Method Article

Sistema integrado de detecção molecular baseado em PCR para a detecção simultânea de quatro parasitas intestinais zoonóticos de várias fontes

DOI:

10.3791/69180

⸱

October 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar quatro parasitas intestinais zoonóticos de múltiplas fontes simultaneamente com base em uma combinação de sistema de detecção molecular integrado baseado em reação em cadeia da polimerase (PCR).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As doenças infecciosas são fatores críticos que afetam a saúde humana, o desenvolvimento econômico e a estabilidade social. Entre elas, as doenças parasitárias intestinais zoonóticas têm se tornado cada vez mais um foco de preocupação global como doenças infecciosas emergentes e reemergentes, particularmente Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis e Giardia. Apenas alguns estudos foram publicados sobre a epidemiologia dos parasitas acima, acompanhados por questões como alvos de detecção únicos, baixas taxas de detecção e altas taxas de detecção perdida. Este estudo tem como objetivo estabelecer um sistema integrado de detecção molecular baseado em uma combinação de testes de PCR para detecção simultânea dos quatro parasitas intestinais zoonóticos acima em amostras coletadas de camundongos selvagens, animais de companhia e gado (bovinos e ovinos), a fim de fornecer um suporte técnico eficiente para a detecção rotineira de parasitas em múltiplos cenários, incluindo interfaces animal-ambiente, especialmente em instalações de vigilância locais.

Neste estudo, tomando como teste primário a detecção de Enterocytozoon bieneusi em fezes de 95 camundongos selvagens e 30 gatos e cães (25 de gatos e 5 de cães), quando dois conjuntos de primers foram usados para amplificar o gene ITS, os resultados positivos de cada PCR foram exatamente os mesmos (5,26%), mas a combinação de 2 conjuntos de testes de reação em cadeia da polimerase (PCR) resultou em maior taxa de positividade (6,32%) para Enterocytozoon bieneusi. Para Giardia, 9 amostras positivas foram detectadas usando o gene beta-giardina (BG), enquanto nenhum positivo foi detectado usando os genes glutamato desidrogenase (GDH) e triose fosfato isomerase (TPI). Os resultados acima demonstraram que uma combinação de testes de PCR para vários segmentos genéticos alvo aumentou a capacidade de detecção de patógenos designados, em comparação com qualquer teste de PCR único. As sequências de alvos foram confirmadas pelo sequenciamento de Sanger. Este sistema foi projetado para melhorar e facilitar a vigilância do status de infecção, distribuição e evolução filogenética de parasitas intestinais zoonóticos de múltiplas fontes, fornecendo uma base para avisos precisos e sensíveis em um estágio inicial. O objetivo é construir uma ponte técnica para alcançar a meta One Health nas interfaces homem-animal-ambiente.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis e Giardia são patógenos protozoários comuns e facilmente negligenciados com prevalência global. Nos últimos anos, devido a fatores como recuperação e intrusão nos nichos ecológicos de focos naturais, a popularidade da criação de animais de companhia e o desenvolvimento da criação de gado e aves, a prevalência de doenças parasitárias intestinais zoonóticas de múltiplas fontes em roedores, animais de companhia (cães e gatos) e gado (bovinos e ovinos) tornou-se cada vez mais um foco de emergentes, surto e doenças infecciosas reemergentes em áreas domésticas e rurais, colocando seriamente em risco a saúde humana e a segurança da saúde pública global 1,2,3,4.

Esses parasitas têm espécies intragenéricas complexas e extensa adaptabilidade do hospedeiro. Eles podem infectar não apenas roedores, animais de companhia, ruminantes de gado, aves e pássaros, mas também espécies zoonóticas, que podem infectar humanos, causando sintomas clínicos como dor abdominal, diarreia e vômitos. Eles são particularmente suscetíveis entre crianças, idosos, mulheres grávidas e populações imunocomprometidas, e podem ser transmitidos pela água, alimentos e ar, apresentando riscos zoonóticos significativos à saúde pública 3,5,6.

Atualmente, a identificação dos quatro parasitas acima depende principalmente da morfologia, que é propensa a erros de identificação devido a semelhanças morfológicas dentro dos gêneros e fatores subjetivos, particularmente na distinção entre espécies e genótipos. Técnicas de biologia molecular têm sido amplamente utilizadas para identificar espécies, gêneros e genótipos desses parasitos. Para Blastocystis e Cryptosporidium, a detecção se concentra principalmente no gene 3,7,8 do ácido ribonucléico ribossômico da pequena subunidade (SSU rRNA); para Enterocytozoon bieneusi, o geneespaçador interno transcrito (ITS) 4,9; e para Giardia, os genes beta-giardina (BG), glutamato desidrogenase (GDH) e triose fosfato isomerase (TPI)10,11. Embora a reação em cadeia da polimerase convencional aninhada (PCR) tenha melhorado muito as capacidades de identificação e tipagem desses quatro parasitas, ela é insuficiente na detecção de casos perdidos e na identificação de novas espécies ou quase-espécies com características genéticas significativas. Isso geralmente afeta a eficiência da investigação epidemiológica, transmissão e controle de doenças em humanos, animais e outros hospedeiros, apresentando grandes desafios para a segurança da saúde pública em humanos, animais e meio ambiente.

