Esse protocolo estabelece uma pipeline integrada multi-ômica (transcriptoma e proteoma) combinada com triagem farmacológica em rede para identificar motores moleculares e alvos terapêuticos para disfunção endotelial em complicações diabéticas.
Research Article
Esse protocolo estabelece uma pipeline integrada multi-ômica (transcriptoma e proteoma) combinada com triagem farmacológica em rede para identificar motores moleculares e alvos terapêuticos para disfunção endotelial em complicações diabéticas.
A disfunção endotelial é um dos principais fatores que causam a doença renal diabética (DKD), mas seus mecanismos moleculares sistêmicos permanecem incompletamente decodificados. Hipotetizamos que a análise multi-ômica integrada poderia mapear danos endoteliais induzidos por hiperglicemia e identificar terapêuticas reutilizáveis. Um pipeline computacional reutilizável foi aplicado para integrar perfis transcriptômicos/secretomáticos de células endoteliais hiperglicêmicas e rins diabéticos. Isso identificou 534 genes/proteínas comumente regulados para cima. O enriquecimento funcional revelou ativação da remodelação da matriz extracelular, comunicação intercelular e vias de inflamação. A validação entre bancos de dados refinou 278 mediadores de alta confiança, e a análise de redes de interação proteína-proteína identificou dez genes centrais. Usando a farmacologia de rede, selecionamos uma biblioteca de medicamentos aprovados, identificando vários compostos candidatos (por exemplo, bruceantina, idelalisib) que potencialmente têm como alvo essa rede. Além disso, a regulação dos fatores de transcrição e simulações exemplares de acoplamento molecular (por exemplo, idelalisib com CTCF/BRD4) forneceram hipóteses mecanicistas para validação experimental. Em conclusão, este estudo estabelece uma estrutura multi-ômica reutilizável que delimita os mecanismos patogênicos endoteliais na DKD e indica candidatos a medicamentos reutilizáveis, oferecendo uma abordagem estratégica para descoberta mecanicista e terapêutica.
O diabetes mellitus, como um desafio global de saúde, afetou 529 milhões de pessoas no mundo em 2021, com projeções indicando que impactará 1,31 bilhão de pessoas até 20501. Além do controle glicêmico, complicações de longo prazo são a principal fonte de morbidade, mortalidade e redução da qualidade de vida. Essas incluem complicações microvasculares (por exemplo, doença renal diabética (DKD), retinopatia, neuropatia) e complicações macrovasculares (por exemplo, aterosclerose acelerada). De forma crítica, a DCD afeta de 30% a 40% dos pacientes diabéticos, representando a principal causa de doença renal terminal (ESRD) nomundo 2. O profundo peso dessas complicações ressalta uma necessidade urgente e não atendida de novas terapias que visem seus mecanismos subjacentes.
As células endoteliais (CEs), que formam o revestimento interno de todos os vasos sanguíneos, são guardiãs fundamentais da saúde vascular. A disfunção endotelial induzida pela hiperglicemia atua como um fator central da vasculopatia diabética e danos aosórgãos 3,4. Altos níveis de glicose desencadeiam uma cascata de respostas desadaptativas dentro das CEs, incluindo biodisponibilidade desregulada de óxido nítrico (NO), aumento da secreção de endotelina-1 (ET-1), aumento da expressão de moléculas de adesão (por exemplo, VCAM-1, ICAM-1), aumento do estresse oxidativo devido à geração excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) (por exemplo, via NADPH oxidases) e inflamação persistente de baixo grau 3,4. Coletivamente, essas alterações conduzem a vasodilatação prejudicada, aumento da permeabilidade vascular, adesão e infiltração de leucócitos, estados pró-trombóticos e, por fim, remodelaçãovascular 5. Dentro da microvasculatura renal, danos endotelials glomerulares interrompem a barreira de filtração, promovem a albuminúria e contribuem diretamente para o acúmulo da matriz extracelular (CLE), glomerulosclerose e fibrose tubulointersticial 5,6. A subsequente ativação das células renais residentes, juntamente com o influxo de células inflamatórias, estabelece um ciclo vicioso que amplifica a lesão renal 5,7. Crucialmente, estudos clínicos demonstram que marcadores de disfunção endotelial sistêmica se correlacionam fortemente com o início e progressão da albuminúria e a diminuição da taxa de filtração glomerular (TFG) em pacientes diabéticos 6,7,8, ressaltando sua relevância direta para os desfechos de doenças humanas. Apesar de sua reconhecida centralidade, uma compreensão abrangente, em nível sistêmico, da reprogramação transcricional e secretora precisa induzida pela hiperglicemia crônica nas ECs — especialmente alterações que impulsionam a remodelação da MEC, fundamental para a fibrose renal — permanece incompletamente caracterizada, limitando a identificação de novos alvos terapêuticos mecanicistas para DKD e outras complicações vascularesdiabéticas 7,8.
