Mecanismo Molecular do Hidroxilo Cártamo Amarelo A na Osteoartrite do Joelho através da Modulação da Autofagia via Inibição da Via HIF-1α/BNIP3

Como condição ortopédica crônica prevalente, a osteoartrite do joelho (OAJ) acomete indivíduos de meia-idade e idosos, impactando significativamente sua qualidade de vida ^1,2. Apesar de sua ocorrência generalizada, a etiologia precisa e os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à OAJ permanecem incompletamente compreendidos. Além disso, tanto para a prevenção quanto para o tratamento curativo, ressalta a urgência de desvendar os intrincados fundamentos patológicos dessa condição. Uma área de interesse emergente é o papel da autofagia na homeostase da cartilagem, com evidências acumuladas sugerindo que a autofagia reduzida dentro do tecido cartilaginoso contribui para sua degeneração em OAJ ^3,4.

A autofagia, um processo de degradação celular vital para a manutenção da homeostase celular, é de grande importância na manutenção e reparo da cartilagem. No microambiente hipóxico prevalente na cartilagem articular, a via de sinalização do fator induzível por hipóxia 1α (HIF-1α)/adenovírus E1B 19 kDa da proteína de interação 3 (BNIP3) emerge como um regulador fundamental da autofagia. A expressão elevada de HIF-1α foi observada em pacientes com OAJ, sugerindo que a desregulação dessa via pode contribuir para a autofagia prejudicada e subsequente degeneração da cartilagem ^5,6,7.

Acupuntura, moxabustão, ervas e massagem são quatro métodos clássicos da medicina tradicional chinesa para o tratamento da artrite do joelho. Os tratamentos atuais, como anti-inflamatórios não esteroidais, injeções de ácido hialurônico e artroplastia, têm se mostrado úteis, mas também associados a certos efeitos^colaterais8. Além disso, não há tratamento de rotina recomendado para a osteoartrite do joelho. Com o tempo, como uma terapia complementar comum para KOA, a Medicina Tradicional Chinesa (MTC) desenvolveu vários remédios fitoterápicos que se mostram promissores no tratamento de KOA⁹. Entre estes, o amarelo de cártamo hidroxila A tem atraído atenção significativa devido às suas propriedades anti-inflamatórias e moduladoras da autofagia^10,11. No entanto, os mecanismos exatos pelos quais a HSYA exerce sua influência terapêutica na osteoartrite do joelho (OAJ), particularmente em termos de regulação da autofagia através da via HIF-1α / BNIP3, permanecem incertos. Portanto, investigamos o mecanismo dos efeitos terapêuticos do HSYA na OA, concentrando-nos em seu impacto na autofagia dos condrócitos e sua interação com a via HIF-1α / BNIP3. Nossa hipótese é que o HSYA mitiga a osteoartrite do joelho, aumentando a autofagia e a proliferação dos condrócitos, enquanto suprime a apoptose e a inflamação por meio da inibição da via HIF-1α / BNIP3.

Todos os procedimentos envolvendo amostras humanas foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Popular Central de Zhanjiang (Aprovação nº. KY-YS-2021-09). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da coleta da amostra. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Pacientes e desenho do estudo

Trinta pacientes diagnosticados com osteoartrite de joelho (OAJ) e submetidos a artroplastia total do joelho foram recrutados. A coorte incluiu 14 homens e 16 mulheres, com idades entre 52 e 75 anos (média ± DP: 64,3 ± 12,6 anos), todos preenchendo os critérios KOA do American College of Rheumatology¹². Os pacientes foram excluídos se tivessem recebido anti-inflamatórios não esteroidais ou esteróides dentro de 2 semanas antes da cirurgia ou injeções intra-articulares dentro de 1 mês.

2. Cultura primária de condrócitos

A cartilagem articular foi coletada em condições estéreis imediatamente após a cirurgia e colocada em PBS frio. Usando bisturis estéreis, a cartilagem foi cortada em fragmentos de ~ 1 mm³ em uma placa de vidro gelada e transferida para um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 10 mL de tripsina-EDTA a 0,25%. O tubo foi incubado em banho-maria agitado a 37 °C a 80 rpm por 30 min e invertido suavemente a cada 5 min para facilitar a digestão. O sobrenadante foi aspirado e o pellet de tecido foi lavado uma vez com PBS e centrifugado a 200 × g por 5 min. O pellet foi então ressuspenso em 10 mL de colagenase tipo II a 0,02% e digerido a 37 °C por 4 h com agitação. A suspensão foi pipetada para cima e para baixo a cada 30 min para promover a dissociação, passada por um filtro de 70 μm e centrifugada novamente a 200 × g por 5 min. O pellet resultante foi ressuspenso em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina e semeado em frascos T25. As células foram incubadas a 37 °C com 5% de CO₂, o meio foi substituído a cada 2-3 dias e as células das passagens 1-2 foram usadas para experimentos. Os grupos experimentais incluíram controle normal, modelo em branco, HSYA (100 μmol/L), inibidor de HIF-1α YC-1 (10 μmol/L), rapamicina (10 nmol/L), HSYA + YC-1 e HSYA + rapamicina.

