Um modelo de rato do transporte transversal do córtex tibial para o tratamento da isquemia do membro inferior

Resumo

Esse procedimento demonstra o transporte transverso do córtex tibial em ratos, permitindo visualização e análise da revascularização durante isquemia do membro.

Resumo

O transporte transverso do córtex tibial (TTT) é uma técnica cirúrgica emergente utilizada para promover a revascularização nos membros inferiores isquêmicos. Este vídeo demonstra um modelo reprodutível de TTT em ratos, detalhando a criação cirúrgica de um fragmento ósseo cortical, o protocolo de transporte e avaliações pós-operatórias. O procedimento permite o transporte controlado para cima e para baixo de um fragmento ósseo para estimular respostas angiogênicas. Imagens representativas de raio-X obtidas nos dias pós-operatórios 1, 7 e 12, juntamente com imagens por perfusão microvascular realizadas no 19º dia após a eutanásia, mostram movimento claro dos fragmentos ósseos e melhora na perfusão dos membros após a TTT.

Esse modelo oferece uma plataforma prática e reprodutível para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à angiogênese induzida por TTT e avaliar estratégias terapêuticas potenciais para doenças isquêmicas. Para construir esse modelo, simulamos o procedimento clínico TTT em ratos de Sprague-Dawley, envolvendo três etapas cirúrgicas principais: ligadura da artéria femoral superficial, criação e mobilização de um fragmento ósseo cortical e aplicação de um fixador externo personalizado. Ao longo de 12 dias, o fragmento foi gradualmente transportado para frente e depois para trás. Imagens por perfusão confirmaram aumento da vascularização no membro isquêmico após a conclusão do ciclo de transporte. No geral, esse modelo padronizado de ratos imita de perto os procedimentos clínicos TTT e oferece um sistema experimental valioso para estudar mecanotransdução, angiogênese e regeneração vascular em condições isquêmicas do membro.

Introdução

Doenças isquêmicas dos membros inferiores, como arteriosclerose obliterante (ASO), tromboangiíte obliterante (TAO) e pé diabético (DF), são caracterizadas por fluxo sanguíneo arterial restringido para os membros^{inferiores 1,2}. Nos estágios iniciais, os pacientes normalmente apresentam claudicação intermitente e dor em repouso. À medida que a doença progride, a isquemia prolongada pode resultar em necrose tecidual, infecção e, em casos graves, amputação de membros¹. Os tratamentos padrão atuais — incluindo terapia farmacológica, intervenções endovasculares e procedimentos cirúrgicos abertos — frequentemente apresentam eficácia limitada, especialmente em estágios avançados da^{doença 3}.

O transporte transverso do córtex tibial (TTT) é uma estratégia terapêutica inovadora para o tratamento de várias doenças isquêmicas dos membros^inferiores. Baseada no método de Ilizarov e na "regra tensão-estresse^"5,6, essa técnica envolve a criação de um fragmento móvel de retalho ósseo cortical na tíbia por meio de osteotomia. Uma força de distração contínua, lenta e controlada é então aplicada para estimular a regeneração do osso, vasos sanguíneos e tecidos moles ao redor. Esse processo regenerativo facilita a restabelecimento da microcirculação e ajuda a restaurar o equilíbrio do suprimento de oxigênio no membro afetado. No fim das contas, a TTT leva a uma perfusão sanguínea melhorada e recuperação funcional nos tecidos^{isquêmicos 7}.

Técnicas convencionais de reconstrução vascular para isquemia do membro inferior podem restaurar o fluxo sanguíneo em grandes artérias da panturrilha, mas frequentemente são ineficazes na revascularização de artérias menores do pé ou na promoção do reparo e regeneração de microvasos danificados, limitando sua capacidade de resolver completamente a^{isquemia 8}. A TTT aplica tração continuamente ao osso e aos tecidos moles ao redor, induzindo assim a liberação robusta de fatores quimiotáticos e^{citocinas 9}. Esses fatores quimiotáticos regulam várias funções das células-tronco e, sob condições isquêmicas, são abundantemente secretados pela circulação. Eles recrutam ativamente células-tronco endógenas para os locais de lesão, facilitando assim a reparação e regeneração vascular sem a necessidade de transplante direto de células-tronco. Devido a essas vantagens, a TTT emergiu como uma estratégia terapêutica promissora para isquemia dos membros inferiores e é cada vez mais empregada no tratamento de diversas condições isquêmicas que afetam os^{membros inferiores 7,9,10}.