A profunda complexidade molecular que sustenta a disfunção endotelial no diabetes apresenta um desafio formidável para as abordagens terapêuticas tradicionais de alvo único. É aqui que a biologia computacional e a bioinformática emergem como ferramentas indispensáveis, permitindo a integração e mineração de conjuntos de dados diversos e de alta dimensão de ómicas para priorizar hubs causais dentro de redes patológicas e identificar estratégias terapêuticasmultidirecionadas 9. Criticamente, abordagens convencionais de modalidade única (por exemplo, apenas transcriptoma/proteoma ou triagem farmacológica) frequentemente deixam de perceber a interação crítica entre camadas moleculares (por exemplo, expressão gênica, dinâmica proteica, resposta a medicamentos), falhando em capturar fatores sinérgicos ou efeitos fora doalvo 10,11. A pipeline integrada multi-ômica supera essas limitações ao perfilar simultaneamente dados transcriptômicos, secretômicos e farmacológicos dentro do mesmo sistema, resultando em uma visão holística do mecanismo da doença. Farmacologia em rede, algoritmos de predição de ligantes/alvos e acoplamento molecular in silico permitem a exploração sistemática de bibliotecas de medicamentos aprovadas, acelerando o reposicionamento ou descoberta de compostos capazes de combater assinaturas complexas dedoenças 3. Essa mudança de paradigma tem um potencial especial para identificar terapias que visam a desregulação endotelial e suas devastadoras consequências microvasculares, como a DKD, oferecendo potencial para maior eficácia e redução de perfis de efeitos colaterais. A integração de análises transcriptômicas/secretômicas de células endoteliais expostas à hiperglicemia identificou 534 moléculas comumente aumentadas. O enriquecimento funcional implicou remodelação da matriz extracelular, estresse oxidativo e inflamação na patogênese inicial da DKD. A análise entre bancos de dados priorizou 278 alvos de alta confiança, refinados por meio de redes de PPI de genes hub. A triagem farmacológica em rede de medicamentos aprovados previu 85 compostos candidatos (incluindo brefeldina-A, bruceantina, paracetamol e idelalisib) direcionados a esses hubs. A previsão e o acoplamento do fator de transcrição in silico exploraram mecanismos. Este trabalho delimita os motores endoteliais da DKD, estabelece uma linha de descoberta computacional e fornece candidatos terapêuticos para validação. Em última análise, espera-se que esse pipeline promova programas de descoberta terapêutica para complicações diabéticas.
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Os experimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Pesquisa e Ética Animal do Instituto de Pesquisa Médica de Hebei Yiling (número de aprovação: N2024082). Consulte a Tabela de Materiais para os materiais experimentais e instrumentos usados neste estudo. O pessoal deve usar rigorosamente equipamentos de proteção individual (EPI) adequados ao manusear reagentes perigosos como TRIzol (irritante para pele/olhos, contém fenol) e inibidores de protease (potenciais sensibilizadores respiratórios/cutâneos). Separe resíduos biológicos/líquidos em sacos autoclaváveis e resíduos químicos perigosos em recipientes designados para descarte institucional de riscos. Descontamine os consumíveis antes do descarte.
