Mecanismo Molecular do Hidroxilo Cártamo Amarelo A na Osteoartrite do Joelho através da Modulação da Autofagia via Inibição da Via HIF-1α/BNIP3

Resumo

O Hidroxil Cártamo Amarelo A (HSYA) mitiga a osteoartrite do joelho, aumentando a autofagia e a proliferação dos condrócitos, enquanto suprime a apoptose e a inflamação por meio da inibição da via HIF-1α / BNIP3.

Resumo

A redução da autofagia no tecido cartilaginoso está intimamente ligada ao desenvolvimento da osteoartrite do joelho (OAJ), mas os mecanismos pelos quais o hidroxilo amarelo de cártamo A (HSYA) exerce efeitos protetores permanecem incompletamente compreendidos. Neste estudo, os condrócitos humanos de OAJ foram isolados e atribuídos a diferentes grupos de tratamento, incluindo controle normal, modelo em branco, HSYA, inibidor do fator induzível por hipóxia-1α (HIF-1α), indutor de autofagia, HSYA combinado com inibidor de HIF-1α e HSYA combinado com indutor de autofagia. As citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, TNF-α, IL-6) foram quantificadas por ELISA, a expressão proteica de HIF-1α, BNIP3 e marcadores relacionados à autofagia foi examinada por Western blotting, e as vesículas autofágicas nas mitocôndrias foram avaliadas usando coloração monodansilcadaverina e microscopia eletrônica de transmissão. Em comparação com o controle normal, o grupo do modelo em branco mostrou níveis significativamente aumentados de IL-1β, TNF-α, IL-6 e HIF-1α, acompanhados por maiores taxas de apoptose, proliferação reduzida e regulação negativa de proteínas relacionadas à autofagia (P < 0,05). O tratamento com HSYA, inibidor de HIF-1α ou indutor de autofagia regulou significativamente a expressão de proteínas relacionadas à autofagia e reduziu os níveis de citocinas inflamatórias. Além disso, o HSYA combinado com inibidor de HIF-1α ou indutor de autofagia produziu os efeitos mais pronunciados, com reduções acentuadas na liberação de citocinas e apoptose, juntamente com aumento da proliferação de condrócitos e formação de vesículas autofágicas mitocondriais (P < 0,05). Esses achados demonstram que o HSYA exerce efeitos condroprotetores na OAJ, pelo menos em parte, por meio da inibição da via HIF-1α / BNIP3, promovendo assim a autofagia e atenuando a lesão inflamatória nos condrócitos.

Introdução

Como condição ortopédica crônica prevalente, a osteoartrite do joelho (OAJ) acomete indivíduos de meia-idade e idosos, impactando significativamente sua qualidade de vida ^1,2. Apesar de sua ocorrência generalizada, a etiologia precisa e os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à OAJ permanecem incompletamente compreendidos. Além disso, tanto para a prevenção quanto para o tratamento curativo, ressalta a urgência de desvendar os intrincados fundamentos patológicos dessa condição. Uma área de interesse emergente é o papel da autofagia na homeostase da cartilagem, com evidências acumuladas sugerindo que a autofagia reduzida dentro do tecido cartilaginoso contribui para sua degeneração em OAJ ^3,4.

A autofagia, um processo de degradação celular vital para a manutenção da homeostase celular, é de grande importância na manutenção e reparo da cartilagem. No microambiente hipóxico prevalente na cartilagem articular, a via de sinalização do fator induzível por hipóxia 1α (HIF-1α)/adenovírus E1B 19 kDa da proteína de interação 3 (BNIP3) emerge como um regulador fundamental da autofagia. A expressão elevada de HIF-1α foi observada em pacientes com OAJ, sugerindo que a desregulação dessa via pode contribuir para a autofagia prejudicada e subsequente degeneração da cartilagem ^5,6,7.

