Artigo de método

Detecção de alterações direcionáveis no câncer de pulmão de células não pequenas usando sequenciamento de última geração

DOI:

10.3791/69091

⸱

10 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de sequenciamento de próxima geração automatizado e credenciado pela ISO15189 para detectar alterações genômicas direcionáveis em tecidos embebidos em parafina fixados em formalina de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sucesso da terapia direcionada no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) depende da identificação precisa das alterações do driver, incluindo mutações, fusões gênicas e amplificações. O sequenciamento de próxima geração (NGS) surgiu como uma ferramenta abrangente de diagnóstico molecular, capaz de detectar aberrações genômicas conhecidas e novas, fornecendo suporte crítico para o tratamento personalizado de NSCLC. No entanto, o NGS continua sendo um método complexo e tecnicamente desafiador. Apesar de sua ampla adoção, o NGS ainda enfrenta alguns desafios, incluindo complexidade técnica e tempos de resposta prolongados. Aqui, é introduzido o fluxo de trabalho NGS com certificação ISO15189 implementado no laboratório clínico. O protocolo padronizado abrangeu avaliação da celularidade tumoral (≥20%), extração de DNA de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) (entrada de DNA ≥ 50 ng), preparação automatizada de bibliotecas e análise de bioinformática. Ao integrar medidas rigorosas de controle de qualidade (CQ) em cada etapa, o fluxo de trabalho garante alta confiabilidade dos dados. Além disso, a principal inovação no fluxo de trabalho foi a automação da construção de bibliotecas NGS. O sistema automatizado de construção da biblioteca NGS incluiu reparo final, rejeito A, ligação do adaptador, captura de hibridização e purificação, minimizando efetivamente o erro humano, aumentando a reprodutibilidade experimental, reduzindo o tempo prático e, assim, melhorando a eficiência. Juntos, a experiência demonstra que o controle de qualidade rigoroso e a preparação automatizada da biblioteca são essenciais para manter a precisão e a escalabilidade nos testes clínicos de NGS. Essa abordagem otimizada não apenas garante a conformidade com os padrões ISO15189, mas também oferece suporte à crescente demanda por oncologia de precisão no gerenciamento de NSCLC.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) é responsável por 75% a 85% de todos os casos de câncer de pulmão, representando tanto uma prioridade clínica quanto um desafio terapêutico 1,2,3. Nos últimos anos, com o desenvolvimento bem-sucedido e a aplicação clínica de drogas molecularmente direcionadas, como os inibidores da tirosina quinase do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR-TKIs), o tratamento do NSCLC avançado entrou na era das terapias de precisão personalizadas 4,5,6. A terapia direcionada oferece eficácia precisa, alta especificidade e efeitos colaterais mínimos 7,8. Essa mudança no tratamento aumentou simultaneamente a demanda por tecnologias de diagnóstico molecular.

Atualmente, testes abrangentes direcionados a tumores tornaram-se um componente indispensável da prática clínica que pode ajudar a elucidar perfis precisos de mutações genéticas e, portanto, fornecer uma base confiável para o uso subsequente de medicamentos direcionados, monitoramento de resistência a medicamentos e avaliação de prognóstico para pacientes. Particularmente, o teste multigênico baseado em NGS, aproveitando vantagens técnicas de alto rendimento e alta sensibilidade, já foi recomendado para aplicação clínica 9,10,11,12.