Modelagem de camundongos em nefropatia diabética
Os ratos machos de db/db e db/m (12 semanas de idade) foram mantidos sob condições específicas livres de patógenos (FPS) a 22 ± 2 °C e 56% ± 5% de umidade, com ciclos de 12 horas de luz/escuro e acesso ad libitum a comida/água. Após um período de aclimatação de 1 semana, os camundongos receberam identificadores numéricos aleatoriamente atribuídos e alocados a grupos experimentais. Os camundongos db/db foram alimentados com uma dieta rica em proteínas por 6 semanas para estabelecer a DKD. A modelagem bem-sucedida foi confirmada por uma razão albumina-creatinina urinária (UACR) significativamente elevada em relação aos controles db/m, com UACR >30 mg/g servindo como o principal biomarcador funcional para aDKD 12 inicial.
Modelagem de células endoteliais de alta glicose
Células Endoteliais Glomerulares Renais Humanas (HRGECs) foram preparadas sob condições padronizadas. Os HRGECs foram cultivados em meio de glicose normal (NG, 5,5 mM de glicose D) ou de glicose alta (HG, 30 mM de glicose D) e mantidos em um incubador umidificado a 37 °C com 5% de CO2. As células foram expostas ininterruptamente à HG ou cultivadas em condições de controle por 24 horas antes das análises a jusante. O controle osmótico (HM, contendo 5,5 mM de D-glicose com 24,5 mM manitol) deve ser incluído. Todas as condições devem atender a critérios rigorosos de aptidão celular: a viabilidade permaneceu ≥85%, os níveis de apoptose permaneceram abaixo de 15%, os aumentos de ROS na HG em comparação com HM não ultrapassaram 20%, e a liberação de LDH permaneceu abaixo de 10%, validando a integridade celular antes das análises posteriores.
Coleta de mídia condicionada
Meios condicionados (CM) foram coletados usando um protocolo padronizado para análise dosecretoma 13 com modificações. Após 24 horas de estimulação com glicose alta (30 mM de D-glicose), glicose normal (5,5 mM de D-glicose) ou controle osmótico (5,5 mM de D-glicose + 24,5 mM mannitol), os HRGECs foram lavados com soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS) para remover proteínas séricas residuais. As células foram reabastecidas com meio endotelial basal sem soro, sem fenol e vermelho, e incubadas por 12 horas a 37 °C com 5% de CO₂ para acumular fatores secretados.
O CM era colhido usando tubos de centrifugação pré-resfriados. Sequencialmente, o processamento da amostra foi feito conforme descrito abaixo.
Esclarecimento principal: A CM foi transferida para tubos cônicos livres de RNase/DNase e centrifugada a 3.000 x g por 10 minutos a 4 °C. Os detritos em pellets foram descartados.
Inibição da protease: Em 2 minutos após a clarificação primária, um coquetel inibidor de protease sem EDTA foi adicionado a uma concentração final 1x (1:50) contendo 1x inibidores de fosfatase.
Concentração: O supernadante foi imediatamente carregado em filtros centrífugos PBS pré-enxaguados (MWCO de 3 kDa) e centrifugado a 4.000 x g por 90 minutos a 4 °C para alcançar uma concentração de 10x.
Esclarecimento secundário: O concentrado foi transferido para tubos microcentrífugas pré-resfriados e centrifugado a 12.000 x g por 15 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi coletado, evitando agregados em pellets.
Armazenamento: Aliquotas de 50 μL foram produzidas em crioviais estéreis de baixa ligação a proteínas. Os frascos foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido dentro de 30 minutos após a conclusão da colheita. Frascos eram armazenados a -80 °C (sem ciclos de congelamento-descongelamento).
Lotes de CM passaram por testes de endotoxina (<0,25 EU/mL). O protocolo de incubação sem soro não mostrou indução de estresse (validado pelos imunoblots HSP70/CHOP). Rendimento da proteína CM normalizado para contagem celular/conteúdo de DNA viável na colheita. Rigor de processamento mantido: técnica estéril em todo o processo; ≤30 minutos de janela de colheita para congelamento; Equilíbrio de temperatura do rotor confirmado.