Acupuntura, moxabustão, ervas e massagem são quatro métodos clássicos da medicina tradicional chinesa para o tratamento da artrite do joelho. Os tratamentos atuais, como anti-inflamatórios não esteroidais, injeções de ácido hialurônico e artroplastia, têm se mostrado úteis, mas também associados a certos efeitos^colaterais8. Além disso, não há tratamento de rotina recomendado para a osteoartrite do joelho. Com o tempo, como uma terapia complementar comum para KOA, a Medicina Tradicional Chinesa (MTC) desenvolveu vários remédios fitoterápicos que se mostram promissores no tratamento de KOA⁹. Entre estes, o amarelo de cártamo hidroxila A tem atraído atenção significativa devido às suas propriedades anti-inflamatórias e moduladoras da autofagia^10,11. No entanto, os mecanismos exatos pelos quais a HSYA exerce sua influência terapêutica na osteoartrite do joelho (OAJ), particularmente em termos de regulação da autofagia através da via HIF-1α / BNIP3, permanecem incertos. Portanto, investigamos o mecanismo dos efeitos terapêuticos do HSYA na OA, concentrando-nos em seu impacto na autofagia dos condrócitos e sua interação com a via HIF-1α / BNIP3. Nossa hipótese é que o HSYA mitiga a osteoartrite do joelho, aumentando a autofagia e a proliferação dos condrócitos, enquanto suprime a apoptose e a inflamação por meio da inibição da via HIF-1α / BNIP3.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras humanas foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Popular Central de Zhanjiang (Aprovação nº. KY-YS-2021-09). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da coleta da amostra. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Pacientes e desenho do estudo

Trinta pacientes diagnosticados com osteoartrite de joelho (OAJ) e submetidos a artroplastia total do joelho foram recrutados. A coorte incluiu 14 homens e 16 mulheres, com idades entre 52 e 75 anos (média ± DP: 64,3 ± 12,6 anos), todos preenchendo os critérios KOA do American College of Rheumatology¹². Os pacientes foram excluídos se tivessem recebido anti-inflamatórios não esteroidais ou esteróides dentro de 2 semanas antes da cirurgia ou injeções intra-articulares dentro de 1 mês.

2. Cultura primária de condrócitos

A cartilagem articular foi coletada em condições estéreis imediatamente após a cirurgia e colocada em PBS frio. Usando bisturis estéreis, a cartilagem foi cortada em fragmentos de ~ 1 mm³ em uma placa de vidro gelada e transferida para um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 10 mL de tripsina-EDTA a 0,25%. O tubo foi incubado em banho-maria agitado a 37 °C a 80 rpm por 30 min e invertido suavemente a cada 5 min para facilitar a digestão. O sobrenadante foi aspirado e o pellet de tecido foi lavado uma vez com PBS e centrifugado a 200 × g por 5 min. O pellet foi então ressuspenso em 10 mL de colagenase tipo II a 0,02% e digerido a 37 °C por 4 h com agitação. A suspensão foi pipetada para cima e para baixo a cada 30 min para promover a dissociação, passada por um filtro de 70 μm e centrifugada novamente a 200 × g por 5 min. O pellet resultante foi ressuspenso em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina e semeado em frascos T25. As células foram incubadas a 37 °C com 5% de CO₂, o meio foi substituído a cada 2-3 dias e as células das passagens 1-2 foram usadas para experimentos. Os grupos experimentais incluíram controle normal, modelo em branco, HSYA (100 μmol/L), inibidor de HIF-1α YC-1 (10 μmol/L), rapamicina (10 nmol/L), HSYA + YC-1 e HSYA + rapamicina.

3. HIF-lα mediado por siRNA, nocaute de BNIP3

Os condrócitos primários foram semeados em placas de 6 poços a 2-5 × 10⁵ células/poço e cultivados a 37 °C até atingirem 30%-50% de confluência. Para cada poço, 5 μL de siRNA 20 μM foram diluídos em 250 μL de Opti-MEM, e 5 μL de reagente de transfecção à base de lipídios foram diluídos separadamente em 250 μL de Opti-MEM. As duas soluções foram suavemente misturadas e incubadas à temperatura ambiente por 15-20 min para formar complexos. O meio de cultura foi substituído por 1,5 mL de DMEM fresco com 10% de FBS, e o complexo siRNA-lipídico (500 μL) foi adicionado gota a gota ao longo da parede do poço com redemoinho suave. As células foram incubadas por 6 h, o meio foi substituído por meio completo e a cultura foi continuada por 48-72 h. A eficiência de knockdown foi verificada por qRT-PCR e Western blot antes de novos tratamentos.

