Protocolos cirúrgicos para anastomose linfovenosa cervical profunda em modelo de rato: anastomoses linfonodais e vasos linfáticos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para definir claramente as etapas para anastomosar o linfonodo cervical profundo ou seu vaso linfático aferente com a veia facial posterior no rato, para minimizar a influência de outras variáveis e padronizar a condução de pesquisas cirúrgicas.

Resumo

A anastomose linfovenosa cervical profunda (dcLVA) tornou-se uma estratégia de tratamento promissora para a doença de Alzheimer (DA), oferecendo melhorias significativas em comparação com as atuais opções de tratamento limitadas. No entanto, o mecanismo subjacente do dcLVA permanece obscuro. Embora os ensaios clínicos estejam em andamento, os modelos animais que simulam o dcLVA fornecem uma ferramenta valiosa para explorar seu mecanismo. Este estudo tem como objetivo desenvolver um protocolo padronizado para a criação de modelos dcLVA em animais para facilitar a pesquisa básica e enfrentar desafios clínicos. Descrevemos os procedimentos cirúrgicos e as principais etapas para anastomosar o linfonodo cervical profundo (dcLN) e seu vaso linfático aferente (ALV) com a veia facial posterior (VPF), detalhando esses dois métodos cirúrgicos distintos: anastomose linfonodo-veia cervical profunda (dcLnVA) e anastomose vaso linfático cervical-veia profunda (dcLaVA). Além de promover a drenagem linfática, a comparação desses dois métodos cirúrgicos também nos ajuda a entender e explorar o papel do linfonodo cervical profundo e do sistema linfático cervical profundo na patogênese da DA. No geral, a apresentação completa e clara do procedimento cirúrgico e dos principais marcos anatômicos no rato ajuda a padronizar o protocolo cirúrgico, que podem minimizar fatores de confusão e reduzir a variabilidade interexperimental, estabelecendo assim uma base metodológica sólida para uma compreensão mais profunda dos mecanismos envolvidos.

Introdução

A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio neurodegenerativo gradualmente progressivo que geralmente resulta em declínio cognitivo. As características patológicas distintivas da DA são placas beta-amilóide (Aβ) e emaranhados neurofibrilares, que são formados por proteínas tau anormalmente fosforiladas. Pesquisas recentes sobre o sistema linfático cerebral abriram novos caminhos terapêuticos para o tratamento da DA. Esse sistema facilita a drenagem de Aβ do líquido intersticial (ISF) para o líquido cefalorraquidiano (LCR) e, posteriormente, para os linfonodos cervicais profundos através dos vasos linfáticos meníngeos (mLVs)¹. Em 2024, a equipe do professor Xie relatou o primeiro caso de melhora cognitiva em um paciente com DA após anastomose linfovenosa cervical profunda (dcLVA) e, posteriormente, iniciou um ensaio clínico (NCT06530732)².

Embora o dcLVA, como uma nova abordagem terapêutica para a DA, ofereça perspectivas promissoras para os pacientes, os mecanismos precisos subjacentes aos seus efeitos terapêuticos requerem maior elucidação³. Os modelos animais fornecem uma plataforma indispensável para investigar esses mecanismos. Uma compreensão abrangente dos mecanismos terapêuticos do dcLVA não apenas aumentará nossa compreensão da patogênese da DA, mas também otimizará as técnicas cirúrgicas, esclarecerá as indicações de tratamento e, por fim, proporcionará maiores benefícios clínicos aos pacientes.

A equipe do professor Xie relatou recentemente um modelo dcLVA, demonstrando a viabilidade de conectar tributários da veia jugular externa com o linfonodo cervical profundo⁴. No entanto, a descrição do modelo ainda não é suficiente. Em primeiro lugar, a descrição do linfonodo cervical profundo (dcLN) e sua anatomia circundante é inadequada. Em segundo lugar, não há avaliação objetiva e quantitativa da perviedade pós-operatória. Mais importante, faltam descrições detalhadas das etapas para anastomose de dcLN e veias, bem como imagens e vídeos claros e intuitivos que sejam convenientes para o ensino.