Embora coelhos e cães sejam comumente usados em pesquisas fundamentais sobre TTT, a falta de ferramentas analíticas adequadas para essas espécies limita as investigações mecanicísticas. Em contraste, o modelo TTT de ratos oferece maior compatibilidade com as técnicas moleculares e de imagem disponíveis, mantendo a praticidade e o custo mais baixo, tornando-se uma plataforma mais acessível e reprodutível para estudos mecanicistas. No entanto, até o momento, nenhum estudo descreveu ou avaliou sistematicamente a eficácia da TTT em um modelo de rato de isquemia do membro inferior.

O modelo TTT de rato exige habilidades microcirúrgicas refinadas devido ao pequeno tamanho da tíbia e córtex fino, e sua faixa de distração é limitada pela espessura cortical. Essas limitações práticas devem ser levadas em conta ao avaliar a adequação do modelo para ambientes de pesquisa específicos.

Neste estudo, desenvolvemos um modelo TTT específico para ratos, replicando a estrutura central e os princípios operacionais do aparelho clínico de transporte transverso tibial. O procedimento foi refinado a partir de protocolos clinicamente validados para garantir viabilidade e consistência em pequenos animais. Nosso objetivo é estabelecer e validar um modelo padronizado e reprodutível de TTT em ratos, adequado para investigar angiogênese e mecanotransdução em doenças isquêmicas do membro.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangxi (aprovado nº 2025-E0642). Ratos machos Sprague-Dawley (300-350g) foram alojados no Centro de Pesquisa Animal da Universidade Médica de Guangxi sob condições padronizadas. Os ratos receberam comida normal e água potável limpa à vontade, e mantidos em um ciclo artificial de 12 horas de luz/escuro. A instalação para animais era mantida a uma temperatura controlada de 20-26 °C com umidade relativa de 40%-70%. Todos os instrumentos cirúrgicos foram completamente esterilizados antes do uso. Informações detalhadas sobre todos os reagentes e materiais utilizados neste estudo são fornecidas na Tabela 1.

A eutanásia foi realizada por injeção intraperitoneal de uma overdose de pentobarbital sódico. A morte foi confirmada pela cessação permanente do batimento cardíaco e da respiração, dilatação pupilar e ausência de resposta a estímulos nocivos. Todos os procedimentos foram conduzidos por pessoal treinado para minimizar o sofrimento animal, e o protocolo de eutanásia foi revisado e aprovado previamente pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional dos Animais.

1. Fixador externo para TTT

1. Use uma versão reduzida e projetada sob medida do fixador externo clínico do córtex tibial transverso (TTT-EF), consistindo em uma unidade de tração de fragmentos ósseos e uma estrutura de fixação externa.
2. Possibilite a mobilização vertical de ambos os componentes incorporando um mecanismo interno de rosca (Figura 1).
3. Perfure dois furos de passagem em cada lado das seções transversais tanto da unidade de tração quanto do quadro de fixação para permitir a inserção de fios Kirschner.
4. Insira os fios Kirschner pelos furos designados e fixe-os lateralmente usando parafusos hexagonais para garantir a estabilização.
5. Conecte o componente de tração do TTT-EF ao fragmento ósseo usando fios Kirschner de 0,8 mm.
6. Fixe o componente de fixação nas extremidades proximal e distal da tíbia usando fios de Kirschner de 1,0 mm.