4. ELISA

Os sobrenadantes de cultura de células foram coletados, centrifugados a 200 × g por 5 min e diluídos 1:2 em tampão de ensaio quando necessário. Foram utilizados kits ELISA para IL-1β, TNF-α e IL-6 de acordo com o protocolo do fabricante. Padrões, brancos e amostras foram executados em triplicata. Após a reação do substrato, a absorbância foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas em 15 min.

5. Ensaio MTT

Os condrócitos foram semeados em placas de 96 poços a 5.000 células/poço em 100 μL de meio completo e incubados por 0 h, 24 h, 48 h ou 72 h. Em cada ponto de tempo, 20 μL de solução de MTT (5 mg / mL em PBS) foram adicionados diretamente a cada poço, e as placas foram incubadas a 37 ° C por 30 min até que cristais de formazan roxo se tornassem visíveis no fundo dos poços. O sobrenadante foi aspirado cuidadosamente sem perturbar os cristais, 150 μL de DMSO foram adicionados a cada poço e as placas foram colocadas em um agitador a 100 rpm por 10 min para dissolver completamente os cristais. A absorbância foi medida a 490 nm usando um leitor de microplacas. O curto tempo de incubação foi selecionado para evitar a saturação de sinal em células altamente metabolicamente ativas.

6. Citometria de fluxo

As células foram colhidas por tripsinização, centrifugadas a 200 × g por 5 min e lavadas duas vezes com PBS frio. Eles foram ressuspensos em 500 μL de tampão de ligação a ~ 1 × 10⁶ células / mL, e 5 μL de anexina V-FITC e 5 μL de PI foram adicionados. Após uma mistura suave, as células foram incubadas por 15 min em temperatura ambiente no escuro. As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo, com pelo menos 10.000 eventos coletados por amostra (excitação 488 nm, emissão FITC 530/30 nm, PI > 600 nm). As células apoptóticas foram quantificadas usando software padrão.

7. Western blotting

As células foram enxaguadas duas vezes com PBS frio e lisadas em tampão RIPA de 200 μL contendo inibidores de protease em gelo por 30 min. As células foram raspadas com um raspador de plástico, pipetadas para cima e para baixo para reduzir a viscosidade e centrifugadas a 12.000 × g por 10 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram coletados e as concentrações de proteínas foram medidas usando o ensaio BCA. Quantidades iguais de proteína (30 μg) foram misturadas com tampão de carga 5×, aquecidas a 95 °C por 5 min e separadas em géis SDS-PAGE a 10%-12%. A eletroforese foi executada a 80 V para empilhamento e 120 V para separação, e as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF a 300 mA por 90 min. As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% por 1 h em temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários (1:1.000). Após três lavagens com TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP (1:5.000) por 1 h à temperatura ambiente. As bandas de proteínas foram visualizadas com substrato ECL e fotografadas usando um sistema de detecção de quimioluminescência com exposição de 30-120 s. As intensidades das bandas foram quantificadas usando o ImageJ, e o GAPDH foi usado como controle de carga.

8. Coloração de monodansilcadaverina (MDC)

Uma solução de trabalho MDC de 50 μM foi preparada a partir da solução estoque imediatamente antes do uso. As células foram fixadas com 1 mL de paraformaldeído a 4% por 10 min em temperatura ambiente, lavadas duas vezes com PBS e incubadas com 500 μL de solução de trabalho MDC por 30 min a 37 ° C no escuro. Após duas lavagens com PBS, as lamínulas foram montadas com meio de montagem antidesbotamento e observadas em microscópio de fluorescência (excitação 355 nm, emissão 512 nm).