Dado que essa técnica envolve manipulação cirúrgica intrincada e considerando as diferenças anatômicas entre ratos e humanos, variações nos procedimentos cirúrgicos e detalhes técnicos em modelos de ratos podem levar a discrepâncias significativas nos resultados experimentais. Portanto, é crítico e urgente ilustrar claramente os marcos anatômicos relevantes em ratos e fornecer descrições técnicas detalhadas do procedimento de anastomose. Tais esforços são essenciais para melhorar a reprodutibilidade e padronização do protocolo cirúrgico, apoiando assim uma aplicação mais ampla por pesquisadores e avançando nas investigações científicas relacionadas. Além disso, dada a diversidade de técnicas cirúrgicas clínicas, como anastomose linfonodo-veia e anastomose linfático-venosa, e o potencial de resultados variados dependendo da abordagem cirúrgica, estudos comparativos são necessários para avaliar sua eficácia relativa. Em resposta a esses desafios, apresentamos dois métodos dcLVA altamente reprodutíveis: anastomose linfonodo-veia cervical profunda (dcLnVA) e anastomose veia vaso linfático cervical profunda (dcLaVA). Esses métodos visam padronizar o processo de criação do modelo e facilitar a pesquisa básica subsequente.

Protocolo

Este estudo foi conduzido com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Harbin Medical University (Aprovação nº. SYDW2025-037). Os sujeitos foram ratos Sprague-Dawley (SD) machos, pesando 400-500 g e com idade entre 12 e 14 semanas, fornecidos pelo centro de animais da universidade. O centro mantém uma instalação livre de patógenos específicos (SPF) e está em conformidade com os padrões nacionais de reprodução.

NOTA: Este estudo investiga principalmente dois métodos de anastomose entre a linfa cervical profunda e as veias. Estabelecer uma conexão cirúrgica entre o dcLN e a veia facial posterior (VPF); esta técnica é conhecida como dcLnVA. Criar uma conexão anatômica entre o vaso linfático cervical profundo (dcLaV) e o PFV; essa técnica é conhecida como dcLaVA. Descrevemos detalhadamente os dois procedimentos microcirúrgicos, incluindo suas metodologias operatórias e avaliação pós-anastomose.

1. Preparo pré-operatório

1. Anestesiar o rato por meio de injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg / kg). Monitore as respostas do rato de perto. Prossiga apenas quando o reflexo do pedal estiver completamente ausente.
2. Usando uma agulha de ponta romba, administre lentamente a solução de azul de Evans (EB) (aproximadamente 60-100 μL/kg, 5%)⁵ na mucosa nasal de uma cavidade nasal unilateral. Posicione o rato em decúbito semilateral, com o abdômen voltado para cima e a narina injetada com EB voltada para baixo. Prenda a cabeça para evitar que a EB entre na narina contralateral ou no trato respiratório.
3. Raspe o cabelo do pescoço do rato para garantir um campo cirúrgico limpo. Aplique vaselina em ambos os olhos para evitar ressecamento ou lesão da córnea durante a cirurgia.

2. Incisão cirúrgica

1. Desinfete a linha média do pescoço do rato três vezes com tintura de iodo para garantir um campo cirúrgico estéril.
2. Faça uma incisão na linha média de aproximadamente 3 cm de comprimento usando uma tesoura cirúrgica.
   NOTA: Tome cuidado para não danificar a glândula submaxilar (SMG) e os vasos sanguíneos durante a dissecção.
3. Retraia a incisão cirúrgica para expor o músculo esternotireóideo (STM), o músculo esternocleidomastóideo (SCM) e o músculo omo-hióideo (OHM).

3. Preparação do PFV

1. Identifique o PFV, um tributário da veia jugular externa (EJV), ao longo da margem lateral do ECM.
2. Na bifurcação entre o PFV e o EJV, oclua o PFV usando um clipe microvascular.
3. Continue a dissecar sem rodeios o PFV para obter comprimento suficiente e prenda-o na extremidade distal. Certifique-se de que o segmento PFV permaneça o mais solto possível para permitir a tração subsequente durante a anastomose com o dcLN.
4. Faça uma incisão longitudinal paralela ao eixo do vaso usando uma tesoura microvascular.
   NOTA: Certifique-se de que a incisão do PFV seja longitudinal, pois a incisão transversal pode ser ampliada e rompida por tração.
5. Irrigue bem o segmento vascular isolado com solução salina heparinizada (heparina sódica a 0,1% em NaCl a 0,9%) até que os eritrócitos intravasculares estejam completamente eliminados.

