Análise Integrada de Transcrições e Proteômicas de Secretomas de Células Endoteliais Estimuladas por Hiperglicemia e Triagem de Compostos-Alvo

Summary

Esse protocolo estabelece uma pipeline integrada multi-ômica (transcriptoma e proteoma) combinada com triagem farmacológica em rede para identificar motores moleculares e alvos terapêuticos para disfunção endotelial em complicações diabéticas.

Abstract

A disfunção endotelial é um dos principais fatores que causam a doença renal diabética (DKD), mas seus mecanismos moleculares sistêmicos permanecem incompletamente decodificados. Hipotetizamos que a análise multi-ômica integrada poderia mapear danos endoteliais induzidos por hiperglicemia e identificar terapêuticas reutilizáveis. Um pipeline computacional reutilizável foi aplicado para integrar perfis transcriptômicos/secretomáticos de células endoteliais hiperglicêmicas e rins diabéticos. Isso identificou 534 genes/proteínas comumente regulados para cima. O enriquecimento funcional revelou ativação da remodelação da matriz extracelular, comunicação intercelular e vias de inflamação. A validação entre bancos de dados refinou 278 mediadores de alta confiança, e a análise de redes de interação proteína-proteína identificou dez genes centrais. Usando a farmacologia de rede, selecionamos uma biblioteca de medicamentos aprovados, identificando vários compostos candidatos (por exemplo, bruceantina, idelalisib) que potencialmente têm como alvo essa rede. Além disso, a regulação dos fatores de transcrição e simulações exemplares de acoplamento molecular (por exemplo, idelalisib com CTCF/BRD4) forneceram hipóteses mecanicistas para validação experimental. Em conclusão, este estudo estabelece uma estrutura multi-ômica reutilizável que delimita os mecanismos patogênicos endoteliais na DKD e indica candidatos a medicamentos reutilizáveis, oferecendo uma abordagem estratégica para descoberta mecanicista e terapêutica.

Introduction

O diabetes mellitus, como um desafio global de saúde, afetou 529 milhões de pessoas no mundo em 2021, com projeções indicando que impactará 1,31 bilhão de pessoas até 20501^. Além do controle glicêmico, complicações de longo prazo são a principal fonte de morbidade, mortalidade e redução da qualidade de vida. Essas incluem complicações microvasculares (por exemplo, doença renal diabética (DKD), retinopatia, neuropatia) e complicações macrovasculares (por exemplo, aterosclerose acelerada). De forma crítica, a DCD afeta de 30% a 40% dos pacientes diabéticos, representando a principal causa de doença renal terminal....

Protocol

Os experimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Pesquisa e Ética Animal do Instituto de Pesquisa Médica de Hebei Yiling (número de aprovação: N2024082). Consulte a Tabela de Materiais para os materiais experimentais e instrumentos usados neste estudo. O pessoal deve usar rigorosamente equipamentos de proteção individual (EPI) adequados ao manusear reagentes perigosos como TRIzol (irritante para pele/olhos, contém fenol) e inibidores de protease (potenciais sensibilizadores respiratórios/cutâneos). Separe resíduos biológicos/líquidos em sacos autoclaváveis e resíduos químicos perigosos em reci....

Results

Demonstração do impacto patogênico do secretoma endotelial hiperglicêmico nos túbulos renais

Este estudo começou com a validação do efeito patogênico do secretoma endotelial hiperglicêmico. O meio condicionado a partir de células endoteliais glomerulares humanas hiperglicêmicas (HG-CM) comprometeu significativamente a viabilidade das células epiteliais dos túbulos proximais huma.......

Discussion

Este estudo estabelece a disfunção do secretoma endotelial induzida por hiperglicemia como um fator crítico da lesão renal diabética por meio de multi-ômicas integradas e abordagens computacionais. Demonstração de que a citotoxicidade mediada pelo secretoma em relação aos túbulos renais coincide com a desregulação sistemática de 534 fatores derivados de endotelios convergindo para a remodelação da matriz, estresse oxidativo e vias inflamação-núcleo na patogênese da DKD. A identificação d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit CCL2 ELISA	Thermo Fisher Scientific	#88-7399-88
Inibidor de CCR2	Merck Millipore	#227016
Kit de Ensaio de Viabilidade Celular	Seven Biotechnology	CCK-8, SC119-01
Sequenciador de DNA	Illumina	NovaSeq 6000
Sistema de Cromatografia Líquida de Alto Desempenho	Thermo Fisher Scientific	UltiMate 3000 Binário RSLC
Meio de Cultura do HRGEC	Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.	1001
Células Endoteliais Glomerulares Renais Humanas (HRGECs)	Shanghai Zhongqiao Xinzhou Biotecnologia	PRI-H-00038
Meio Completo de Células Epiteliais Tubulares Renais Humanas	Procell	CM-H193
Células Epiteliais Tubulares Renais Humanas (HK2)	Procell	CP-H193
Machos de camundongos db/db e db/m (4 semanas)	Hangzhou Ziyuan Biotech Co., Ltd.	SCXK 20190004
Espectrômetro de Massa	Thermo Fisher Scientific	Astral
Leitor de Absorção de Microplacas	Dispositivos Moleculares	SpectraMax iD5
Coquetel de Inibidores de Protease (Livre de EDTA)	Roche	cOmplete, #5056489001
Reagente de extração de RNA	Thermo Fisher Scientific	TRIzol, #15596026
Analisador de Qualidade de RNA	Tecnologias Agilent	Analisador de Fragmentos 5300, M5311AA
Instrumento de Quantificação de RNA	Thermo Fisher Scientific	Qubit 3.0, Q33216
Kit de detecção ROS	Thermo Fisher Scientific	#EEA019
Dispositivos Centrífugos de Ultrafiltração (MWCO de 3 kDa)	Merck Millipore	Amicon Ultra-4