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Artigo de método
Foi estabelecida uma co-cultura de células epiteliais e endoteliais humanas do plexo coroide para gerar um modelo avançado in vitro da barreira hematocefalorraquidiana da barreira. Descrevemos o isolamento separado do epitélio e do endotélio para preparação subsequente de RNA e análise transcricional sob condições selecionadas.
O plexo coróide (PC) altamente perfundido, localizado no sistema ventricular do cérebro, consiste em vários componentes estruturais, incluindo um epitélio cúbico e um endotélio fenestrado, e é o local da barreira hematocefalorraquidiana (BCSFB). Para investigar a PC in vitro, são possíveis várias configurações de cultura celular. Um modelo de filtro de cultura celular invertido com forte função de barreira, baseado em células de papiloma epitelial CP humano (HIBCPP), foi estabelecido por nosso laboratório e é amplamente utilizado. Recentemente, conseguimos gerar uma linha celular endotelial CP humana estável e imortalizada (iHCPEnC). Combinando ambas as linhagens celulares, montamos um modelo avançado funcional do tipo duas células que desenvolveu uma função de barreira aumentada em comparação apenas com as células HIBCPP. Como esse modelo representa tanto o epitélio da CP quanto o endotélio, ele permite a investigação da interação entre os dois tipos celulares sob condições selecionadas, como infecção, inflamação ou outras. Neste protocolo, descrevemos métodos para configurar esse modelo do tipo duas células com a separação subsequente das células epiteliais e endoteliais para análises transcricionais. Descrevemos primers de PCR específicos para epitélio e endotélio, que servem para detectar possível contaminação cruzada entre os dois tipos celulares. Para investigar um possível impacto do endotélio da CP no epitélio neste modelo sob condições inflamatórias, os níveis de expressão de genes selecionados no contexto do tratamento com lipopolissacarídeos (LPS) foram analisados na fração celular de HIBCPP. O modelo avançado de PC in vitro e a possibilidade de analisar separadamente respostas epiteliais e endoteliais são de grande interesse para pesquisas sobre processos celulares envolvendo funções biológicas e patológicas da PC.
O plexo coroide (PC) é um conglomerado altamente vascularizado de diferentes populações celulares localizadas em todos os quatro ventrículos do cérebro. Entre outras funções, ele atua como uma barreira fisiológica, a chamada barreira do líquido hematocefalorraquidiano (BCSFB), entre o sistema nervoso central (SNC) e o sangue, impedindo que o cérebro, por exemplo, substâncias infecciosas circulem no sangue. A PC consiste em diferentes tipos celulares, incluindo as células epiteliais polarizadas, contendo junções apertadas e de aderência, bem como desmossomosmos, que estão sobre uma membrana basal. A superfície das células epiteliais é ....
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1. Células HIBCPP
NOTA: A seguir, descrevemos a cultura e manutenção de células HIBCPP, bem como a preparação de inserções de filtros de cultura celular invertida com células HIBCPP. Este protocolo foi projetado para o crescimento de células HIBCPP em inserções de filtro de cultura celular de 12 poços. Um protocolo detalhado com vídeo acompanhante para cultivo de células HIBCPP em inserções de filtros de cultura celular de 24 poços foi publicado anteriormente9.
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Neste protocolo, descrevemos a geração passo a passo de um modelo do tipo duas células da PC humana composto por epitélio (células HIBCPP) e endotélio (iHCPEnC) em inserções de filtro de cultura celular, conforme mostrado esquematicamente na Figura 1. Neste sistema modelo, as células HIBCPP são cultivadas de forma invertida no lado inferior do filtro, enquanto as iHCPEnC são semeadas seja no lado superior do filtro do inserto ou em um segundo filtro colocado.......
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A PC humana consiste em vários tipos celulares diferentes, incluindo um epitélio formador de barreira e um endotélio da vasculaturaestendida 3. Embora as células endoteliais da PC sejam fenestradas, pesquisas recentes demonstraram sua contribuição para a função da barreira noBCSFB 4,7. Para estudar as interações intrincadas entre o endotélio e o epitélio em órgãos como a CP, são necessários modelos in .......
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Os autores declaram que não têm conflito de interesses.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Placa de cultura celular de 12 poços | StarLab | CC7682-7512 | |
| Inserções de filtro de 12 poços (3 & micro; M poros) | Greiner Bio One | 665631 | |
| Placa de cultura celular de 24 poços | StarLab | CC7672-7524 | |
| inserção do filtro de 24 poços (0.4 & micro; M poros) | Greiner Bio One | 662641 | |
| Inserto de filtro de 24 poços (3 & micro; M poros) | Greiner Bio One | 662631 | |
| Placa de cultura celular de 6 poços | StarLab | CC7682-7506 | |
| Kit de Síntese de cDNA AffinityScript (Síntese de cDNA) | Agilent | 600559 | |
| Fator de Ligação | Sistemas de Células | 4ZO-500 | Parte do kit completo Classic Endothelial Medium. |
| Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix (PCR em tempo real) | Agilent | 600828 | |
| Eletrodo de hashis | Millipore | MERSSTX01 | Este produto foi descontinuado. |
| Meio Endotelial Clássico Completo (meio iHCPEnC) | Sistemas de Células | 4ZO-500 | Kit contendo um meio, suplementos e Fator de Fixação para revestimento. |
| DMEM/F-12 (1:1) com fenolado (médio HIBCPP 10%) | Thermo Fisher | 31330-038 | |
| DMEM/F-12 (1:1) sem fenolado (médio HIBCPP a 1%) | Thermo Fisher | 11039-021 | |
| Soro de Panturreiro Fetal (FCS) (1% e 10% médio HIBCPP) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Insulina (média de HIBCPP 1% e 10%) | Sigma | I9278 | |
| Lipopolissacarídeo (LPS) | Sigma | L3024 | |
| MilliCell ERS2 | Millipore | MERS00002 | Este produto foi descontinuado. |
| Nanodrop (espectrofotômetro) | Termo Científica | ND1000 | Este produto foi descontinuado. |
| Ferro perfurante nº 11 | Wü rth | 880223211 | |
| PBS | Life Technologies | 14190169 | |
| Ferramenta de design de primers | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ | |
| Primers | Sigma | VC00021 | |
| Qiagen RNeasy micro | Qiagen | 74004 | |
| RLT+b-ME (parte do kit micro Qiagen Rneasy) | Qiagen | 74004 | |
| Frasco de cultura celular T25 | Sarstedt AG & Co KG | 83,39,10,002 | |
| Frasco de cultura celular T75 | Sarstedt AG & Co KG | 83,39,11,002 | |
| TRAKETCH PET 3,0 cc (membrana separada) | Sabeu | SK4580 | |
| Luz UV | Carl Roth | H469.1 |
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