Em comparação com as técnicas tradicionais de diagnóstico molecular, o NGS demonstra vantagens inovadoras. A principal vantagem do NGS reside em sua capacidade de alto rendimento. Permite a detecção simultânea de múltiplos genes, incluindo alterações genéticas conhecidas e desconhecidas13,14. Enquanto isso, o NGS alcança testes abrangentes em uma única execução, reduzindo relativamente o custo, o consumo de amostras e o tempo de resposta do teste15,16. Dadas essas vantagens, o NGS tem sido cada vez mais aplicado na prática clínica. No entanto, os processos de NGS são complexos, incluindo avaliação da celularidade tumoral, extração de ácido nucleico, preparação automatizada de bibliotecas e análise de bioinformática. A qualidade do processamento inicial da amostra afeta diretamente o desempenho das análises bioinformáticas subsequentes17. Especialmente, a preparação da biblioteca envolve uma série de etapas para converter amostras de ácido nucleico bruto em bibliotecas padronizadas compatíveis com instrumentos de sequenciamento. A preparação da biblioteca inclui fragmentação, reparo final, ligadura do adaptador e amplificação por PCR18. Esse processo complexo geralmente introduz vários vieses técnicos: por exemplo, a fragmentação pode levar à sub-representação de regiões de heterocromatina; a preferência de substrato da ligase durante a ligação do adaptador pode resultar na perda de certas sequências; e a amplificação por PCR tende a causar cobertura desigual em regiões com conteúdo extremo de GC19. Esses vieses sistêmicos não apenas reduzem a qualidade dos dados de sequenciamento, mas também podem levar a conclusões errôneas em análises subsequentes de bioinformática. Portanto, estabelecer um sistema rigoroso de CQ é essencial para garantir a confiabilidade e consistência dos resultados experimentais.

Para enfrentar esses desafios técnicos de longa data, o laboratório adotou um sistema NGS totalmente automatizado. O sistema foi projetado para reduzir o tempo de processamento manual e diminuir os períodos gerais de resposta. Ele incorpora protocolos programáveis para garantir flexibilidade operacional e precisão de processamento, utilizando módulos e unidades integrados para minimizar efetivamente possíveis vieses técnicos em cada etapa. Além disso, essa solução automatizada não apenas melhora a reprodutibilidade e o rendimento da preparação da biblioteca, mas, mais importante, garante que os dados de sequenciamento reflitam com mais precisão a composição molecular das amostras originais. Aqui, o laboratório gostaria de introduzir o sistema por meio da detecção de alterações de driver usando NGS baseado em DNA.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo recebeu uma isenção do IRB para amostras de arquivo anônimas.