3. HIF-lα mediado por siRNA, nocaute de BNIP3

Os condrócitos primários foram semeados em placas de 6 poços a 2-5 × 10⁵ células/poço e cultivados a 37 °C até atingirem 30%-50% de confluência. Para cada poço, 5 μL de siRNA 20 μM foram diluídos em 250 μL de Opti-MEM, e 5 μL de reagente de transfecção à base de lipídios foram diluídos separadamente em 250 μL de Opti-MEM. As duas soluções foram suavemente misturadas e incubadas à temperatura ambiente por 15-20 min para formar complexos. O meio de cultura foi substituído por 1,5 mL de DMEM fresco com 10% de FBS, e o complexo siRNA-lipídico (500 μL) foi adicionado gota a gota ao longo da parede do poço com redemoinho suave. As células foram incubadas por 6 h, o meio foi substituído por meio completo e a cultura foi continuada por 48-72 h. A eficiência de knockdown foi verificada por qRT-PCR e Western blot antes de novos tratamentos.

4. ELISA

Os sobrenadantes de cultura de células foram coletados, centrifugados a 200 × g por 5 min e diluídos 1:2 em tampão de ensaio quando necessário. Foram utilizados kits ELISA para IL-1β, TNF-α e IL-6 de acordo com o protocolo do fabricante. Padrões, brancos e amostras foram executados em triplicata. Após a reação do substrato, a absorbância foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas em 15 min.

5. Ensaio MTT

Os condrócitos foram semeados em placas de 96 poços a 5.000 células/poço em 100 μL de meio completo e incubados por 0 h, 24 h, 48 h ou 72 h. Em cada ponto de tempo, 20 μL de solução de MTT (5 mg / mL em PBS) foram adicionados diretamente a cada poço, e as placas foram incubadas a 37 ° C por 30 min até que cristais de formazan roxo se tornassem visíveis no fundo dos poços. O sobrenadante foi aspirado cuidadosamente sem perturbar os cristais, 150 μL de DMSO foram adicionados a cada poço e as placas foram colocadas em um agitador a 100 rpm por 10 min para dissolver completamente os cristais. A absorbância foi medida a 490 nm usando um leitor de microplacas. O curto tempo de incubação foi selecionado para evitar a saturação de sinal em células altamente metabolicamente ativas.

6. Citometria de fluxo

As células foram colhidas por tripsinização, centrifugadas a 200 × g por 5 min e lavadas duas vezes com PBS frio. Eles foram ressuspensos em 500 μL de tampão de ligação a ~ 1 × 10⁶ células / mL, e 5 μL de anexina V-FITC e 5 μL de PI foram adicionados. Após uma mistura suave, as células foram incubadas por 15 min em temperatura ambiente no escuro. As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo, com pelo menos 10.000 eventos coletados por amostra (excitação 488 nm, emissão FITC 530/30 nm, PI > 600 nm). As células apoptóticas foram quantificadas usando software padrão.

7. Western blotting

As células foram enxaguadas duas vezes com PBS frio e lisadas em tampão RIPA de 200 μL contendo inibidores de protease em gelo por 30 min. As células foram raspadas com um raspador de plástico, pipetadas para cima e para baixo para reduzir a viscosidade e centrifugadas a 12.000 × g por 10 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram coletados e as concentrações de proteínas foram medidas usando o ensaio BCA. Quantidades iguais de proteína (30 μg) foram misturadas com tampão de carga 5×, aquecidas a 95 °C por 5 min e separadas em géis SDS-PAGE a 10%-12%. A eletroforese foi executada a 80 V para empilhamento e 120 V para separação, e as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF a 300 mA por 90 min. As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% por 1 h em temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários (1:1.000). Após três lavagens com TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP (1:5.000) por 1 h à temperatura ambiente. As bandas de proteínas foram visualizadas com substrato ECL e fotografadas usando um sistema de detecção de quimioluminescência com exposição de 30-120 s. As intensidades das bandas foram quantificadas usando o ImageJ, e o GAPDH foi usado como controle de carga.

