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Artigo de método

Um modelo avançado de co-cultura da barreira hemato-cefalorraquidiana humana para análise separada do epitélio e endotélio do plexo coroide

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DOI:

10.3791/69275

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28 de novembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

Neste artigo

Resumo

Foi estabelecida uma co-cultura de células epiteliais e endoteliais humanas do plexo coroide para gerar um modelo avançado in vitro da barreira hematocefalorraquidiana da barreira. Descrevemos o isolamento separado do epitélio e do endotélio para preparação subsequente de RNA e análise transcricional sob condições selecionadas.

Resumo

O plexo coróide (PC) altamente perfundido, localizado no sistema ventricular do cérebro, consiste em vários componentes estruturais, incluindo um epitélio cúbico e um endotélio fenestrado, e é o local da barreira hematocefalorraquidiana (BCSFB). Para investigar a PC in vitro, são possíveis várias configurações de cultura celular. Um modelo de filtro de cultura celular invertido com forte função de barreira, baseado em células de papiloma epitelial CP humano (HIBCPP), foi estabelecido por nosso laboratório e é amplamente utilizado. Recentemente, conseguimos gerar uma linha celular endotelial CP humana estável e imortalizada (iHCPEnC). Combinando ambas as linhagens celulares, montamos um modelo avançado funcional do tipo duas células que desenvolveu uma função de barreira aumentada em comparação apenas com as células HIBCPP. Como esse modelo representa tanto o epitélio da CP quanto o endotélio, ele permite a investigação da interação entre os dois tipos celulares sob condições selecionadas, como infecção, inflamação ou outras. Neste protocolo, descrevemos métodos para configurar esse modelo do tipo duas células com a separação subsequente das células epiteliais e endoteliais para análises transcricionais. Descrevemos primers de PCR específicos para epitélio e endotélio, que servem para detectar possível contaminação cruzada entre os dois tipos celulares. Para investigar um possível impacto do endotélio da CP no epitélio neste modelo sob condições inflamatórias, os níveis de expressão de genes selecionados no contexto do tratamento com lipopolissacarídeos (LPS) foram analisados na fração celular de HIBCPP. O modelo avançado de PC in vitro e a possibilidade de analisar separadamente respostas epiteliais e endoteliais são de grande interesse para pesquisas sobre processos celulares envolvendo funções biológicas e patológicas da PC.

Introdução

O plexo coroide (PC) é um conglomerado altamente vascularizado de diferentes populações celulares localizadas em todos os quatro ventrículos do cérebro. Entre outras funções, ele atua como uma barreira fisiológica, a chamada barreira do líquido hematocefalorraquidiano (BCSFB), entre o sistema nervoso central (SNC) e o sangue, impedindo que o cérebro, por exemplo, substâncias infecciosas circulem no sangue. A PC consiste em diferentes tipos celulares, incluindo as células epiteliais polarizadas, contendo junções apertadas e de aderência, bem como desmossomosmos, que estão sobre uma membrana basal. A superfície das células epiteliais é aumentada pela presença de microvilosidades na superfície luminal. Capilares endoteliais fenestrados, cercados por tecido conjuntivo como fibroblastos e células imunes, estão localizados sob a membranabasal 1,2,3. Foi recentemente relatado que as células endoteliais CP são capazes de aumentar a integridade da BCSFB junto com as células epiteliais e, assim, podem desempenhar um papel na proteção cerebral durante processosinflamatórios 4,5.

Até agora, a cultura invertida de células papiloma epitelial CP humano (HIBCPP) é o modelo in vitro mais frequentemente utilizado para imitar um BCSFB humano com altos valores de resistência elétrica transepitelial (TEER) e forte função barreira. Para obter uma melhor compreensão das funções celulares e evitar experimentos com animais ao mesmo tempo, é importante obter o máximo de informações possível dos experimentos in vitro. A primeira linha celular endotelial estável e imortalizada da CP humana (iHCPEnC) foi estabelecida recentemente em nossolaboratório 6,7. Com a ajuda das células HIBCPP e do iHCPEnC, conseguimos montar um modelo de cocultura in vitro imitando o BCSFB de forma maisavançada 8. Usando esse modelo do tipo duas células, pudemos demonstrar que a co-cultura de células HIBCPP e iHCPEnC leva a valores maiores de TEER em comparação apenas com células HIBCPP. É importante notar que o iHCPEnC sozinho não desenvolve um TEER 7,8. Preparação separada e análises subsequentes dos dois tipos celulares empregados nesse modelo nos permitiriam investigar sua interação em condições saudáveis e doentes.

