocolo não foi validado em ratos. Ao isolar ilhotas e células acinares de ratos, a dosagem de alguns reagentes e o tempo de digestão podem precisar de ajustes adicionais.

Em conclusão, este protocolo experimental oferece um método simples e rápido para o isolamento simultâneo de ilhéus primários de camundongos e células acinares pancreáticas primárias. É mais adequado para pesquisadores inexperientes realizarem isolamento de ilhotas e células acinares, além de oferecer um quadro experimental prático para estudos in vitro sobre interações exócrino-endócrinas pancreáticas.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.T., H.C. e J.L. contribuíram igualmente para este trabalho. O trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (subsídios nº 82370658, 82170657, 82370655 e 82400760) e pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (subsídio nº LGF22H030014). Os autores agradecem à bioRender (www.biorender.com) pela ajuda na criação das imagens.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 & mu; Filtro MMillexSLGPR33RBFiltre a solução preparada de P de colanase
0,25 M cloreto de cálcio (Estéril)BeyotimeST365Via de sinalização dependente de cálcio para ativar a secreção de insulina
1 ml de seringaJierui10084692516405Usado para perfusão de colagenase P no tecido pancreático.
Solução de tribromoetanol 1,25%Beijing Yosida Biotechnology Co., Ltd.JT0781Anestesia
Tubo centrífugo de 1,5 mLEppendorf30121589Colete o supernadante da célula para centrifugação e armazenamento.
1x Hank' Solução salina balanceadaBiosharpBL561APrepare a solução de colagênase P e enxágue o tecido pancreático
Placa de cultura celular de 12 poçosSARSTEDT83.3921Segure o tecido pancreático e a acina extraída da cultura
Tubo centrífugo de 15 mLBeijing Labgic Technology Co., Ltd.CT-002-15ASegurando soluções durante o experimento
Placa de cultura celular de 24 poçosSARSTEDT83.3922Cultura dos ilhéus extraídos
40-mesh  PeneiraInstrumentos WeidanN/AFiltro do tecido pancreático
Pipeta Pasteur de 5 mLBiosharpBS-XG-03LPipetar líquidos e perturbar fisicamente o tecido pancreático
Tubo centrífuga de 50 mLBeijing Labgic Technology Co., Ltd.CT-002-50ASegurar as soluções durante o experimento, contendo tecidos e centrifugar
Pratos de cultura celular de 60 mmBeijing Labgic Technology Co., Ltd.12211Recipiente para armazenar meio de cultura contendo ilhotas para fácil colheita
Solução de etanol 75%HYNAUTN/ADeixe os camundongos de molho para desinfecção.
Adobe Photoshop 2023Adobe Inc.N/AGerar imagens.
Centrífuga Beckman Allegra X-12/X-12RBECKMANAllegra X-12/X-12RCentrífuga
Albumina sérica bovina (BSA)-VSolarbioA8020Mantenha a função fisiológica normal das ilhotas e use (it/this) para preparar soluções de glicose de diferentes concentrações.
Mouses C57BL/6J, grau SPF, 6– 8 semanas, pesando 18 e traço; 25 gCentro de Animais de Laboratório da Universidade Médica Naval  
Kit de Ensaio de Viabilidade e Citotoxicidade das Células de Calceína/PIBeyotimeC2015LDetectar a viabilidade celular e a citotoxicidade das células animais com base na coloração de dupla fluorescência de Calcein-AM (Calcein AM) e Propidium iodeto (PI) de células viáveis e mortas simultaneamente.
Cloreto de cálcio (anidro)Sangon Biotech10043-52-4Prepare a solução de colagenose P
Filtro celular (100 & mu; m)BiosharpBS-100-XBSFiltragem de células acinares
Colagenase PSigma11213857001Tecido pancreático digerido
Solução de D-(+)-glicose (20%, Estéril)BeyotimeST491Estimule a secreção de insulina dos ilhéus.
DMEM básico (1x) (Dulbecco' s Eagle Medium modificado)GibcoC11995500BTCultura de células acinares
Soro fetal bovino (FBS)BiowestS140B-500Prepare o meio de cultura
Solução estéril PREMIUM da Ficoll-PaqueCytiva17544203Meio do gradiente de densidade para estratificação do gradiente de densidade
GraphPad Prism 8.0.1GraphPad Software, LLCN/AGerar imagens e realizar análises estatísticas.
Solução HEPES (1 M)BiosharpBL1061APrepare a solução de colagenose P
Centrífuga de alta velocidade/refrigeradaSigma3K15Centrífuga
ImageJLaboratório de Instrumentação Óptica e Computacional dos Institutos Nacionais de Saúde (LOCI)N/AAnalise imagens de fluorescência celular e calcule a viabilidade celular.
Microscópio Biológico InvertidoLeicaN/AObserve a morfologia celular e selecione as ilhotas.
Microscópio de fluorescência invertidaOLYMPUSIX73Observe os sinais fluorescentes celulares e capture imagens fluorescentes.
Buffer de bicarbonato de Krebs-Ringer HEPESLEAGENECZ0103Mantenha a função fisiológica normal das ilhotas e use (it/this) para preparar soluções de glicose de diferentes concentrações.
Kit ELISA INS (Insulina) de MouseWuhan Fine Biotech Co., Ltd.EM0260Detecte o nível de secreção de insulina nos ilhéus.
Pinça oftalmologista (10 cm, curva com gancho)Dispositivos Médicos QingyiN/AAuxiliar na dissecação
Pinça oftalmologista (10 cm, reta com o dente)Dispositivos Médicos QingyiN/AAuxiliar na dissecação e separação repentina do tecido pancreático e na extração do tecido pancreático
Solução de estreptomicina para penicilinaGibco15140-122Prepare o meio de cultivo para evitar contaminação
RPMI-1640 médio,KeyGEN BioTECHKGL1501-500Termine a solução digestiva P da colagênase e cultive as ilhotas
Inibidor de tripsina a partir de Glycine max (soja)SigmaT6522Prepare a solução de colagenose P
Tesoura cirúrgica (10 cm, ponta reta)Dispositivos Médicos QingyiN/AAssistência na anatomia e corte do tecido pancreático em pequenos pedaços
Banho-mariaOAICLABAI-HFMantenha a temperatura de digestão.
Kit de ensaio de atividade de &alfa;-amilase e β-amilaseElabscienceE-BC-K006-MDetectar os níveis de amilase secretada pelas células acinares sob diferentes condições

References

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