9. Microscópio Eletrônico de Transmissão (TEM)

As células foram colhidas e peletizadas por centrifugação a 200 × g por 5 min, depois fixadas em glutaraldeído a 2% a 4 °C durante a noite. As amostras foram lavadas três vezes com PBS por 5 min cada e pós-fixadas em tetróxido de ósmio a 1% por 1 h a 4 °C em capela. A desidratação foi realizada por meio de uma série graduada de acetona de 30%, 50%, 70%, 90% e 100% por 10 min cada. As amostras foram infiltradas com acetona/resina epóxi 1:1 por 1 h e depois com resina pura durante a noite. O embutimento foi realizado em resina fresca e polimerizado a 60 °C por 48 h. Seções ultrafinas de 50-70 nm foram cortadas com um ultramicrótomo, montadas em grades de cobre de 200 malhas, coradas com acetato de uranila a 2% por 30 min seguidas de citrato de chumbo por 15 min, lavadas com água destilada, secas ao ar e examinadas em microscópio eletrônico de transmissão a 80 kV. Como nota de segurança, o glutaraldeído e o tetróxido de ósmio são tóxicos e voláteis e devem ser manuseados apenas em uma capela com luvas e óculos de proteção. Os resíduos devem ser descartados em recipientes perigosos designados de acordo com os protocolos de segurança institucionais.

10. Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os dados são expressos como média ± DP. A significância estatística foi avaliada por meio de ANOVA de uma via seguida de teste post-hoc de LSD, com P < 0,05 considerado significativo.

Resultados

Efeito do HSYA na expressão de citocinas pró-inflamatórias de condrócitos (IL-1β, TNF-α, IL-6)
Em comparação com o grupo controle normal, todos os outros grupos apresentaram níveis significativamente elevados de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, TNF-α e IL-6) (P < 0,05, Tabela 1, Figura 1A-G). O tratamento com HSYA, inibidor de HIF-1α, indutor de autofagia, inibidor de HSYA + HIF-1α ou HSYA + indutor de autofagia red...