Ensaio CCK-8 de células tubulares renais tratadas com meio condicionado
Para avaliar o impacto funcional do secretoma endotelial na viabilidade das células tubulares renais, foi realizado um ensaio CCK-8 na linhagem epitelial tubular proximal renal humana HK-2 tratada com CM derivada de células endoteliais glomerulares renais humanas (HRGECs), de acordo com protocolos estabelecidos. As células HK-2 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS). Para o ensaio, as células foram semeadas em placas de 96 poços com uma densidade de 5 x 10³ células por poço. A inanição de soro das células foi realizada por 12 horas em meio contendo 0,5% de FBS imediatamente antes do tratamento para muco cervical (MC).
A MC foi aplicada com massa total de proteína normalizada igual. Alíquotas de CM congeladas foram descongeladas a 37 °C em banho seco (<5 min) e clarificadas por centrifugação a 10.000 x g por 5 minutos a 4 °C. Células HK-2 (100 μL/poço) foram tratadas com HG-CM, NG-CM ou HM-CM, normalizadas para um conteúdo de proteína/DNA correspondente. Um total de 3 réplicas biológicas por condição (com 3 réplicas técnicas cada) foi preparado. As amostras foram incubadas a 37 °C com 5% de CO₂ por 24 horas. A viabilidade celular foi avaliada usando o Kit de Contagem Celular-8. Para isso, 10 μL de solução de CCK-8 foram adicionados a cada poço e incubados por 1 a 4 horas a 37 °C. A absorvância foi medida em 450 nm usando um leitor de microplaca. A viabilidade era calculada como:
Viabilidade (%) = [(A_sample - A_blank) / (A_baseline_control - A_blank)] x 100
Detecção de estresse oxidativo
Os níveis de malondialdeído celular (MDA) foram quantificados, um dos principais produtos finais da peroxidação lipídica de membrana, por meio do ensaio TBA. Lisados celulares (1 x 107 células) foram clarificados centrifugando a 10.000 x g por 15 minutos, e então 0,02 mL de sobrenadante foi aliquotado em tubos de amostra junto com 0,02 mL de padrões MDA. Ao alíquota, foram adicionados 0,02 mL de clarificante e 0,6 mL de reagente ácido. As amostras/padrões foram tratadas com 0,2 mL do agente cromogênico (tubos controle: 0,2 mL de ácido acético 50% foi adicionado). Após selar, misturar e incubar a 100 °C por 40 minutos, as amostras foram resfriadas e centrifugadas a 9569 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para microplacas a 250 μL para medição OD₅₃₂.
Perfilamento transcriptômico
O RNA total foi isolado usando reagente TRIzol seguindo o protocolo do fabricante. A quantidade e pureza do RNA foram avaliadas com um espectrofotômetro e um analisador de fragmentos, respectivamente. Apenas amostras de RNA de alta qualidade foram usadas com Número de Integridade de RNA (RIN) > 7.0 para construção de biblioteca de sequenciamento.
MRNA poliadenilado (poli(A)+) foi enriquecido por duas rodadas de seleção baseada em esferas magnéticas oligo(dT). O mRNA purificado foi fragmentado em 200-300 nucleotídeos usando um kit de fragmentação à base de magnésio a 94 °C por 5-7 minutos. A síntese de cDNA em primeira fita foi realizada com transcriptase reversa, seguida pela síntese de cDNA em segunda fita usando DNA polimerase I e RNase H de E. coli na presença de dUTP (para possibilitar a especificidade da fita). As etapas seguintes incluíram reparo nas extremidades, recorte em A, ligação do adaptador e seleção de tamanho usando esferas magnéticas. Antes da amplificação por PCR, a segunda cadeia incorporada por dUTP era digerida com a enzima UDG.
Foi construída uma biblioteca específica para fios com tamanho médio de inserto de 400 ± 50 bp usando PCR sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 98 °C por 1 minuto; 14 ciclos de desnaturação a 98 °C por 10 s, recozimento a 60 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 30 s; e uma extensão final a 72 °C por 5 minutos. O sequenciamento de ponta pareada a 150 bp foi feito em uma plataforma Illumina, com profundidade de sequenciamento de ≥40 milhões de leituras por amostra (Q30 > 85%).