Aqui descrevemos duas abordagens diferentes para alcançar esse objetivo. A base é que, em ambos os casos, a abordagem é baseada no modelo de cultura celular invertida das células HIBCPP (Figura 1). O método 1, o método de "co-cultura direta", compreende ambas as células em um único filtro inserido. As células HIBCPP são cultivadas de forma invertida antes de semear iHCPEnC de forma padrão 7,8. Método 2, a cultura "membrana em inserção", aqui adicionamos uma membrana separada com as mesmas propriedades da usada nos filtros inseridos. Essa membrana adicional é inserida em um filtro onde células de HIBCPP já estão crescendo em cultura invertida. Os iHCPEnC são semeados na membrana adicional na forma padrão de cultura.

A separação subsequente das células para análise de RNA permite insights sobre a reação transcricional do epitélio e endotélio do CP sob condições selecionadas. Descrevemos primers de PCR específicos para células HIBCPP e iHCPEnC que permitem a confirmação da separação bem-sucedida e limpa de ambos os tipos celulares. Após o tratamento com lipopolissacarídeo (LPS), utilizamos os modelos descritos para investigar as respostas distintas do epitélio da PC na presença do endotélio sob condições inflamatórias.

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Protocolo

1. Células HIBCPP

NOTA: A seguir, descrevemos a cultura e manutenção de células HIBCPP, bem como a preparação de inserções de filtros de cultura celular invertida com células HIBCPP. Este protocolo foi projetado para o crescimento de células HIBCPP em inserções de filtro de cultura celular de 12 poços. Um protocolo detalhado com vídeo acompanhante para cultivo de células HIBCPP em inserções de filtros de cultura celular de 24 poços foi publicado anteriormente9.

  1. Levando células HIBCPP para cultura
    1. Descongelar um frasco de células HIBCPP em temperatura ambiente (RT).
    2. Ressuspenda o conteúdo do frasco com 10 mL de meio DMEM/HAMS-F12 contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS) e 5 μg de insulina/mL de meio pré-aquecido (meio 10% HIBCPP).
    3. Coloque as células HIBCPP ressuspensas em um frasco de cultura de células T75 e incube por 24 horas a 37 °C com 5% de CO2.
    4. Mude o meio do frasco para remover o DMSO 24 horas após semear as células.
    5. Cultive as células até 90% de confluência, essa etapa leva cerca de 2 semanas. Mude o meio duas vezes por semana.
  2. Cultura contínua de células HIBCPP
    NOTA: Para cultura contínua, divida as células de HIBCPP 1:3 em novos frascos de cultura de células T75.
    1. Remova o meio de cultivo do frasco T75.
    2. Lave as células uma vez com 10 mL de PBS.
    3. Remova o PBS.
    4. Dê descolação das células de HIBCPP com a ajuda de 3 mL de 0,25% de Tripsina-EDTA. Essa etapa leva cerca de 10-20 minutos a 37 °C. Enquanto isso, enrole o frasco para garantir a cobertura completa da camada celular com Tripsina-EDTA.
    5. Adicione 7 mL de meio HIBCPP e centrifuge a 50 x g por 10 minutos em RT.
    6. Resuspenda o pellet celular em 30 mL de meio 10% de HIBCPP e espalhe para 3 novos frascos de T75.
    7. Cultive as células até 90% de confluência; As células atingirão a confluência em cerca de 1 semana.
    8. Mude o meio duas vezes por semana.
      NOTA: As células HIBCPP não são inibidas pelo crescimento; portanto, o frasco se tornará confluente, e as células continuarão crescendo e formando múltiplas camadas.
  3. Semeadura de células HIBCPP em cultura invertida
    1. Remova o meio de cultivo do frasco T75.
    2. Lave as células uma vez com 10 mL de PBS.
    3. Remova o PBS.
    4. Dê descolação das células de HIBCPP com a ajuda de 3 mL de 0,25% de Tripsina-EDTA. Essa etapa leva cerca de 10-20 minutos a 37 °C. Enquanto isso, enrole o frasco para garantir a cobertura completa da camada celular com Tripsina-EDTA.
    5. Enquanto isso, prepare os inserts do filtro. Vire os filtros de 12 poços inseridos de cabeça para baixo em uma placa de cultura celular de 6 poços com a ajuda de pinças e preencha com meio de 10% de HIBCPP pré-aquecido. Pré-umeda a membrana com uma gota de meio sobre cada inserto filtrante.
    6. Ressuspender células tripsinizadas com 17 mL de meio 10% de HIBCPP.
    7. Centrifuge a 50 x g por 10 minutos em RT e ajuste as células de HIBCPP para uma concentração de 1 × 106 células/mL.
      NOTA: As células HIBCPP tendem a formar pequenos aglomerados. Não é necessário dissolvê-los completamente antes de semear nos insertos do filtro. Certifique-se de que 90% das células sejam únicas.
    8. Semear células HIBCPP de forma invertida em inserções de filtro de 12 poços com densidade de 4 × 10 célulasde 5 por inserção.
    9. Espere até que a suspensão celular seja absorvida pela membrana. Feche a tampa da placa de cultura celular de 6 poços.
    10. Coloque as placas com os insertos invertidos na incubadora.
    11. 24 horas após a semeadura, vire os insertos com a ajuda de pinças para sua orientação correta em uma nova placa de cultura celular de 12 poços. Coloque 2 mL de meio HIBCPP a 10% no compartimento inferior e 1 mL no compartimento superior.
    12. Deixe as células por 5 a 6 dias sem nenhuma alteração do meio e comece a determinação da TEER e a montagem da co-cultura.