Discussão

A osteoartrite (OA), uma doença crônica prevalente, prejudica significativamente a qualidade de vida dos pacientes. Dentre os vários subtipos de OA, a OAJ é a mais comum, contribuindo para a carga global da doença. Apesar de sua alta incidência, a etiologia precisa e os mecanismos fisiopatológicos subjacentes da OAJ permanecem indefinidos. A intrincada interação entre os processos mecânicos e bioquímicos dentro da cartilagem articular, particularmente a regulação da função dos condrócito...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tetróxido de Ósmio a 1%	Ciências da Microscopia Eletrônica	19150	Outras correções e colorações para análise TEM
2% de glutaraldeído	Sigma-Aldrich	G5882	Corrige células para preparação de amostras TEM
4% de paraformaldeído	Servicebio	G1101	Corrige células para coloração MDC e preparação de amostras TEM
AG1478	Selleck Corporation	S1005	Injeção intravenosa de 20 mg/kg, inibidor de quinase do receptor ErbB no modelo de rato
Kit de Detecção de Apoptose Annexin V-FITC/PI	Biopântano	BS3030	Colorem células apoptóticas para detecção por citometria de fluxo
Indutor de autofagia (RAPA)	Sigma Corporation	R0395	Rapamicina, indutor de autofagia, usado a 10 nmol/L em experimentos com condrócitos
Anticorpo de Beclin1	Santa Cruz Biotecnologia	SC-48341	Anticorpo primário para a detecção por Western blot da proteína relacionada à autofagia Beclin1
Anticorpo BNIP3	Santa Cruz Biotecnologia	SC-517348	Anticorpo primário para a detecção de blot Western em BNIP3
Incubadora de dióxido de carbono	Yiheng	BPN-150CW	para cultura celular
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Dissolve cristais de formazan em ensaio MTT
DMEM	Beyotime	C0001	Meio de cultura celular, suplementado com 10% de FBS para cultura de condrócitos
Leitor de Microplacas ELISA	Thermo Fisher Scientific	Multiskan FC	Mede valores de OD em ensaios ELISA e MTT
Reagente de Quimioluminescência (ECL) Aprimorado	Thermo Fisher Scientific	32106	Visualiza bandas proteicas em Western blot
Resina Epóxi (EPON812)	Ciências da Microscopia Eletrônica	14120	Amostras de embeds para seccionamento TEM
FBS	Beyotime	C0205	Soro bovino fetal, adicionado ao DMEM para nutrição de condrócitos
Citômetro de Fluxo	Beckman (mencionado por apopose)	CytoFLEX S	Detecta taxa de apoptose de condrócitos e marcadores celulares
Microscópio de fluorescência	Olimpo	IX73	Observa vesículas autofágicas coloridas com MDC
Sistema de Imagem em Gel	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Captura e quantifica bandas proteicas a partir do Western blot
HIF-1 & alfa; Anticorpo	Santa Cruz Biotecnologia	SC-13515	Anticorpo primário para a detecção de Western blot de HIF-1 e alfa;
HIF-1 & alfa; inibidor (YC-1)	Selleck Corporation	S1047	HIF-1 & alfa; inibidor de vias (pathway inhibitor), usado em 10 & mu; mol/L em experimentos celulares
Centrífuga Refrigerada de Alta Velocidade	Eppendorf	5430R	Usado para separar componentes
Anticorpo Secundário conjugado com HRP	Jackson ImmunoResearch	115-035-003	Liga-se anticorpos primários para amplificação de sinal em Western blot
IL-1 e beta; ELISA Kit	Biologia Shenggong	C5236	Quantifica IL-1 e beta; níveis em supernadantes celulares via ELISA
IL-6 ELISA Kit	Biologia Shenggong	C5237	Quantifica os níveis de IL-6 em supernadantes celulares via ELISA
Anticorpo LC3	Santa Cruz Biotecnologia	SC-398822	Anticorpo primário para a detecção por Western blot da proteína relacionada à autofagia LC3
Reagente de lipofectamina 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000001	Reagente de transfecção à base de lipídios para tansfecção
Monodansilcadaverina (MDC)	Sigma-Aldrich	D4008	0,05 mol/L, colore vesículas autofágicas para microscopia de fluorescência
Reagente MTT	Beyotime	C0009	0,5 mg/mL, usado no ensaio MTT para avaliar a proliferação de condrócitos
NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific	ND-1000	determinar a concentração de RNA
NRG1 ELISA Kit	Abcam (Reino Unido)	ab213961	Mede a concentração de NRG1 nos tecidos cardíacos via ELISA
Anticorpo P62	Santa Cruz Biotecnologia	SC-28359	Anticorpo primário para a detecção por Western blot da proteína P62 relacionada à autofagia
Anticorpo ErbB4 (p-ErbB4) fosforilado	Afinidade	AF3445	Anticorpo primário para a detecção por Western blot de ErbB4 ativado
PrimeScript RT Reagent Kit	Takara	RR047A	Transcrição reversa de RNA para fornecer modelos para experimentos qPCR
Sistema de PCR quantitativa em tempo real	Bio-Rad	CFX96	para detecção RT-PCR
NRG1 humano recombinante (rh-NRG1)	R& Sistemas D	396-HB	Injeção intravenosa de 5 mg/kg para ativar a via NRG1/ErbB4 no modelo de rato
RIPA Buffer	Meilunbio	MA0151	Tampão de lise com inibidores de protease/fosfatase para extração de proteínas
Amarelo Cártamo A (HSYA)	Chengdu Mansit Biotechnology Co., Ltd.	Must-160601	Componente bioativo do Carthamus tinctorius L., usado em 100 & mu; mol/L para tratamento de condrócitos
Equipamento SDS-PAGE	Bio-Rad	Tetra Mini-PROTEANO	Separa proteínas pelo peso molecular em Western blot
TB Green Premix Ex Taq II	Takara	RR820A	para experimento qPCR
TNF-&alfa; ELISA Kit	Biologia Shenggong	C5238	Quantifica TNF-& alfa; níveis em supernadantes celulares via ELISA
Anticorpo Total ErbB4	Proteintech	19943-1-AP	Anticorpo primário para a detecção por Western blot do ErbB4 total
Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)	Hitachi (mencionado por vesículas autofágicas)	H-7650	Observa vesículas autofágicas em mitocôndrias em nível ultraestrutural
Reagente Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026	para extração de RNA
Tripsina-EDTA	Gibco (Thermo Fisher)	25200056	Usado para digestão enzimática da cartilagem articular para isolar condrócitos
Colagênase Tipo II (0,02%)	Worthington Biochemical	CLS-2	Digere tecido cartilaginoso para isolamento de condrócitos
Anticorpo β-catenina	Santa Cruz Biotecnologia	SC-7963	Anticorpo de referência interno para normalização do Western blot