Análise bioinformática de dados transcriptômicos
A verificação de qualidade das leituras brutas foi feita usando o FastQC (v0.11.8), e o alinhamento com o genoma de referência GRCh38.p13 com o HISAT2 (v2.2.1) foi feito. A quantificação de transcritos e a montagem de transcritos por amostra foram realizadas usando StringTie (v2.1.6) com parâmetros padrão. Todos os transcriptomas montados foram fundidos a partir de amostras individuais para reconstruir um transcriptoma abrangente usando o software gffcompare (v0.12.6; gffcompare é uma ferramenta independente, não faz parte do StringTie, e sua versão é corrigida para a versão estável comum). A análise diferencial de expressão foi realizada com DESeq2 (v1.38.3) usando limiares de |log2 fold change (FC)| > 1 e taxa de falsas descobertas (FDR) < 0,05. Os efeitos em lote foram corrigidos via o pacote variancePartition.
Análise proteômica do secretoma
A CM foi coletada de HRGECs cultivados sob condições de controle NG, HG ou HM usando um método13 descrito anteriormente com modificações para análise do secretoma. As células foram lavadas com PBS após a estimulação e incubadas em meio sem soro por 12 horas. O CM foi coletado e centrifugado a 3.000 x g por 10 min (4 °C).
Quantidades iguais de peptídeos de cada amostra foram misturadas e depois diluídas com o solvente A (5% ACN, pH 9,8) e injetadas na coluna. O fracionamento da mistura peptídica foi feito usando uma coluna 3,5 μm 4,6 x 150 300Extend-C18 no Sistema de Separação Rápida Binária. A elução gradiente foi realizada com uma vazão de 0,3 mL/min: 5% a 21% solvente B (97% ACN, pH 9,8) em 38 minutos, 21,5% a 40% solvente B em 20 minutos, 40% a 90% solvente B em 2 minutos, 90% solvente B por 3 minutos e solvente B 5% equilibrado por 10 minutos. Os picos de elução foram monitorados a 214 milhas náuticas, e frações foram coletadas a cada minuto. As frações foram combinadas de acordo com cromatogramas dos picos de elução. Um total de 10 frações foram coletadas, que depois foram liofilizadas.
As fases móveis A (100% água, 0,1% ácido fórmico) e B (80% acetonitrila) foram preparadas, e as amostras de peptídeos secos foram reconstituídas com 0,1% de ácido fórmico e centrifugadas a 20.000 x g por 10 minutos. A separação foi feita usando um sistema de fase líquida UHPLC. As amostras foram alimentadas em uma coluna de HPLC ES906 (150 mm) com gradiente de 8 minutos a 2,5 μL/min, e separadas com o seguinte gradiente efetivo: 0-4 min, fase B móvel de 4% aumentando linearmente até 25%; 4-6,9 min, fase móvel B aumentando linearmente de 25% para 35%; 6,9-7,3 min, fase móvel B aumentando linearmente de 35% para 99%; 7,3-8,0 min, manteve a fase móvel B em 99%. Os peptídeos separados em fase líquida foram transferidos para um espectrômetro de massa para aquisição do modo DIA. Os principais parâmetros foram definidos da seguinte forma: energia de colisão normalizada 25%, estado de carga padrão 2, resolução 240.000, varredura a cada 0,6 s, alcance de varredura 380-980 m/z, espectrometria de massa AGC 500%. Varreduras de íons por fragmentação foram registradas com um tempo máximo de varredura de 3 ms e utilizaram 300 janelas de varredura 2-Th, variando de 380 a 980 m/z.
O DIA-NN (https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x, versão 1.9.1) foi usado para analisar os dados do DIA com um método sem biblioteca. Os dados de EM/EM foram pesquisados em sequências de proteínas, que foram baixadas do banco de dados Uniprot com as seguintes configurações: enzima: Tripsina/P; Máximo de decotes errados: 2; modificação fixa: carbamidometil (C); modificações variáveis: oxidação (M) e acetil (proteína N-term); Tolerância de massa precursora: 20 ppm; tolerância de massa do fragmento: 0,05Da. Os resultados foram filtrados por 1% de FDR, e apenas os grupos proteicos que atendiam a esse critério de filtro foram usados na análise a jusante.