1. Etapas de pré-teste e controle de qualidade

  1. Registre as informações da amostra no sistema de gerenciamento de informações laboratoriais (Tabela 1). Preencha o formulário de consentimento informado para teste de mutação genética.
  2. Receba uma amostra NSCLC FFPE. Certifique-se de que a amostra usada para teste seja uma amostra de tecido de parafina armazenada por no máximo 2 anos. Certifique-se de que as amostras sejam processadas e armazenadas de acordo com métodos patológicos padrão.
    NOTA: Este estudo se concentra principalmente no fluxo de trabalho metodológico, em vez de realizar uma análise clínica em larga escala. Portanto, nenhum requisito específico de número de amostra foi definido para esta fase da pesquisa.
  3. Corte as seções usando lâminas de micrótomo descartáveis. Troque lâminas, pinças e microtubos de 1,5 ml entre as amostras para evitar contaminação cruzada e evitar a introdução de contaminantes derivados do operador (por exemplo, cabelo, células da pele, saliva).
    NOTA: Tamanho de amostra grande (≥ 0,5 cm x 0,5 cm) 6-10 μL, cinco folhas; tamanho de amostra pequeno (< 0,5 cm x 0,5 cm) e amostras de punção, 6-10 μL, 10 folhas.
  4. Realize a coloração de hematoxilina-eosina (HE) de rotina para avaliar o conteúdo das células tumorais.
  5. Selecione amostras contendo ≥20% de células tumorais malignas para análise a jusante. O conteúdo do tumor é avaliado por patologistas em lâminas de vitralHE20.
    NOTA: Se o conteúdo do tumor for inferior a 20%, sob a orientação das regiões tumorais marcadas na lâmina HE, raspe a área de tecido tumoral correspondente. Este processo alcança o enriquecimento do tecido tumoral removendo efetivamente os componentes não neoplásicos circundantes, aumentando significativamente a porcentagem de células tumorais no material coletado.
  6. Realize a extração de ácido nucleico usando um sistema de purificação automatizado, conforme descrito abaixo.
    1. Secione o bloco FFPE usando um micrótomo para obter uma fita. Coloque a fita em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Transfira a fita para o local de entrada de amostra designado no instrumento de extração automatizado.
    2. Use um instrumento de extração automática com um kit de extração automática e substitua a pipetagem manual por um sistema automático de extração de ácido nucleico de esferas magnéticas.
      NOTA: A automação desta etapa ajuda a garantir a extração automática para garantir a produção de DNA reprodutível e de alta precisão para aplicações NGS downstream.
    3. Consulte as instruções do purificador de ácido nucleico totalmente automático e do reagente de extração de ácido nucleico para extrair o ácido nucleico.
    4. Em seguida, selecione o Programa C1102, escolha o tempo de incubação da desparafinação da amostra como 16 h e o volume de eluição como 100 μL.
      NOTA: Se a solução de ADN extraída não for imediatamente testada, deve ser conservada a -20 °C durante um período não superior a 6 meses.
  7. Avalie a qualidade do ácido nucleico (Tabela 2) conforme descrito abaixo.
    1. Use eletroforese em gel de agarose para determinar o tamanho do fragmento de DNA. Use o Agilent2100 e outros sistemas de análise de eletroforese capilar microfluídica para amostras de baixa entrada.
    2. Dissolva 1 g de agarose em 100 ml de solução de TAE. Aqueça a mistura em banho-maria até ficar transparente. Arrefecer a solução a cerca de 60 °C.
    3. Conecte ao eletrodo positivo (vermelho) no instrumento de eletroforese. Execute pólo negativo (preto) para tensão 180 V, execute por 15 min21,22.
    4. De acordo com os resultados da eletroforese em gel de agarose, categorize os tamanhos dos fragmentos em quatro níveis (A-D; Tabela 3) e selecione o ácido nucleico dos níveis A-C para operações subsequentes.
    5. Use espectrofotometria para verificar a pureza. Garanta um OD260 / OD280 > 1.8; OD260/OD230 > 2.0 para indicar níveis aceitáveis de contaminantes23,24.
    6. Use o kit de detecção (Tabela de Materiais) baseado em corantes fluorescentes específicos de sequência para ensaio fluorométrico para medir com precisão a concentração de DNA.
    7. Adicione 1 μL de DNA a ser testado a 199 μL de solução de trabalho, depois misture, centrifugue brevemente e meça sua concentração usando um fluorômetro (Tabela de Materiais).