Devido às semelhanças nos sintomas, rotas de transmissão e gama de hospedeiros desses quatro parasitas, ainda não existe nenhum sistema molecular integrado para detecção eficiente, evitando a detecção perdida e identificando com precisão novas espécies ou quase-espécies com diferenças genéticas significativas. Este estudo estabeleceu um sistema de detecção molecular integrado maduro baseado na tecnologia de sequenciamento de alto rendimento por PCR, revisando a literatura, para a detecção simultânea dos quatro parasitas intestinais zoonóticos em amostras de múltiplas fontes (camundongos selvagens, animais de companhia, bovinos e ovinos). Combinado com a análise de bioinformática, este sistema foi aplicado para identificar parasitas intestinais zoonóticos de múltiplas fontes, monitorar fatores epidemiológicos como distribuição de infecções e evolução filogenética e alerta precoce de infecções humanas e animais e contaminação ambiental.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estudo foi aprovado e conduzido pelo comitê de ética animal do Centro Provincial de Controle e Prevenção de Doenças de Jiangsu. Este estudo foi conduzido de acordo com a edição de 2020 das Diretrizes da Associação Médica Veterinária Americana sobre Eutanásia Animal, os princípios orientadores dos Regulamentos sobre a Administração de Animais Experimentais (Ordem nº 2 da Comissão Estadual de Ciência e Tecnologia da República Popular da China, 1988) e os Princípios Orientadores para o Tratamento Humanitário de Animais emitidos pelo Ministério da Ciência e Tecnologia da República Popular da China.

1. Preparação de fezes frescas de ratos selvagens, animais de companhia e gado (bovinos e ovinos)

  1. Anestesiar camundongos por inalação de dióxido de carbono de uma fonte de dióxido de carbono comprimido enlatado em uma caixa plástica hermética transparente, com uma taxa de substituição de 30% a 70% do volume do recipiente por minuto. Após anestesia completa e coma, realize a luxação cervical nos camundongos.
  2. Coleta de amostras fecais frescas: Colete amostras fecais de cães, gatos, bovinos e ovinos dentro de 1 h após a defecação, com um tubo por fezes do animal, e evite a contaminação cruzada.
    1. Capture roedores usando gaiolas de isca com dispositivos de liberação em diferentes habitats selvagens. Coloque os ratos capturados em sacos de ratos e transporte-os imediatamente para o laboratório. Sob operação estéril em um gabinete de biossegurança, disseque os camundongos para coletar o reto contendo fezes, coloque-o em um criotubo de 2 mL e armazene-o a -80 ° C para detecção posterior.
    2. Selecione cães e gatos de lojas de animais em diferentes regiões como objetos de pesquisa. Colete as fezes recém-excretadas imediatamente, em criotubos de 5 mL, rotulados com informações completas da amostra, e transporte-as imediatamente para o laboratório para armazenamento a -80 °C.
    3. Selecionar bovinos e ovinos de fazendas pecuárias (intensivas ou caipiras) como objetos de pesquisa. Colete as fezes recém-excretadas imediatamente em criotubos de 50 mL, rotulados com informações completas da amostra, e transporte-as imediatamente para o laboratório para armazenamento a -80 °C.