Análise de enriquecimento funcional de Omics (GO, KEGG e GSEA)
Análises de enriquecimento funcional foram realizadas em conjuntos filtrados de genes diferencialmente expressos (transcriptômica) e proteínas (proteômica do secretoma), seguindo pipelines estabelecidos em bioinformática. Os identificadores foram mapeados usando Org.Hs.eg.db. O enriquecimento de GO (processos biológicos, funções moleculares, componentes celulares) foi executado via clusterProfiler. Benjamini-Hochberg ajustou o valor p < 0,05, e a redução de similaridade semântica (cutoff=0,7) foi aplicada para condensar termos. A análise de caminhos KEGG foi realizada usando a API REST KEGG (has, lançamento de 2023). Testes hipergeométricos foram utilizados com correção de Yekutieli FDR. A visualização da topologia de caminhos foi feita com o Pathview. O GSEA foi aplicado usando uma abordagem baseada em rank com classificação do gene sinal-no-ruído. Foi realizado enriquecimento de testes contra coleções de MSigDB (HALLMARK, C2, C5; v2023.2) e assinaturas endoteliais diabéticas curadas. A significância foi avaliada após 1000 permutações de fenótipo (FDR < 25%).
Análise de redes de interação proteína-proteína
Para identificar reguladores moleculares centrais dentro do pool de candidatos patogênicos, a construção de redes PPI e a análise topológica foram realizadas utilizando um fluxo de trabalho computacional integrado. Os 278 genes candidatos foram submetidos ao banco de dados STRING (v12.0; Homo sapiens; As fontes de evidência incluíam bancos de dados experimentais, de co-expressões e curados; um limiar de confiança na interação (pontuação combinada) >0,7 para vantagens de alta confiança; e sem inflação adicional de interatores. Os resultados foram importados para o Cytoscape (v3.9.1), e a análise da topologia da rede foi realizada usando plugins MCODE (v1.5.2) e CytoHubba (v0.4.1). Subsequentemente, a rede foi visualmente otimizada de acordo com o grau de conexão dos nós, de modo que nós com alta conectividade são mais escuros, maiores em tamanho e mais proeminentes em rótulos.
Desenvolvimento de um conjunto de genes-alvo para doença renal diabética
Os critérios para mRNAs/proteínas co-regulados foram definidos da seguinte forma: transcriptoma (FDR < 0,05 e |log2FC| > 1) e secretoma (FDR < 0,01 e |log2FC| > 1,5). Nomes de proteínas e genes foram normalizados usando UniProt e convertidos para um formato unificado (Símbolo Genético). Um conjunto de genes-alvo foi construído para a doença renal diabética integrando genes associados à doença de múltiplos bancos de dados públicos, incluindo GeneCards (Versão 5.25, termo de consulta: Diabetic Nephropathies, data de acesso julho de 2025), o Banco de Dados Comparativo de Toxicogenômica (CTD; https://ctdbase.org/, termo de consulta: Diabetic Nephropathies, data de acesso julho de 2025) e Open Targets Platform (https://platform.opentargets.org/, Versão 0.13.8, termo de consulta: Diabetic Nephropathies, data de acesso julho de 2025)13, 14, 15. Este foi designado como o conjunto abrangente de referência para doenças renais diabéticas. A interseção entre mRNAs/proteínas co-reguladas para cima e esse conjunto de genes foi identificada para análises posteriores.
Detecção de proteínas CCL2
Para quantificar o CCL2, uma placa de 96 poços foi revestida com anticorpo de captura (100 μL/poço) e incubada a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, a placa foi lavada com 2x com buffer e bloqueada com diluente ELISA (200 μL/poço) por 1 hora em RT. Uma curva padrão de 7 pontos foi preparada por diluições seriadas 2 vezes do padrão S1, então as amostras (100 μL/poço) foram adicionadas e incubadas por 2 horas a 400 rpm. Após lavagem 5 vezes, o anticorpo de detecção (100 μL/poço) foi adicionado e incubado por 1 hora a 400 rpm, seguido por adição e incubação de solução enzimática (100 μL/poço) por 30 min a 400 rpm. As amostras foram desenvolvidas com substrato de TMB (15-30 min, RT). A reação parou com ácido (100 μL/poço), e a absorvância foi lida em 450 nm (620 nm de referência opcional). Etapas principais incluem lavagens rigorosas, incubações cronometradas e diluições padronizadas para garantir a reprodutibilidade.