8. Coloração de monodansilcadaverina (MDC)

Uma solução de trabalho MDC de 50 μM foi preparada a partir da solução estoque imediatamente antes do uso. As células foram fixadas com 1 mL de paraformaldeído a 4% por 10 min em temperatura ambiente, lavadas duas vezes com PBS e incubadas com 500 μL de solução de trabalho MDC por 30 min a 37 ° C no escuro. Após duas lavagens com PBS, as lamínulas foram montadas com meio de montagem antidesbotamento e observadas em microscópio de fluorescência (excitação 355 nm, emissão 512 nm).

9. Microscópio Eletrônico de Transmissão (TEM)

As células foram colhidas e peletizadas por centrifugação a 200 × g por 5 min, depois fixadas em glutaraldeído a 2% a 4 °C durante a noite. As amostras foram lavadas três vezes com PBS por 5 min cada e pós-fixadas em tetróxido de ósmio a 1% por 1 h a 4 °C em capela. A desidratação foi realizada por meio de uma série graduada de acetona de 30%, 50%, 70%, 90% e 100% por 10 min cada. As amostras foram infiltradas com acetona/resina epóxi 1:1 por 1 h e depois com resina pura durante a noite. O embutimento foi realizado em resina fresca e polimerizado a 60 °C por 48 h. Seções ultrafinas de 50-70 nm foram cortadas com um ultramicrótomo, montadas em grades de cobre de 200 malhas, coradas com acetato de uranila a 2% por 30 min seguidas de citrato de chumbo por 15 min, lavadas com água destilada, secas ao ar e examinadas em microscópio eletrônico de transmissão a 80 kV. Como nota de segurança, o glutaraldeído e o tetróxido de ósmio são tóxicos e voláteis e devem ser manuseados apenas em uma capela com luvas e óculos de proteção. Os resíduos devem ser descartados em recipientes perigosos designados de acordo com os protocolos de segurança institucionais.

10. Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os dados são expressos como média ± DP. A significância estatística foi avaliada por meio de ANOVA de uma via seguida de teste post-hoc de LSD, com P < 0,05 considerado significativo.

Efeito do HSYA na expressão de citocinas pró-inflamatórias de condrócitos (IL-1β, TNF-α, IL-6)
Em comparação com o grupo controle normal, todos os outros grupos apresentaram níveis significativamente elevados de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, TNF-α e IL-6) (P < 0,05, Tabela 1, Figura 1A-G). O tratamento com HSYA, inibidor de HIF-1α, indutor de autofagia, inibidor de HSYA + HIF-1α ou HSYA + indutor de autofagia reduziu significativamente os níveis de citocinas em relação ao grupo modelo em branco (P < 0,05). Entre estes, os tratamentos combinados (HSYA + inibidor de HIF-1α ou HSYA + indutor de autofagia) reduziram ainda mais a expressão de citocinas, com reduções de aproximadamente 35%-40% em comparação com o grupo modelo (P < 0,05). Nos experimentos de interferência gênica (Figura 1H-J), o knockdown de siRNA de HIF-1α ou BNIP3 levou a reduções de ~ 25% -30% nos níveis de citocinas em comparação com o modelo + grupo em branco. O tratamento com HSYA aumentou ainda mais esses efeitos. Especificamente, os níveis de citocinas no grupo siHIF-1α + HSYA foram ~ 20% menores do que no grupo siHIF-1α + branco, e os níveis no grupo siBNIP3 + HSYA foram ~ 22% menores do que no grupo siBNIP3 + branco (P < 0,05).

Efeito do HSYA na proliferação de condrócitos
O grupo controle normal exibiu atividade de proliferação basal, enquanto o grupo modelo branco mostrou uma redução significativa (P < 0,05, Figura 2A). A proliferação foi parcialmente restaurada após o tratamento com HSYA, inibidor de HIF-1α ou indutor de autofagia, e acentuadamente aumentada por tratamentos combinados com HSYA + inibidor de HIF-1α ou HSYA + indutor de autofagia (P < 0,05). Nos experimentos de siRNA (Figura 2B), o knockdown de HIF-1α ou BNIP3 promoveu a proliferação em ~ 25% em comparação com o grupo de controle do modelo. O tratamento com HSYA aumentou ainda mais a proliferação, resultando em uma proliferação ~ 40% maior em comparação com o grupo modelo (P < 0,05).