2. Preparação da biblioteca e CQ (Figura 1)

  1. Prepare o fragmento de DNA genômico usando ultrassom (Tabela de Materiais) conforme descrito abaixo.
    1. Misture 200 ng de DNA genômico em 50 μL de tampão Tris-EDTA (TE) baixo. Em seguida, manter o tubo de recolha num suporte de amostras pré-arrefecido (8 °C).
    2. Defina o parâmetro do instrumento de acordo com a Tabela 4. Em seguida, inicie a fragmentação.
    3. Use eletroforese em gel de agarose para verificar o efeito de fragmentação. Esta etapa gera fragmentos de DNA com extremidades danificadas que requerem reparo nas extremidades para transformá-los em extremidades rombas para as etapas subsequentes.
  2. Realize o reparo final e a adição de A a 3' conforme descrito abaixo.
    1. Repare as extremidades danificadas do DNA FFPE com enzimas para formar extremidades planas, garantindo 3'-OH e 5'-P. Adicione A às extremidades achatadas de 3 'de fita dupla.
    2. Prepare a mistura ERA adicionando 7 μL de tampão de reparo final e 3 μL de enzima de reparo final, mova suavemente manualmente 3x-5x e centrifugue por 1-3 s.
    3. Adicione a mistura ERA a 50 μL de amostra de DNA quebrada, misture suavemente e centrifugue por 1-3 s.
    4. Coloque-o no instrumento de PCR e selecione o programa ERA (20 °C por 30 min; 65 °C por 30 min; 4 °C Hold; Tampa 85 °C). Execute a próxima operação dentro de 2 h.
  3. Execute a ligação do adaptador conforme descrito abaixo.
    1. Prepare a mistura de LIG do sistema de reação adicionando 30 μL de tampão de ligação, 10 μL de DNA ligase e 10 μL de adaptador de DNA. Em seguida, mova levemente manualmente 3x-5x e centrifugue por 1-3 s.
    2. Adicione 50 μL de mistura de LIG ao produto de 60 μL da etapa anterior, misture delicadamente e centrifugue por 1-3 s.
    3. Colocar a mistura num instrumento PCR e, em seguida, selecionar o programa LIG (20 °C durante 15 min sem aquecer a tampa; 70 °C durante 10 min (tampa de aquecimento); 4 °C Hold; Tampa 85 °C).
  4. Realize a purificação do grânulo magnético.
    1. Pegue 1,5 mL de um tubo de centrífuga de baixa adsorção e adicione 88 μL de esferas magnéticas homogeneizadas e 110 μL de produto ligado ao adaptador. Vortex e misture bem, e incube em temperatura ambiente por 5 min.
    2. Centrifugue imediatamente a amostra incubada por 1-3 s e coloque o tubo de centrífuga em um rack magnético. Aguarde até que a solução desapareça (cerca de 3-5 min).
    3. Com o tubo preso ao ímã, abra a tampa e aspire cuidadosamente o sobrenadante limpo usando uma pipeta sem perturbar o grânulo do grânulo.
    4. Mantenha o tubo no ímã e adicione 300 μL de etanol a 75% recém-preparado a cada tubo.
    5. Aguarde 1 minuto para permitir que as esferas magnéticas assentem completamente. Gire lentamente o tubo da centrífuga horizontalmente uma vez para absorver o etanol.
    6. Repita as etapas 2.4.4 e 2.4.5 uma vez, para um total de 2x.
    7. Realize a centrifugação instantânea por 1-3 s, retorne o tubo ao rack magnético e aguarde 30 s. Use uma pipeta para remover qualquer etanol residual e mantenha a tampa do tubo aberta.
    8. Seque as esferas magnéticas em temperatura ambiente por 2 minutos até que a superfície da conta pareça fosca e não apresente rachaduras.
    9. Eluir o produto de ligação com 28 μL de tampão de eluição (EB).
      NOTA: As esferas magnéticas precisam ser equilibradas em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos antes do uso.
  5. Amplifique e purifique a pré-biblioteca conforme descrito abaixo.
    1. Prepare a pré-mistura do sistema de reação adicionando 10 μL de tampão PCR, 10 μL de primers PCR, 1,5 μL de mistura dNTP, 1 μL de enzima PCR. Bata suavemente manualmente 3x-5x e centrifugue por 1-3 s.
    2. Adicione 22,5 μL de pré-mistura a 27,5 μL do produto purificado da etapa anterior, misture suavemente e centrifugue por 1-3 s.