Reposicionamento de drogas
Os compostos terapêuticos foram previstos usando a seguinte plataforma: LINCS L1000 Feature Direction Signatures Search Engine (L1000CDS2; https://maayanlab.cloud/L1000CDS2). Esta plataforma emprega o método MODZ e análise de direção característica para identificar pequenas moléculas ou combinações de compostos capazes de reverter ou imitar assinaturas de expressão gênicade entrada 16. Foram identificados medicamentos candidatos como aqueles que revertem a desregulação de genes renais diferencialmente expressos usando essa plataforma. Os compostos foram classificados com base em seus escores de reversão em linhagens celulares renais por rins selecionados na coluna de tecido, e os candidatos mais bem classificados foram submetidos a acoplamento molecular para avaliar suas afinidades de ligação aos principais alvos proteicos.
Rastreio do fator de transcrição co-regulador
O banco de dados hTFtarget foi consultado para a ligação co-regulatória de TFs ao conjunto de genes. O banco de dados hTFtarget foi analisado para identificar relações genes-alvo entre fator de transcrição humano (TF) por meio da análise computacional de conjuntos de dados ChIP-Seq em larga escala em diversas células, tecidos e condições. O pipeline integrativo combinou sinais de pico ChIP-Seq com contexto epigenético para identificar a ligação TF em promotores/potenciadores, levando explicitamente em conta a dinâmica regulatória espaço-temporal. Como demonstrado por Zhang et al., serviu como uma plataforma multidimensional permitindo a exploração de alvos TF ou reguladores gênicos, visualização de dados ChIP-Seq, investigação da cooperatividade TF e previsão dos sítios deligação 17.
Pipeline computacional e análise para acoplamento molécula-proteína de pequenas dimensões
O AutoDock Vina 1.2.018 foi utilizado para conduzir análise de acoplamento molecular das interações de ligação entre os ingredientes ativos e os fatores de transcrição BRD4, CTCF, EP300 e SPI1. As estruturas cristalinas de BRD4 (PDB ID: 7REK), CTCF (PDB ID: 5K5I), EP300 (PDB ID: 5NU5) e SPI1 (PDB ID: 8E3K) foram obtidas do Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)19,20. Estruturas de pequenas moléculas no formato SDF foram baixadas do banco de dados PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 21, convertidas para o formato MOL2 usando Open Babel 2.4.1 e minimizadas de energia com PyRx 0.8. O pré-processamento de proteínas era feito removendo moléculas de água, adicionando átomos de hidrogênio, calculando cargas de Gasteiger e convertendo-as para o formato PDBQT (exigido para o AutoDock Vina). Foi empregada uma estratégia de acoplamento semi-flexível, definindo a posição e as dimensões da grade de acoplamento com base nos sítios de ligação dos ligantes cocristalizados em cada proteína. O MA9-086 serve como ligante de controle positivo para o BRD4 e o XDM-CBP para o EP300. Para CTCF e SPI1 (sem ligantes positivos conhecidos), bolsas potenciais de ligação foram identificadas por meio de análise estrutural usando a plataforma online Proteins Plus (https://proteins.plus/). Os parâmetros da grade de acoplamento foram definidos da seguinte forma (coordenadas e dimensões em Å ao longo dos eixos x, y e z): BRD4 centrado em (-11,907, -8,617, -3,973) com tamanho de caixa (18,387, 18,387, 18,387); Centro CTCF em (15.165, 4.854, 6.388) e tamanho da caixa (17.25, 20.25, 9.75); O EP300 centro em (39.781, 5.326, 9.998) e o tamanho da caixa (16.516, 16.516, 16.516); SPI1 centro em (3,155, -3,853, 0,668) e tamanho da caixa (17,25, 25,5, 10,5). Durante o acoplamento, a faixa de energia foi definida para 3, o parâmetro de exaustividade para 8 e o espaçamento da grade para 0,375 Å. A estabilidade da ligação foi avaliada a partir da energia de ligação, onde valores mais baixos indicam conformações mais estáveis e maior probabilidade de interação, com um limiar de <-5 kcal/mol definido como atividade fortede ligação 22,23. Por fim, modos de interação entre compostos e receptores foram identificados usando PyMOL.