2. Determinação do TEER

NOTA: A determinação dos valores TEER é realizada com a ajuda de um MilliCell ERS2 e de um eletrodo de hashis. Uma medição em branco feita por filtro de cultura celular inserida em meio sem células (Ohm em branco) é necessária para o cálculo.

  1. Guarde o eletrodo de hashis seco. Antes de iniciar a medição, coloque o eletrodo em etanol a 80% por 10 minutos para desinfecção.
  2. Depois, enxágue o eletrodo com PBS.
  3. Iniciando a medição: Coloque a extremidade longa do eletrodo no poço e a extremidade curta do eletrodo no inserto do filtro contendo as células semeadas.
  4. Registre o valor de Ohm do inserto do filtro de cultura celular de 12 poços (amostra de Ohm).
  5. Calcule o TEER da seguinte forma: Ohm·cm2 = (Ohm amostra -Ohm em branco) × 1,1 cm2.
  6. Após terminar a medição, enxágue o eletrodo com etanol 80% e depois guarde seco.
    NOTA: Entre medições de diferentes condições experimentais ou de diferentes linhagens celulares, o eletrodo de hashis precisa ser desinfetado e enxaguado com PBS para evitar contaminação cruzada.

3. iHCPEnC

  1. Levando o iHCPEnC para a cultura
    1. Descongele um frasco de iHCPEnC no RT.
    2. Resuspenda o conteúdo do frasco com 5 mL pré-aquecidos de Meio Endotelial Clássico Completo (meio iHCPEnC).
    3. Centrifuge a 500 g por 5 minutos em RT.
    4. Enquanto isso, revestir um frasco de cultura celular T25 com 2 mL de fator de fixação por aproximadamente 1 minuto. Aspire o fator de fixação e deixe o frasco até semear o iHCPEnC.
    5. Ressuspenda o pellet celular com 5 mL de meio iHCPEnC e coloque-o no frasco preparado de cultura celular T25.
    6. Incubar a 37 °C com 5% deCO2 por 1 semana, sem mudança de meio.
  2. Cultura contínua do iHCPEnC
    NOTA: Para cultura contínua, divida o iHCPEnC 1:4 em novos frascos de cultura celular T25.
    1. Remova o meio iHCPEnC e lave as células uma vez com 3 mL de PBS. Tenha cuidado para evitar o descolamento das células.
    2. Aspire o PBS.
    3. Descolhe o iHCPEnC confluente com a ajuda de 1 mL de Tripsina-EDTA. Essa etapa leva cerca de 3 a 5 minutos no tempo de descanso.
    4. Resuspenda as células em 5 mL de meio iHCPEnC.
    5. Centrifuge a 500 g por 5 minutos em RT.
    6. Enquanto isso, recubra 4 novos frascos T25 com 2 mL de fator de fixação por frasco.
    7. Ressuspenda o pellet celular com 20 mL de meio iHCPEnC.
    8. Distribua 5 mL da suspensão da célula para cada um dos 4 frascos preparados.
    9. Novamente, cultive as células por 1 semana sem mudar o meio. Eles atingirão a confluência em 1 semana.
      NOTA: As células iHCPEnC são inibidas pelo crescimento; portanto, o frasco se tornará confluente e as células restantes flutuarão.