    3. Selecione o programa PRE: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 ciclos; 72 °C 2 min; 4 °C de retenção; Tampa 105 °C.
    4. Após a conclusão do programa de PCR, execute a purificação do grânulo magnético usando etanol a 75% recém-preparado. Eluir o produto com 18 μL de EB.
  6. Capture híbrido conforme descrito abaixo.
    1. Prepare o sistema de reação A adicionando 15 μL de pré-biblioteca e 4 μL de mistura de bloqueadores.
    2. Coloque em PCR e execute o programa de PCR HYB (95 °C por 5 min; 65 °C Hold; Tampa 105 °C).
    3. Prepare a mistura HYB do sistema de reação B adicionando 10 μL de tampão de hibridização, 0,5 μL de bloqueador inibidor de RNase e 1 μL de sonda. Agite suavemente 3x-5x e centrifugue por 1-3 s.
      NOTA: O nome da sonda é LCOO1 e os genes da sonda incluem EGFR, KRAS, BRAF, ALK, ETC.
    4. Quando a temperatura do instrumento de PCR cair para 65 °C, adicione 11,5 μL de mistura HYB ao sistema de reação A, misture suavemente, cubra a tampa do instrumento de PCR e continue a incubação por 16-24 h.
    5. Incubar o tampão de lavagem 2 em um tubo cônico de 15 mL com um aquecedor de metal a 65 ° C a uma dosagem de 600 μL por amostra.
    6. Recupere as esferas magnéticas SCB, inverta e misture 5x, vórtice por 10 s e equilibre em temperatura ambiente por 30 min. Vórtice por 10 s, transfira 25 μL para um tubo de centrífuga de baixa adsorção de 1,5 mL, coloque em um rack magnético por 3 min e descarte o sobrenadante.
    7. Adicione 200 μL de tampão de lavagem de grânulos aos grânulos magnéticos SCB de 25 μL, vórtice e misture por 3 s, centrifugue momentaneamente por 1-3 s, deixe repousar no rack magnético por 3 min e descarte o sobrenadante.
    8. Repita a etapa 2.6.7 2x, para um total de três vezes.
    9. Adicione 200 μL de tampão de lavagem de grânulos aos grânulos magnéticos, vórtice e misture por 3 s, ressuspenda para uso posterior.
    10. Transfira aproximadamente 30 μL da amostra híbrida para esferas magnéticas SCB ressuspensas, vortex e misture, coloque em um misturador rotativo, incube em temperatura ambiente por 30 min e centrifugue por 1-3 s.
    11. Coloque o tubo de mistura em um rack magnético por 3 min e, em seguida, aspire aproximadamente 230 μL de sobrenadante. Adicione 500 μL de tampão de lavagem 1, vórtice por 5 s, coloque em um misturador rotativo e incube em temperatura ambiente por 15 min. Centrífuga instantânea por 1-3 s.
    12. Coloque o tubo de mistura de amostra de esferas magnéticas em um rack magnético e deixe repousar por 3 min. Em seguida, aspirar cerca de 500 μL de sobrenadante e líquido residual.
    13. Pré-aqueça 150 μL de tampão de lavagem de 2 a 65 ° C, vórtice por 10 s, coloque em um misturador de temperatura constante, agite e incube a 65 ° C por 10 min a uma velocidade de 600 rpm. Realize centrifugação instantânea por 1-3 s, coloque em um rack magnético por 3 min e aspire aproximadamente 150 μL de sobrenadante e líquido residual.
    14. Repita a etapa 2.6.13 3x, para um total de quatro vezes.
    15. Centrifugue instantaneamente por 1-3 s para remover qualquer líquido residual do tubo de amostra. Adicione 20 μL de EB, misture para cima e para baixo 8x-10x, misture bem e coloque no gelo para uso posterior.
  7. Preparação e purificação da biblioteca final.
    1. Prepare a mistura POST do sistema de reação adicionando 25 μL de mistura de amplificação, 5 μL de índice e 20 μL de biblioteca de esferas magnéticas. Bata suavemente 3x-5x e centrifugue por 1-3 s. Misture delicadamente, centrifugue por 1-3 s.
    2. Escolha o programa POST: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 ciclos; 72 °C 10 min; 4 °C de retenção; Tampa 105 °C.
    3. Após a conclusão do programa de PCR, execute a purificação do grânulo magnético usando etanol a 75% recém-preparado. Eluir a biblioteca final com 20 μL de EB.