2. Extração de DNA total de fezes frescas de camundongos selvagens, animais de companhia e gado (bovinos e ovinos)

  1. Pré-tratamento fecal:
    NOTA: QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit foi usado.
    1. Sob operação estéril em um gabinete de biossegurança, adicione aproximadamente 200 mg de fezes de diferentes fontes no tampão salino tampão tampolado com fosfato (PBS), adicione esferas de aço e homogeneize completamente usando um moedor de tecido.
    2. Aqueça a 70 °C por 5 min e centrifugue a 10.000 × g por 10 min em temperatura ambiente (15-25 °C).
    3. Adicione 600 μL de sobrenadante a um tubo de centrífuga de 2 mL contendo 25 μL de proteinase K, adicione 600 μL de tampão AL e vórtice por 15 s.
    4. Incubar a 70 °C durante 10 min. Adicione 600 μL de etanol 100% anidro ao lisado e ao vórtice para misturar.
  2. Adicione cuidadosamente 600 μL do lisado a uma coluna de centrifugação, centrifugue a 14000 × g por 1 min e coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de coleta de 2 mL. Repita esta etapa mais uma vez.
  3. Abra cuidadosamente a coluna de centrifugação, adicione 500 μL de tampão AW1, centrifugue na velocidade máxima por 1 min e coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de coleta de 2 mL. Abra cuidadosamente a coluna de centrifugação, adicione 500 μL de tampão AW2 e centrifugue na velocidade máxima por 3 min.
  4. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de coleta de 2 mL (preparado separadamente) e centrifugue a 14000 × g por 3 min. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de centrífuga rotulado de 1,5 mL e adicione 100 μL de tampão de eluição diretamente à membrana da coluna de centrifugação.
  5. Incubar à temperatura ambiente (15-25 °C) durante 1 min e centrifugar a 14000 × g durante 1 min para eluir o ADN.
  6. Determine a concentração e a pureza do DNA usando um espectrofotômetro ultramicro. Utilizar o ADN extraído para detecção subsequente ou armazená-lo a -20 °C para preservação a longo prazo.
    NOTA: A proporção A260/A280 deve ser de 1,8-2,0 para garantir a integridade e pureza do DNA extraído.

3. Detecção de PCR convencional aninhada de Cryptosporidium e Blastocystis visando RNA ribossômico de pequena subunidade (SSU rRNA)

NOTA: Dream Taq Green PCR Mix foi usado para esta etapa.

  1. Prepare o sistema de reação de PCR no gelo usando PCR Mix: 25 μL de tampão 2× Taq, 2 μL de cada um dos primers direto e reverso, 16 μL de ddH2O e 5 μL de molde, com um volume total de 50 μL.
  2. Para Cryptosporidium, siga as etapas 3.2.1-3.2.2.
    1. Use F1R11 e F-1R1-1 8,11 como primers de reação da primeira rodada. Defina o programa de reação: desnaturação inicial a 94 ° C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 40 s, recozimento a 55 ° C por 40 s e extensão a 72 ° C por 90 s, com um alongamento final a 72 ° C por 7 min.
    2. Utilizar F2R21 e F-1R2-1 8,11 como iniciadores de segunda ronda, com o seguinte programa de reacção: desnaturação inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 40 s, recozimento a 55 °C durante 40 s e extensão a 72 °C durante 1 min, com um alongamento final a 72 °C durante 7 min.
  3. Para Blastocystis, siga as etapas 3.3.1-3.3.4.
    1. Use F1R13 e F1-1R-1 3,12 como primers de reação da primeira rodada. Defina o programa de reação para F1R1 da seguinte forma: desnaturação inicial a 94 ° C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 40 s, recozimento a 60 ° C por 40 s e extensão a 72 ° C por 100 s, com um alongamento final a 72 ° C por 7 min.
    2. Defina o programa de reação para F1-1R-1 da seguinte forma: desnaturação inicial a 94 ° C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 40 s, recozimento a 55 ° C por 40 s e extensão a 72 ° C por 1 min, com um alongamento final a 72 ° C por 7 min.
    3. Use F2R23 e F2-1R-1 3,12 como primers de segunda rodada. Defina o programa de reação para F2R2 da seguinte forma: desnaturação inicial a 94 ° C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 40 s, recozimento a 60 ° C por 40 s e extensão a 72 ° C por 1 min, com um alongamento final a 72 ° C por 7 min.
    4. Defina o programa de reação para F2-1R-1 da seguinte forma: desnaturação inicial a 94 ° C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 40 s, recozimento a 55 ° C por 40 s e extensão a 72 ° C por 50 s, com um alongamento final a 72 ° C por 7 min.
      NOTA: As sequências de primers são mostradas na Tabela 1 1,3,8,11,12.
PatogénicoTamanho esperado do produto (pb)Sequências de primers (5′-3′)Referências
Cryptosporidium830F1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA1
R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
F2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
607F-1: GACATATCATTCAAGTTTCTGACC8,11
R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
Blastocystis600F1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC3
R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
R2: GAGCTTTTTAACTGCAACAACG
460F1-1: TGCTTTCGCACTTGTTCATC3,12
F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

Tabela 1: Sequências de primers para SSU rRNA de Cryptosporidium e Blastocystis.

4. Detecção de PCR convencional aninhada do gene Enterocytozoon bieneusi ITS e dos genes Giardia BG, GDH e TPI

NOTA: Dream Taq Green PCR Mix foi usado para esta etapa.