Efeito da HSYA na apoptose e na expressão de proteínas relacionadas à autofagia em condrócitos
A análise de Western blot revelou diferenças significativas na expressão proteica entre os grupos (Tabela 2). O grupo do modelo em branco mostrou regulação positiva acentuada de HIF-1α e expressão reduzida de LC3, P62, Beclin1 e BNIP3 em comparação com os controles (P < 0,05). O tratamento com HSYA, inibidor de HIF-1α ou indutor de autofagia aumentou a expressão de LC3, P62, Beclin1 e BNIP3 e diminuiu os níveis de HIF-1α (P < 0,05). Os tratamentos combinados com HSYA + inibidor de HIF-1α ou HSYA + indutor de autofagia produziram as maiores mudanças, com os níveis de LC3 e Beclin1 quase dobrando em comparação com o grupo modelo em branco. Embora o P62 seja tipicamente reduzido quando a autofagia é ativada, aqui seus níveis aumentaram após o tratamento com HSYA. Isso pode indicar acúmulo aumentado de autofagossomos ou fluxo incompleto, um fenômeno também relatado em estudos anteriores de autofagia de condrócitos.

Efeito da HSYA nas taxas de apoptose em condrócitos
A análise por citometria de fluxo mostrou que o grupo do modelo em branco exibiu uma taxa de apoptose significativamente maior do que o grupo controle normal (P < 0,05, Figura 3A, B). HSYA, inibidor de HIF-1α e indutor de autofagia reduziram a apoptose, enquanto os tratamentos combinados (HSYA + inibidor de HIF-1α ou HSYA + indutor de autofagia) produziram as menores taxas de apoptose, com reduções de ~ 45% -50% em comparação com o grupo modelo em branco (P < 0,05). Nos experimentos de siRNA, a apoptose também foi diminuída pelo knockdown de HIF-1α ou BNIP3 e ainda mais reduzida pelo tratamento com HSYA.

Efeito da HSYA nas taxas de apoptose e formação de vesículas autofágicas em condrócitos
A coloração MDC e a imagem TEM revelaram diferenças claras na formação de vesículas autofágicas entre os grupos ( Figura 4A-D ). O grupo do modelo em branco exibiu uma distribuição esparsa de vesículas, enquanto os tratamentos HSYA, inibidor de HIF-1α ou indutor de autofagia aumentaram o número de vesículas. Os tratamentos combinados (HSYA + inibidor de HIF-1α ou HSYA + indutor de autofagia) produziram o realce mais acentuado, com aproximadamente duas vezes mais vesículas observadas por TEM em comparação com o grupo modelo. Consistente com esses achados, as taxas de apoptose medidas por citometria de fluxo (Figura 5A-E) foram mais baixas nos grupos de tratamento combinado.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Todos os dados gerados neste estudo são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

Figura 1: A expressão de citocinas pró-inflamatórias de condrócitos (IL-1β, TNF-α, IL-6) em cada grupo (n = 3). (AG) Os níveis de expressão proteica de IL-1β, TNF-α e IL-6 foram detectados por Western blotting (WB). (H-J) Os teores de IL-1β, TNF-α e IL-6 foram medidos por ensaio imunoenzimático (ELISA) (P < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Comparação da atividade de proliferação de condrócitos em cada grupo (n = 3). (A) Os grupos tratados e (B) os grupos knockdown HIF-1α e BNIP3, P< 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Comparação da taxa de apoptose de cada grupo (n = 3). (A) 1, grupo normal; 2, Grupo de modelos; 3, grupo HSYA; 4, grupo inibidor de HIF-1α; 5, grupo Autofagia; 6, grupo inibidor HSYA + HIF-1α; 7, HSYA + grupo indutor de autofagia. (B) Os grupos de knockdown dos genes HIF-1α e BNIP3. Em comparação com o grupo controle normal, *P < 0,05. Em comparação com o grupo de modelos em branco, #P< 0,05. Comparado com o grupo inibidor HSYA + HIF-1α, & P< 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagem TEM da formação de vesículas autofágicas nas mitocôndrias. (A) Modelo em branco. (B) Grupo HSYA. (C) Grupo inibidor de HIF-1α. (D) Grupo indutor de autofagia. Barra de escala = 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Efeito do HSYA nas taxas de apoptose celular em cada grupo (n = 3). (A) Modelo em branco. (B) Grupo HSYA. (C) Grupo inibidor de HIF-1α. (D) Grupo indutor de autofagia. (E) A análise total de cada grupo, em comparação com o grupo de controle normal, **P< 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Comparação dos níveis de citocinas pró-inflamatórias em cada grupo. Em comparação com o grupo controle normal, *P < 0,05. Em comparação com o grupo de modelos em branco, #P< 0,05. Em comparação com os grupos tratados com HASY, o inibidor de HIF-1α e o indutor de autofagia, & P< 0,05.

Tabela 2: Comparação das proteínas nos diferentes grupos. Em comparação com o grupo controle normal, *P< 0,05. Em comparação com os grupos tratados com HSYA, o inibidor de HIF-1α e o indutor de autofagia, #P< 0,05.

Arquivo Suplementar 1: Os dados brutos gerados durante o estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.