3. Preparação da biblioteca totalmente automatizada (Tabela 5)

  1. Pressione o botão Liga / Desliga para ativar o sistema e aguarde a inicialização. Navegue até Configuração do programa e selecione Executar protocolo e, em seguida, selecione Protocolo: Burning Rock HS.
  2. Defina os parâmetros de alíquota do QC como Tipo de amostra: DNA de alta qualidade; Quantidade de entrada (ng): 50; Ciclos de pré-PCR: 12; Ciclos pós-PCR: 12. Clique em EXECUTAR.
  3. Insira o cartucho de reagente pré-embalado no slot designado (valida automaticamente a colocação e o status do reagente).
  4. Depois de carregar as amostras, pressione Iniciar para que o sistema funcione de forma autônoma. Observe os indicadores LED para monitorar o progresso.
  5. Após o término do programa, clique em OK e o programa transferirá automaticamente a biblioteca final para o tubo da biblioteca, finalizando a preparação da biblioteca.

4. Sequenciamento e controle de qualidade

  1. Execute a quantificação da biblioteca e o controle de qualidade conforme descrito abaixo.
    1. Meça a concentração pré-biblioteca e total da biblioteca usando fluorometria.
    2. Detecte o tamanho do fragmento da biblioteca. Use um kit para avaliar o tamanho do fragmento da biblioteca e a presença de adaptadores (Tabela de Materiais).
      NOTA: Se a biblioteca final contiver dímeros de primer, uma etapa de purificação adicional deve ser adicionada antes de misturar as amostras na máquina. O padrão qualificado para a inserção de fragmentos é de ≥ 150 pb e a eficiência de captura esperada é de ≥ 40%.
    3. Dilua a biblioteca de sequenciamento para 1,6 pM e 1300 μL para operações de sequenciamento.
  2. Realize o monitoramento do ambiente de sequenciamento conforme descrito abaixo.
    1. Controle o ambiente de sequenciamento, incluindo temperatura interna (19-25 °C), umidade interna (20%-80%).
    2. Dados completos de saída do instrumento QC, incluindo base acima de Q30 e filtro de passagem de densidade de cluster (PF).

5. Análise de dados sequencial e CQ

  1. Execute o processamento de dados brutos e o perfil molecular conforme descrito abaixo.
    1. Use o Burrows-Wheeler Aligner (versão 0.7.10) para alinhar os dados de sequenciamento ao hg19.
    2. Execute alinhamento local, otimização, marcação de duplicação e chamada de variante usando o Genome Analysis Tool Kit (versão 3.2) e Vardict (versão 1.5.1).
    3. Filtre variantes usando o pipeline fpfilter VarScan (versão 2.4.3) e remova loci com profundidades inferiores a 50. Classifique e exclua variantes com frequência populacional superior a 0,1% nos bancos de dados ExAC, 1000 Genomes, dbSNP ou ESP6500SI-V2 como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs).
    4. Anote as variantes restantes usando o SnpEff (versão 3.6).
    5. Analise variantes estruturais (SVs), incluindo grandes rearranjos genômicos (LGRs), usando MarkSV (ferramenta de algoritmo Burning Rock). Analise as CNVs (variantes do número de cópias) com base nos dados de profundidade de cobertura dos intervalos de captura.
    6. Dados de cobertura corretos para vieses de sequenciamento resultantes do conteúdo de guanina-citosina e design da sonda.
  2. Avalie a qualidade da amostra, incluindo profundidade média, profundidade mediana, profundidade única, tamanho da inserção, complexidade da lib, cobertura, razão Q30 e taxa de correlação de amostra pareada, conforme descrito em25.
  3. Para geração de relatórios, verifique a versão e os parâmetros do pipeline para concluir a revisão de bioinformática. Use diretrizes relevantes para avaliar a patogenicidade das mutações26,27. Emitir relatório final.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizando um fluxo de trabalho de análise NGS automatizado com controles de qualidade rigorosos, o laboratório realizou um perfil genômico abrangente de amostras de NSCLC. O fluxo de trabalho de detecção otimizado (Figura 2) identificou de forma confiável várias alterações genômicas clinicamente acionáveis em amostras representativas de tumores (Figura 3).