4. Preparativos para experimentos de co-cultura

  1. Método 1: Para a "cocultura direta" (cultivo das células epiteliais e endoteliais em ambos os lados de um mesmo inserto), não prepare nada adicional.
  2. Método 2: Para o método "membrana em inserção", execute os seguintes passos:
    1. Fure membranas do tamanho de um filtro de cultura celular de 12 poços com a ajuda de um ferro perfurante nº 11 (correspondente a um diâmetro de 11 mm) de uma membrana Din-A-4 separada.
    2. Coloque membranas perfuradas em uma placa de Petri.
    3. Esterilize as membranas perfuradas por 60 minutos usando luz ultravioleta (UV-C, 254 nm).
      NOTA: Membranas de filtro de cultura celular de 12 poços, do tamanho de inserções, podem ser preparadas previamente e armazenadas em condições estéreis.

5. Estabelecimento da co-cultura

NOTA: Neste estágio, as células HIBCPP já estão preparadas para o modelo de cultivo in vitro do tipo de duas células. As células HIBCPP foram cultivadas por 5 a 6 dias (compare os passos 1.3.8-1.3.12). As células HIBCPP devem começar a desenvolver um TEER (cerca de 20 Ohm·cm 2).

  1. Para ambos, o Método 1 ("cocultura direta") e o Método 2 ("membrana em inserção") substituem o meio de 10% de HIBCPP por meio de 1% de HIBCPP. Para esse fim, coloque 2 mL de meio HIBCPP a 1% em um poço de uma placa de cultura celular de 12 poços.
  2. Esvazie o inserto do filtro contendo a cultura invertida com a ajuda de uma pipeta e pinças, e coloque o inserto do filtro na orientação padrão no 12-poço preparado.
  3. Para o Método 2 ("membrana em inserção"), prepare os insertos de filtro da seguinte forma:
    1. Coloque a membrana perfurada e esterilizada em um filtro preparado de 12 poços com células de HIBCPP em cultura invertida, com a ajuda de pinças.
  4. Coloque as placas de cultura celular de volta na incubadora para a tripsinização do iHCPEnC (descrito abaixo do passo 6).

6. Semeadura e cultivo de iHCPEnC em co-cultura

NOTA: Na seção a seguir, é descrito o estabelecimento de uma cocultura de células HIBCPP e iHCPEnC em inserções de filtro de cultura celular de 12 poços. Um protocolo detalhado para co-cultura de células HIBCPP e iHCPEnC em inserções de filtro de cultura celular de 24 poços já foi descritoanteriormente 8. Antes de descolar o iHCPEnC, calcule quantas células são necessárias para realizar a cocultura. Um frasco de cultura de células T25 confluente fornecerá uma quantidade aproximada de 5 × 105 células.