  1. Prepare o sistema de reação de PCR em gelo usando mistura de PCR: 25 μL de tampão Taq 2×, 2 μL de primers direto e reverso, 16 μL de ddH2O e 5 μL de molde, com um volume total de 50 μL.
  2. Para Enterocytozoon bieneusi, siga as etapas 4.2.1-4.2.2.
    1. Use F1R19 e F1-1R1-12 como primers de reação da primeira rodada. Defina o programa de reação da seguinte forma: desnaturação inicial a 94 °C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 40 s, recozimento a 55 °C por 40 s e extensão a 72 °C por 50 s, com um alongamento final a 72 °C por 7 min.
    2. Utilizar F2R29 e F2-1R2-12 como iniciadores de segunda ronda, com o programa de reação do seguinte modo: desnaturação inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 40 s, recozimento a 55 °C durante 40 s e extensão a 72 °C durante 50 s, com um alongamento final a 72 °C durante 7 min.
  3. Para Giardia, siga as etapas 4.3.1-4.3.3.
    1. Use BG-F1R1, GDH-F1R1 e TPI-F1R1 2,10 como primers de reação de primeira rodada para os três genes-alvo. Defina o programa de reação da primeira rodada para todos da seguinte forma: desnaturação inicial a 94 ° C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 40 s, recozimento a 50 ° C por 40 s e extensão a 72 ° C por 1 min, com um alongamento final a 72 ° C por 7 min.
    2. Defina o programa de reação de segunda rodada para BG-F2R2 2,10 e TPI-F2R2 2,10 da seguinte forma: desnaturação inicial a 94 °C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 40 s, recozimento a 55 °C por 40 s e extensão a 72 °C por 50 s, com um alongamento final a 72 °C por 7 min.
    3. Definir o programa de reação de segunda rodada para GDH-F2R2 2,10 da seguinte forma: desnaturação inicial a 94 °C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 40 s, recozimento a 60 °C por 40 s e extensão a 72 °C por 50 s, com um alongamento final a 72 °C por 7 min.
      NOTA: As sequências de primers são mostradas na Tabela 2 2,9,10.
PatogénicoTamanho esperado do produto (pb)Sequências de primers (5′-3′)Referências
Enterocytozoon bieneusi390F1: GGTCATAGGGATGAAGAG9
R1: TTCGAGTTCTTTCGCGCTC
F2: GCTCTGAATATCTATGGCT
R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
390F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT2
R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG
R2-1: AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
Giardia511BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC2,10
BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC
BG-F2: GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
BG-R2: CTCGACGAGCTTCGTGTT
530GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC2,10
GDH-R1: ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGATGCA
530TPI-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG2,10
TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

Tabela 2: Sequências de primers para o gene ITS de Enterocytozoon bieneusi e os genes Giardia BG, GDH e TPI.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Camundongos Cryptosporidium, gene Blastocystis SSU rRNA, gene Enterocytozoon bieneusi ITS e resultados do teste de PCR do gene Giardia BG
Todas as 95 amostras fecais retais de camundongos foram testadas para o gene ITS de Enterocytozoon bieneusi usando dois conjuntos de primers, resultando em 5 amostras positivas para ca...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis e Giardia são parasitas intestinais zoonóticos comuns; os dois primeiros são classificados como patógenos biológicos de Categoria B pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH), e todos os quatro são listados pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como 24 dos parasitas de origem alimentar mais importantes do mundo. Eles podem potencialmente infectar humanos, animais e contaminar o meio ambi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado pela Comissão Provincial de Saúde de Jiangsu (concessão nos. Ym2023024), Projeto de Pesquisa Médica Municipal de Yancheng (concessão nº. YK2023085) e o Fundo Aberto do Laboratório Chave de Microbiologia Patogênica para Doenças Infecciosas Emergentes e Reemergentes (Centro Provincial de Controle e Prevenção de Doenças de Jiangsu) (PM202402).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Qingke TechTSJ001
Kit de extração em gel QiaquickQiagen 28704Kit de extração de gel de DNA
100 BP Mais Escada de DNATransGen  BiotecnologiaBM311Escada de DNA
4S Green Plus Nucleic Acid StainBBIA616696-0500Coloração de DNA
10 vezes; TBE BufferSolarbioT1051Buffer de eletroforese
Qubit 4.0Thermohttps://www.thermofisher.com/in/en/home
/industrial/espectroscopia-elemental
-análise de isótopos/espectroscopia molecular/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html?
ef_id=:G:s& s_kwcid=AL!3652!10!77515
785702067!!!! 77516061528018!! 380468
453!1240249321530142& CID=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		Instrumento quantitativo de fluorescência
MINI Space 1000Tanonhttp://en.biotanon.com/PRODUCT/
PRODUCTLIST?ID=3040&
TIPO=DETALHE		Imager em gel
  Kit Mini Rápido de Fezes de DNA para extração de DNAQIAGEN51604Kit de extração de ácidos nucleicos
ProFlex BaseThermohttps://www.thermofisher.com/
em/en/em/home/ciências da vida/pcr/
thermal-cyclers-realtime-
instruments/thermal-cyclers
/proflex-pcr-system.html		PCR
Dream Taq Green PCR MixThermoK1082Amplificação por PCR  

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