Os resultados do sequenciamento demonstraram...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cada relatório NGS qualificado está por trás de um processo rigoroso, que permanece complexo e demorado28. Para resolver esses problemas, o laboratório desenvolveu um sistema NGS totalmente automatizado. Essa operação reduz significativamente a intervenção manual, minimiza erros experimentais e reduz substancialmente o tempo de resposta. Portanto, este sistema forneceu uma estratégia mais confiável e eficiente para o NGS, estabelecendo um novo pensamento para a qu...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado por doações da Fundação de Ciências Naturais de Pequim da República Popular da China (7252122), Fundação de Pesquisa em Oncologia Clínica Xisike de Pequim da República Popular da China (Y-HS202402-0021), Fundo de Pesquisa de Ensino de Treinamento de Residência do Hospital do Câncer, Academia Chinesa de Ciências Médicas e Faculdade de Medicina da União de Pequim (E2025004) e Financiamento Nacional de Pesquisa Clínica do Hospital de Alto Nível (2025-LYZX-R-B03).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  Agilent  Kit de DNA de Alta Sensibilidade  Agilent5067-4626Para uso com o   Sistema Bioanalisador Agilent 2100
  Kit de Reagentes Agilent DNA 1000  Agilent5067-1504Para uso com o   Sistema Bioanalisador Agilent 2100
Bioanalisador Agilent 2100AgilentG2939AAvalie o tamanho do fragmento da biblioteca e a presença de adaptadores. 
Concert Instrumento totalmente automático de purificação de ácidos nucleicosCONCERTOMC1002Usado para extração de DNA
Equalbit 1 e vezes; Kit de Ensaio HS dsDNAVazymeEQ121-02-AAPara uso com o   Fluorômetro Qubit 3.0
Kit combinado de detecção de mutações do gene EGRR/KRAS/BRAF/ALK em humanosRocha ArdenteBR-LC00102Construção da biblioteca
Magnis BRTecnologias AgilentG7595AAPreparação automatizada de bibliotecas NGS
ME220 Ultrasonicador FocadoCovaris500396Ultrassonação
NanoDrop One/OneCThermo FisherND-UM-WDetecção espectrofotométrica UV visível de comprimento de onda completo
NextSeq 550DxIllumina20005715seqüenciar
NSQ 500/550 Alta Saída KT v2.5(300CYS)Illumina20024908Para uso com o NextSeq 550Dx
Reagente de extração de ácidos nucleicosCONCERTORC1102Usado para extração de DNA
Fluorômetro Qubit 3.0VidaP33216Usado para detecção de concentração de ácidos nucleicos ou bibliotecas
Kit de Ensaio HS de Qubit dsDNAVidaQ32851Para uso com o   Fluorômetro Qubit 3.0