Análise estatística
Os dados são apresentados como média ± SEM. Testes estatísticos foram selecionados com base na normalidade (Shapiro-Wilk) e homogeneidade de variância (teste de Levene). Testes t não pareados (dois grupos) ou ANOVA unidirecional com testes post hoc de LSD (≥3 grupos) foram usados para comparações entre grupos. Um p < 0,05 foi definido como um limiar de significância. Os gráficos eram gerados com o GraphPad Prism 9.0.
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Demonstração do impacto patogênico do secretoma endotelial hiperglicêmico nos túbulos renais
Este estudo começou com a validação do efeito patogênico do secretoma endotelial hiperglicêmico. O meio condicionado a partir de células endoteliais glomerulares humanas hiperglicêmicas (HG-CM) comprometeu significativamente a viabilidade das células epiteliais dos túbulos proximais humanos (HK-2) em comparação com os gr...
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Este estudo estabelece a disfunção do secretoma endotelial induzida por hiperglicemia como um fator crítico da lesão renal diabética por meio de multi-ômicas integradas e abordagens computacionais. Demonstração de que a citotoxicidade mediada pelo secretoma em relação aos túbulos renais coincide com a desregulação sistemática de 534 fatores derivados de endotelios convergindo para a remodelação da matriz, estresse oxidativo e vias inflamação-núcleo na patogênese da DKD. A identificação d...
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Os autores não têm nada a revelar.
Esse trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32200644), pelo Projeto do Programa de Ciência e Tecnologia de Hebei (246W2501D, 252W7716D) e pela Plataforma Dourada de Yanzhao (A20240022).
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Kit CCL2 ELISA | Thermo Fisher Scientific | #88-7399-88 | |
| Inibidor de CCR2 | Merck Millipore | #227016 | |
| Kit de Ensaio de Viabilidade Celular | Seven Biotechnology | CCK-8, SC119-01 | |
| Sequenciador de DNA | Illumina | NovaSeq 6000 | |
| Sistema de Cromatografia Líquida de Alto Desempenho | Thermo Fisher Scientific | UltiMate 3000 Binário RSLC | |
| Meio de Cultura do HRGEC | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd. | 1001 | |
| Células Endoteliais Glomerulares Renais Humanas (HRGECs) | Shanghai Zhongqiao Xinzhou Biotecnologia | PRI-H-00038 | |
| Meio Completo de Células Epiteliais Tubulares Renais Humanas | Procell | CM-H193 | |
| Células Epiteliais Tubulares Renais Humanas (HK2) | Procell | CP-H193 | |
| Machos de camundongos db/db e db/m (4 semanas) | Hangzhou Ziyuan Biotech Co., Ltd. | SCXK 20190004 | |
| Espectrômetro de Massa | Thermo Fisher Scientific | Astral | |
| Leitor de Absorção de Microplacas | Dispositivos Moleculares | SpectraMax iD5 | |
| Coquetel de Inibidores de Protease (Livre de EDTA) | Roche | cOmplete, #5056489001 | |
| Reagente de extração de RNA | Thermo Fisher Scientific | TRIzol, #15596026 | |
| Analisador de Qualidade de RNA | Tecnologias Agilent | Analisador de Fragmentos 5300, M5311AA | |
| Instrumento de Quantificação de RNA | Thermo Fisher Scientific | Qubit 3.0, Q33216 | |
| Kit de detecção ROS | Thermo Fisher Scientific | #EEA019 | |
| Dispositivos Centrífugos de Ultrafiltração (MWCO de 3 kDa) | Merck Millipore | Amicon Ultra-4 |
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