  1. Remova o meio de um frasco T25 confluente contendo iHCPEnC.
  2. Lave o iHCPEnC com 3 mL de PBS. Evite o descolamento das células.
  3. Remova o PBS.
  4. Descolhe o iHCPEnC confluente com a ajuda de 1 mL de Tripsina-EDTA. Essa etapa leva cerca de 3 a 5 minutos no tempo de descanso.
  5. Resuspenda as células em um frasco de 5 mL/T25 com meio iHCPEnC.
  6. Conte as células em uma câmara de Neubauer.
  7. Centrifuge a 500 × g por 5 minutos em RT.
  8. Resuspenda o pellet celular até uma concentração final de 1 × 105 células/mL em meio iHCPEnC.
  9. Tanto o Método 1 ("cocultura direta") quanto o Método 2 ("membrana na inserção"): semente 700 μL iHCPEnC (7x105 células) em um filtro de 12 poços.
  10. Monitore os valores TEER da cocultura e dos controles (ou seja, culturas apenas de células HIBCPP e iHCPEnC) pela primeira vez, 24 horas após a semente do iHCPEnC e depois diariamente.

7. Tratamento com LPS

NOTA: Co-culturas devem apresentar valores TEER mais altos em comparação com culturas exclusivas de células HIBCPP (fator sugerido: 1,5 ou superior).

  1. Meda e registre os valores TEER dos insertos de cultura celular montados para experimentos.
  2. Prepare uma mistura master contendo 5 μg/mL LPS em meio de 1% de HIBCPP.
  3. Prepare novas placas de 12 poços contendo 2 mL de meio HIBCPP a 1% por poço.
  4. Esvazie as inserções com a ajuda de pinças e pipeteamento.
  5. Coloque os insertos nos poços preparados.
  6. Adicione 1 mL do master mix LPS ou meio HIBCPP a 1%, respectivamente (controle negativo).
  7. Incube por 4 horas a 37 °C.
  8. Meça e registre os valores TEER antes de prosseguir para a seção 8.

8. Isolamento separado de RNA das células HIBCPP e do iHCPEnC para análise transcricional subsequente

NOTA: Para obter duas frações celulares separadas e evitar contaminação cruzada de células cultivadas no modelo de cocultura, as frações celulares são cuidadosamente raspadas separadamente do inserto. Realize todas as etapas do isolamento de RNA para cada inserção de filtro sem interrupção (as inserções não podem ficar sem filtro).

  1. Lave as inserções do filtro uma vez com PBS. Para esse fim, prepare placas de cultura celular de 12 poços contendo 1,5 mL PBS/poço.
  2. Esvazie os insertos do filtro de cultura celular com a ajuda de uma pipeta e pinças. Coloque os insertos na placa de cultura celular de 12 poços preenchida com PBS.
  3. Adicione 1 mL de PBS nos inserts.
  4. Para preparar as células iHCPEnC e HIBCPP para o Método 1 ("cocultura direta"), execute os seguintes passos:
    1. Remova o PBS do insert e coloque-o em uma placa de cultura celular vazia e seca de 12 poços.
    2. Com a ajuda de uma ponta de pipeta e a pipeteação de 10-20 μL de PBS, os iHCPEnC são destacados do inserto por raspagem.
    3. Coloque essa fração celular em um tubo de 1,5 mL contendo 350 μL de tampão de lise de RNA. Pipete para cima e para baixo para misturar as células corretamente com o tampão de lise de RNA.
    4. Após a colheita da fração de iHCPEnC ser concluída, vire o inserto de cabeça para cima na tampa de uma placa de cultura celular.
    5. Retire as células de HIBCPP da membrana, assim como a fração iHCPEnC, e coloque-as em um tubo preparado de 1,5 mL contendo 350 μL de RLT-β-mercaptoetanol.
      NOTA: Se múltiplas coculturas forem preparadas para uma condição, retire 350 μL de tampão de lise de RNA por inserto e fração celular. Frações de célula única preparadas de uma condição específica são purificadas consecutivamente na mesma coluna.
  5. Para preparar as células iHCPEnC e HIBCPP para o Método 2 ("membrana em inserção"), execute os seguintes passos:
    1. Retire a membrana adicional com a ajuda de pinças e coloque-a em uma tampa seca de uma placa de cultura celular de 12 poços. Pipete 100 μL de lise de RNA buffer sobre a membrana para lise do iHCPEnC.
    2. Coloque esse lisato de 100 μL em um tubo de 1,5 mL contendo 250 μL de tampão de lise de RNA e misture bem.
    3. Remova o PBS do filtro inserido e coloque-o de cabeça para cima na tampa de uma placa de cultura celular de 12 poços. Adicione 100 μL de tampão de lise de RNA à membrana do inserto e lisa a fração da célula HIBCPP.
    4. Coloque esse lisato de 100 μL em um tubo de 1,5 mL contendo 250 μL de tampão de lise de RNA.
  6. Realize o isolamento de RNA de acordo com o protocolo do fabricante.
  7. Meça a quantidade de RNA usando um espectrofotômetro.
  8. Realize a transcrição reversa e análise qPCR das amostras de RNA conforme descrito pelo fabricante.
    NOTA: Como as coculturas contêm menos quantidades de iHCPEnC em comparação com células HIBCPP, são necessários vários inserts de filtro de 12 poços para o isolamento de RNA suficiente do iHCPEnC, dependendo da análise subsequente. Os lisados de RNA dos distintos insertos de filtro precisam ser agrupados. Transcrição reversa e qPCR podem ser realizadas conforme descritoanteriormente 6.