4. Anastomose linfonodo-veia

1. Explore e exponha totalmente o dcLN e seu vaso linfático aferente (ALV) no meio do STM e SCM⁴.
2. Dissecar o dcLN gradualmente usando uma técnica romba. Incise cuidadosamente a fáscia entre o dcLN e os tecidos circundantes, evitando danos ao dcLN e ao seu ALV.
   NOTA: Certifique-se de que PFV e dcLN estejam próximos um do outro para minimizar a tensão após a anastomose.
3. Faça uma incisão na extremidade distal do dcLN. Certifique-se de que a largura da incisão seja menor ou semelhante ao diâmetro do PFV, para que o fluxo sanguíneo do PFV não seja significativamente afetado.
4. Usando uma sutura de náilon 12-0, anastomose a extremidade proximal da incisão do PFV com a extremidade proximal da incisão dcLN.
5. Continue a expandir o comprimento da incisão do PFV até a extremidade distal para que seja ligeiramente maior que o comprimento da incisão dcLN.
6. Passe a agulha sequencialmente pela borda externa da transecção dcLN e pela borda interna da incisão PFV, puxando assim a transecção dcLN para o lúmen da PFV.
7. Realize uma sutura contínua da borda inferior para a superior da transecção dcLN. Administre heparina sódica mais uma vez antes de completar a sutura final para evitar a formação de trombos dentro do lúmen do PFV. Mantenha a tensão adequada na sutura durante o fechamento contínuo para garantir um fechamento seguro e evitar vazamentos subsequentes.
8. Coloque suturas interrompidas onde quer que a anastomose contínua esteja solta.

5. Anastomose vaso linfático-veia

1. Traneccione o ALV e preserve o tecido circundante para servir como um ponto de ancoragem de sutura.
2. Usando uma agulha de sutura 12-0, insira-a cerca de 2 mm proximal à incisão da VPF e avance-a para sair pela abertura da incisão da VPF.
3. Entre no tecido próximo ao coto do ALV com a agulha de sutura para pegar o ALV.
4. Passe a agulha para a incisão do PFV e para fora através de sua borda proximal, depois amarre a sutura para fixar o coto do ALV dentro do lúmen do PFV.
   NOTA: Insira completamente o coto ALV no lúmen do PFV, orientando-o na direção proximal para manter a drenagem fisiológica.
5. Suturar o tecido circundante próximo ao coto de ALV até a borda interna da incisão do PFV para fornecer fixação externa. Dê heparina sódica antes do último ponto para manter o lúmen do PFV livre de coágulo.

6. Sutura e cuidados pós-operatórios

1. Realize sutura contínua para a fáscia subcutânea e sutura interrompida para a epiderme.
2. Desinfete a área cirúrgica com tintura de iodo. Em seguida, aplique pomada de eritromicina uniformemente ao redor da incisão para evitar infecções.
3. No pós-operatório, administrar penicilina sódica (800.000 unidades/kg) por injeção intraperitoneal uma vez ao dia por cinco dias consecutivos para reduzir o risco de infecção.

7. Validação da anastomose

1. Identifique e disseque a veia facial anterior (AFV), um tributário do EJV, lateral ao PFV.
2. Verificar o sucesso da anastomose observando uma coloração significativamente mais intensa no PFV em comparação com a AFV adjacente.
3. Quantifique as mudanças de cor objetivamente usando o espaço de cores CIE LAB padronizado. Defina e extraia Regiões de Interesse (ROIs) em Fiji para obter os valores médios de CIE L*a*b* e, em seguida, calcule o ângulo de matiz (h°) em graus usando a fórmula:
   h° = atan2(b, a) × (180/π)^6,7.

Resultados

Os procedimentos cirúrgicos e os resultados pós-operatórios de dcLnVA e dcLaVA são ilustrados com um caso representativo cada. No caso de dcLnVA, o PFV (2 mm de diâmetro) foi identificado e dissociado da borda lateral do ECM (Figura 1A, Figura S1A). No espaço entre o ECM e o STM, aproximadamente 4 mm medial ao PFV, um longo dcLN oval (5 mm × 4 mm × 2 mm) foi encontrado e finamente separado (Figura 1B

Discussão

Em 2012, ILif et al. descreveram pela primeira vez o sistema glinfático⁸. Em 2015, Louveau et al. identificaram agregados de células T no lúmen dos vasos linfáticos e denominaram essas estruturas linfáticas meníngeas. Eles demonstraram ainda que os linfáticos meníngeos estão conectados ao sistema glinfático e ao dcLN. Em resumo, sob a regulação do sistema linfático cerebral, incluindo o sistema glinfático e os linfáticos meníngeos, o Aβ no líquido intersticial é d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina estéril com 0,9%	Shandong Qidu Pharmaceutical Co., Ltd.	R9824041307
Pomada de Eritromicina	Sanqi Pharmaceutical Co., Ltd.	H34020307
Corante Evans Blue 5% (50mL)	LEAGENE	DK0053
Solução de Heparina sódica 0,1%	BIOSCO	BAC006
Micro pinças	ANLIXIN	AT-15
Pinça microvascular	Tigergene	TG-AC-18-Z
Penicilina sódica	Hebei Yuanzheng Hemu Pharmaceutical Co., Ltd	JFT230602
Vaselina Branca	Tiancheng	20250202