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, R. M., Zong, Y. N., Cao, S. M., Xu, R. H. Current cancer situation in China: Good or bad news from the 2018 global cancer statistics. Cancer Commun (Lond). 39 (1), 22(2019).
  2. Siegel, R. L., Kratzer, T. B., Giaquinto, A. N., Sung, H., Jemal, A. Cancer statistics, 2025. CA Cancer J Clin. 75 (1), 10-45 (2025).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Fukuoka, M., et al. Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 41 (6), 1162-1171 (2023).
  5. Kris, M. G., et al. Efficacy of gefitinib, an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase, in symptomatic patients with non-small cell lung cancer: A randomized trial. JAMA. 290 (16), 2149-2158 (2003).
  6. Zhou, C., et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): A multicentre, open-label, randomised, phase 3 study. Lancet Oncol. 12 (8), 735-742 (2011).
  7. Wu, K., House, L., Liu, W., Cho, W. C. Personalized targeted therapy for lung cancer. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 16 (8), C21-C34 (2013).
  8. Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogenic shock: Turning an activated kinase against the tumor cell. Cell Cycle. 5 (24), 2878-2880 (2006).
  9. Kumar, S. S., et al. High early growth response 1 (EGR1) expression correlates with resistance to anti-EGFR treatment in vitro and with poorer outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. Clin Transl Oncol. 19 (6), 718-726 (2017).
  10. Li, D., et al. Status of 10 targeted genes of non-small cell lung cancer in Eastern China: A study of 884 patients based on NGS in a single institution. Thorac Cancer. 11 (9), 2580-2589 (2020).
  11. Wen, S., et al. Genomic signature of driver genes identified by target next-generation sequencing in Chinese non-small cell lung cancer. Oncologist. 24 (11), e1070-e1081 (2019).
  12. Tan, N., Li, Y., Ying, J., Chen, W. Histological transformation in lung adenocarcinoma: Insights of mechanisms and therapeutic windows. J Transl Int Med. 12 (5), 452-465 (2024).
  13. Coco, S., et al. Next generation sequencing in non-small cell lung cancer: New avenues toward personalized medicine. Curr Drug Targets. 16 (1), 47-59 (2015).
  14. Yang, X., et al. The molecular and cellular choreography of early mammalian lung development. Med Rev. 4 (3), 192-206 (2024).
  15. Wang, R., Wang, G., Zhang, N., Li, X., Liu, Y. Clinical evaluation and cost-effectiveness analysis of serum tumor markers in lung cancer. Biomed Res Int. 2013, 195692(2013).
  16. McGinn, S., Gut, I. G. DNA sequencing-spanning the generations. Nat Biotechnol. 30 (4), 366-372 (2013).
  17. Larson, N. B., Oberg, A. L., Adjei, A. A., Wang, L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 18 (2), 143-157 (2023).
  18. McCombie, W. R., McPherson, J. D., Mardis, E. R. Next-generation sequencing technologies. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (11), a036798(2019).
  19. Van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: Tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
  20. Rao, W., et al. Potential unreliability of ALK variant allele frequency in the efficacy prediction of targeted therapy in NSCLC. Front Med. 17 (3), 493-502 (2023).
  21. Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 529, 35-45 (2013).
  22. Holmes, D. L., Stellwagen, N. C. Electrophoresis of DNA in oriented agarose gels. J Biomol Struct Dyn. 7 (2), 311-327 (1989).
  23. Liu, D., et al. Quality control of next-generation sequencing-based in vitro diagnostic test for onco-relevant mutations using multiplex reference materials in plasma. J Cancer. 9 (9), 1680-1688 (2018).
  24. Zhang, C., et al. An improved NGS library construction approach using DNA isolated from human cancer formalin-fixed paraffin-embedded samples. Anat Rec (Hoboken). 302 (6), 941-946 (2019).
  25. Wood, D. E. National comprehensive cancer network (NCCN) clinical practice guidelines for lung cancer screening. Thorac Surg Clin. 25 (2), 185-197 (2015).
  26. Chinese Society of Pathology Quality Control, Chinese Medical Association Chinese Society of Oncology, China Anti-Cancer Association Chinese Society of Lung Cancer, Chinese Thoracic Oncology Group. Guidelines on clinical practice of molecular tests in non-small cell lung cancer in China. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 50 (4), 323-332 (2021).
  27. Rao, W., et al. Developing an effective quality evaluation strategy of next-generation sequencing for accurate detecting non-small cell lung cancer samples with variable characteristics: A real-world clinical practice. J Cancer Res Clin Oncol. 149 (8), 4889-4897 (2023).
  28. Hutchins, R. J., et al. Practical guidance to implementing quality management systems in public health laboratories performing next-generation sequencing: Personnel, equipment, and process management (Phase 1). J Clin Microbiol. 57 (8), e00261-e00319 (2019).
  29. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), e0178706(2017).
  30. Larguinho, M., et al. Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta. 81 (3), 881-886 (2010).
  31. Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: Promises and challenges. Cancer Lett. 340 (2), 284-295 (2013).
  32. Senst, A., Bonsiepe, H., Kron, S., Schulz, I. Application of the Agilent 2100 bioanalyzer instrument as quality control for next-generation sequencing. J Forensic Sci. 69 (6), 2192-2196 (2024).
  33. Li, W., Qiu, T., Ling, Y., Gao, S., Ying, J. Subjecting appropriate lung adenocarcinoma samples to next-generation sequencing-based molecular testing: Challenges and possible solutions. Mol Oncol. 12 (5), 677-689 (2018).
  34. Li, W., et al. Potential unreliability of uncommon ALK, ROS1, and RET genomic breakpoints in predicting the efficacy of targeted therapy in NSCLC. J Thorac Oncol. 16 (3), 404-418 (2021).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Terapia AlvoAltera es Gen micasExtra o de DNAPrepara o Automatizada de BibliotecasAvalia o de Celularidade TumoralFixado em Formalina e Embebido em ParafinaAn lise Bioinform ticaOncologia de Precis o

Artigos relacionados