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Resultados

Neste protocolo, descrevemos a geração passo a passo de um modelo do tipo duas células da PC humana composto por epitélio (células HIBCPP) e endotélio (iHCPEnC) em inserções de filtro de cultura celular, conforme mostrado esquematicamente na Figura 1. Neste sistema modelo, as células HIBCPP são cultivadas de forma invertida no lado inferior do filtro, enquanto as iHCPEnC são semeadas seja no lado superior do filtro do inserto ou em um segundo filtro colocado...

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Discussão

A PC humana consiste em vários tipos celulares diferentes, incluindo um epitélio formador de barreira e um endotélio da vasculaturaestendida 3. Embora as células endoteliais da PC sejam fenestradas, pesquisas recentes demonstraram sua contribuição para a função da barreira noBCSFB 4,7. Para estudar as interações intrincadas entre o endotélio e o epitélio em órgãos como a CP, são necessários modelos in ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% Tripsina-EDTALife Technologies 25200056
Placa de cultura celular de 12 poços  StarLabCC7682-7512
Inserções de filtro de 12 poços (3 & micro; M poros)Greiner Bio One665631
Placa de cultura celular de 24 poços  StarLabCC7672-7524
inserção do filtro de 24 poços   (0.4 & micro; M poros)Greiner Bio One662641
Inserto de filtro de 24 poços (3 & micro; M poros)Greiner Bio One662631
Placa de cultura celular de 6 poços  StarLabCC7682-7506
Kit de Síntese de cDNA AffinityScript (Síntese de cDNA)Agilent600559
Fator de LigaçãoSistemas de Células4ZO-500Parte do kit completo Classic Endothelial Medium.
Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix (PCR em tempo real)Agilent600828
Eletrodo de hashisMilliporeMERSSTX01Este produto foi descontinuado.
Meio Endotelial Clássico Completo (meio iHCPEnC)Sistemas de Células4ZO-500Kit contendo um meio, suplementos e Fator de Fixação para revestimento.
DMEM/F-12 (1:1) com fenolado (médio HIBCPP 10%)Thermo Fisher31330-038
DMEM/F-12 (1:1) sem fenolado (médio HIBCPP a 1%)Thermo Fisher11039-021
Soro de Panturreiro Fetal (FCS) (1% e 10% médio HIBCPP)Thermo Fisher10270-106
Insulina (média de HIBCPP 1% e 10%)SigmaI9278
Lipopolissacarídeo (LPS)SigmaL3024
MilliCell ERS2 MilliporeMERS00002Este produto foi descontinuado.
Nanodrop (espectrofotômetro)Termo CientíficaND1000Este produto foi descontinuado.
Ferro perfurante nº 11Wü rth880223211
PBSLife Technologies 14190169
Ferramenta de design de primersNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Primers SigmaVC00021
Qiagen RNeasy microQiagen74004
RLT+b-ME (parte do kit micro Qiagen Rneasy)Qiagen74004
Frasco de cultura celular T25Sarstedt AG & Co KG83,39,10,002
Frasco de cultura celular T75Sarstedt AG & Co KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3,0 cc (membrana separada)SabeuSK4580
Luz UVCarl RothH469.1

Referências

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