2. Procedimento cirúrgico

1. Realize o procedimento TTT em ratos machos Sprague-Dawley (SD) de 8 semanas. Anestesie os ratos por injeção intraperitoneal de 0,35 mg/kg de pentobarbital sódico e 0,3 mg/kg de cloral hidrato.
2. Avalie o efeito anestésico testando o reflexo de retirada do pedal e o reflexo corneano. Monitore continuamente os sinais vitais e a profundidade da anestesia durante todo o procedimento. Aplique pomada oftálmica nos olhos do rato antes da cirurgia para proteger a córnea, seguindo as Diretrizes para o Uso de Animais de Laboratório.
3. Raspe a área cirúrgica e administre 0,5% de lidocaína para minimizar a dor pós-operatória.
4. Faça uma incisão cutânea de 10 mm na região inguinal direita usando um bisturi nº 11.
5. Disseca a fáscia de forma direta para expor a artéria femoral superficial.
6. Isole a artéria entre o nervo femoral e a veia femoral superficial usando fórceps oftálmicos. Liga e transecto em ambas as extremidades da artéria.
7. Suture a incisão usando sutura absorvível 4-0.
8. Faça uma incisão vertical de 15 mm na tíbia superior medial usando um bisturi nº 11.
9. Separe cuidadosamente o tecido subcutâneo e o músculo subjacente para evitar lesão perióstica. Dissece suavemente o tecido mole para expor totalmente a superfície tibial medial.
10. Delinee a área dos fragmentos ósseos (8 mm × 4 mm) na superfície tibial medial usando uma lâmina cirúrgica. Perfure perfurações próximas ao longo da fronteira marcada usando uma broca de 0,6 mm. Crie um fragmento ósseo de janela (8 mm × 4 mm) na tíbia medial superior.
11. Implante dois fios Kirschner rosqueados de 0,8 mm no fragmento ósseo, espaçados 0,5 mm entre si, para facilitar o transporte. Conecte os fios Kirschner ao TTT-EF e prenda-os.
12. Insira dois fios Kirschner de 1,0 mm de cada lado do fragmento, penetrando o córtex posterior da tíbia.
13. Montar e instalar o TTT-EF.
14. Realize osteotomia ao longo das linhas marcadas usando tesoura oftálmica.
15. Eleve suavemente o fragmento ósseo para permitir mobilidade vertical, evitando lesões na medula.
16. Irrige o local cirúrgico com 10% de povidona-iodo seguido de soro fisiológico estéril.
17. Suture a incisão em camadas usando sutura absorvível 4-0.
18. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) por via subcutânea imediatamente após a cirurgia. Continue administrando a cada 12 horas por até 3 dias para garantir uma analgesia eficaz.

3. Monitoramento pós-operatório

1. Monitore de perto os animais após a cirurgia para garantir a recuperação adequada e detectar possíveis complicações precocemente. Examine os animais a cada 6-8 horas durante as primeiras 48 horas pós-operatórias. Avalie a atividade geral, postura, comportamento de cuidado, consumo de alimentos e água, e condição da incisão cirúrgica.
2. Realize monitoramento pelo menos uma vez ao dia desde o terceiro dia pós-operatório até as fases de distração e consolidação. Confirme a recuperação adequada verificando a marcha normal, peso corporal estável, consumo consistente de comida e água, e ausência de secreção da ferida, inchaço excessivo ou sinais comportamentais de dor.
3. Continue com a administração da anestesia conforme necessário, de acordo com as diretrizes institucionais.
4. Trate infecções de feridas (por exemplo, eritema, inchaço, secreção purulenta) com cuidados locais de feridas e antibióticos sistêmicos, seguindo recomendações veterinárias.
5. Corrija qualquer afrouxamento ou deslocamento do fixador externo imediatamente sob anestesia breve para manter o alinhamento e permitir uma distração precisa.
6. Avalie e gerencie rapidamente quaisquer possíveis complicações. Avalie animais com complicações graves que afetem mobilidade, alimentação ou cicatrização de feridas em consulta com a equipe veterinária.
7. Eutanasiar animais humanamente se eles atenderem aos critérios humanos pré-definidos.

4. Protocolo de transporte de fragmentos ósseos

1. Use o fixador externo de transporte transverso do córtex tibial (TTT-EF) para realizar o transporte pós-operatório de fragmentos ósseos.
2. Designe o Dia 1 após a cirurgia como período de latência.
   NOTA: Não manipule o fragmento ósseo durante esse período.
3. Inicie a fase de transporte ascendente no segundo dia. Avance o fragmento ósseo a uma taxa de 0,5 mm a cada 12 horas por 5 dias consecutivos (Dia 2 - Dia 6). Pause o processo de transporte no Dia 7 para permitir a estabilização.
4. Inicie a fase de transporte descendente no Dia 8.
5. Retrair o fragmento ósseo na mesma taxa de 0,5 mm a cada 12 horas por 5 dias (Dia 8 - Dia 12). Certifique-se de que o fragmento ósseo volte à posição original até o final do Dia 12.
6. Continue com uma fase de consolidação de 2 dias (dias 13-14), sem mais transporte.
7. Remova o fixador externo ao final da fase de consolidação.
   NOTA: Consulte a Figura 2 para uma linha do tempo visual do procedimento de transporte TTT e do cronograma de avaliação.

5. Avaliação

NOTA: Use técnicas de imagem para avaliar tanto a posição dos fragmentos ósseos quanto a restauração do fluxo sanguíneo.

1. Realize imagens de raio-X dos membros inferiores nos dias 1, 7 e 12 para monitorar a progressão e a posição final do fragmento ósseo transportado.
   1. Anestesiar ratos em pontos de tempo de imagem designados usando isoflurano a 2,0% em oxigênio.
   2. Coloque cada rato em uma plataforma de imagem com temperatura mantida, equipada com uma almofada térmica para evitar hipotermia durante o procedimento.
   3. Monitore a profundidade da anestesia avaliando a frequência respiratória e o reflexo pedal para garantir uma imobilização estável.
   4. Posicione os membros e o fixador externo em uma orientação padronizada em todos os animais para minimizar a variabilidade na aquisição de raios X.
   5. Adquira imagens de raio-X para confirmar o deslocamento e o reposicionamento dos fragmentos ósseos.
2. Realize imagens por perfusão vascular no 19º dia pós-operatório para avaliar a perfusão microvascular no membro inferior.
   1. Eutanasie os ratos e perfunde o agente de contraste pela artéria femoral para visualizar a vasculatura.
   2. Coloque os ratos eutanasiados em uma posição deitada padronizada para uma configuração consistente de imagens.
   3. Permita o enchimento vascular completo perfundindo o agente de contraste através da artéria femoral sob condições estáveis de temperatura ambiente.
   4. Realize imagens vasculares para avaliar a arquitetura e perfusão microvascular. Certifique-se de que todas as amostras estejam alinhadas de forma consistente com a mesma orientação dos membros e do alinhamento dos fixadores para apoiar a reprodutibilidade nas sessões de imagem.
   5. Use as imagens resultantes para avaliar a restauração do fluxo sanguíneo e da arquitetura vascular nos membros inferiores.

Resultados

A Figura 3 ilustra o procedimento para construir um modelo animal de isquemia do membro inferior tratado com TTT. Em nossas mãos, o procedimento demonstrou uma taxa de sucesso cirúrgico de aproximadamente 90%. O número limitado de falhas foi em grande parte atribuído a questões técnicas como afrouxamento do fixador externo ou fratura intraoperatória de fragmentos ósseos, que tornaram inviável a distração subsequente. O modelo foi estabelecido expondo e ligand...

Discussão

Todos os procedimentos envolvendo anestesia e cirurgia foram realizados com atenção cuidadosa à segurança animal e às diretrizes institucionais de cuidados com os animais. A profundidade da anestesia foi confirmada antes da incisão, utilizando retirada do pedal ou teste de reflexo corneano, e foi monitorada regularmente durante todo o procedimento. Suporte térmico adequado (como uma bolsa térmica) foi fornecido para prevenir hipotermia, e uma pomada oftálmica foi aplicada para proteger a...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Retrator Micro Transverso	Tianjin Xinzhong Medical Equipment Co., Ltd	A61B17/66	Realizar tração de fragmentos ósseos
Pequeno Furadeiro Ortopédico	Yancheng Ruiao Technology Co. LTD	RA-II	Para osteotomia com perfuração tibial
Broca de Aço Inoxidável de 0,6 mm	Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd	-	Para osteotomia com perfuração tibial
Fio Kirschner tipo rosca de 0,8 mm	Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd	-	Para fixação de abas ósseas e retrator
Fio Kirschner do tipo rosca de 1,0 mm	Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd	-	Para fixação do retrator
Pentobarbital sódico	Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd	-	Para anestesiação de animais
Chave Allen	Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd	-	Para parafusos de fixação
Buprenorfina	Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd		Para animal com analgesia
MICROFIL	Flow Tech, Inc Co., Ltd		Angiografia de animais
Isoflurano	Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd.		Para indução e manutenção da anestesia por inalação
Cloridrato de Lidocaína (0,5%)	Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd.		Usado para infiltração local para reduzir a dor pós-operatória e minimizar a irritação dos tecidos durante procedimentos cirúrgicos