Preparação Automatizada de Amostras para a Análise Multiplexada de Modificações Pós-Traducionais de Histonas de Célula Única (sc-hPTM2)

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para automatizar a análise de modificação pós-translacional de histonas de célula única usando uma estratégia de rotulagem isotópica de dois plexos e digestão com ArgC. Esse fluxo de trabalho permite um perfil quantitativo, reproduzível e de alta sensibilidade da heterogeneidade da cromatina e respostas epigenéticas em resolução de célula única.

Abstract

As modificações pós-traducionais de histonas (hPTMs) são reguladores centrais da organização da cromatina e da expressão gênica. A desregulação deles está implicada no desenvolvimento, câncer e envelhecimento. Embora a espectrometria de massa seja o método preferido para estudar hPTMs, a maioria dos protocolos é projetada para amostras em massa e não consegue resolver a variabilidade de célula para célula. Estender a análise PTM de histonas ao nível de célula única é, portanto, essencial, mas tecnicamente desafiadora, pois as histonas são de baixa abundância, ricas em lisina e fortemente modificadas.

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho automatizado de proteômica unicelular para análise PTM de histonas usando manuseio de nanolíquidos. O sistema permite o processamento em escala de nanolitros de células individuais com manuseio mínimo e alta reprodutibilidade. O fluxo de trabalho inclui digestão com ArgC Ultra protease, que cliva resíduos de arginina e evita a necessidade de etapas de derivatização bloqueadora de lisina tipicamente exigidas na proteômica de histonas. Para possibilitar a comparação quantitativa entre condições, aplicamos uma estratégia de marcação em dois plexos com anidrido propiônico e seu análogo deuterizado, anidrido propiônico-d10. Essa combinação de preparação automatizada da amostra, multiplexação isotópica e digestão ArgC Ultra resulta em um protocolo simplificado e sensível para análise PTM de histonas de célula única.

O método permite a investigação da heterogeneidade da cromatina e dos efeitos de perturbações epigenéticas na resolução de célula única. Para demonstrar o fluxo de trabalho, geramos esferoides a partir de células hepatocelulares do carcinoma HepG2/C3A e os tratamos com butirato de sódio, um inibidor da histona desacetilase que induz a hiperacetilação.

Introduction

Histonas são os componentes proteicos dos nucleossomos, as unidades repetitivas da cromatina. Suas caudas N-terminais são ricas em resíduos de lisina e arginina e são altamente reguladas por modificações pós-traducionais (PTMs), como acetilação, metilação e fosforilação. Essas modificações influenciam a acessibilidade do DNA e, assim, controlam processos como transcrição, replicação e reparo. Padrões alterados de PTM de histonas estão fortemente associados a estados de doença, desde câncer até neurodegeneração e^{envelhecimento 1,2}. Por essa razão, a análise PTM de histonas tornou-se de grande interesse em pesquisas em epigenética e proteômica. A espectrometria de massa (EM) fornece análise específica do local e quantitativa de modificações de histonas, mas histonas apresentam desafios analíticos únicos. Sua composição de aminoácidos, múltiplos sítios de modificação e padrões combinatórios complexos os tornam mais difíceis de analisar do que proteínas típicas. Protocolos estabelecidos dependem da derivatização química para bloquear resíduos de lisina antes da digestão, melhorando a recuperação peptídica e o desempenho^{cromatográfico 3}. Embora eficazes em análises em massa, esses protocolos de derivatização em múltiplas etapas podem introduzir perdas problemáticas para entradas de célula única. A análise de célula única está cada vez mais importante porque os sistemas biológicos são inerentemente heterogêneos. Histonas em massa analisam sinais médios em muitas células e, portanto, não conseguem capturar essa variabilidade. Subpopulações de células podem diferir em seus estados de cromatina, e essas diferenças podem impulsionar o desenvolvimento, a reprogramação celular ou as respostas a medicamentos ^4,5.

Aqui, apresentamos um método automatizado de preparação de amostras para a análise multiplexada de histonas unicelulares PTM (sc-hPTM2). Esse método depende do sistema CellenONE, que permite a dispensação precisa de células individuais e reagentes em escala de nanolitros de forma automatizada. Esse método é uma variação do método de preparação de amostras nanoproteômicas (nPOP), que introduziu pela primeira vez o uso da preparação de gotículas em uma lâmina^{de vidro 6}. A plataforma nPOP possui proteômica avançada automatizada de célula única, mas seu protocolo padrão de digestão triptática é subótimo para histonas devido ao seu alto teor de lisina e densidade extensa de modificações. Aqui, adaptamos o sistema CellenONE para incorporar a derivatização de histonas padrão ouro com anidrido propiônico e introduzimos a marcação isotópica, permitindo quantificação precisa e abrangente das modificações pós-translacionais de histonas com resolução de célula única. Especificamente, simplificamos o protocolo usando a ArgC Ultra protease para digestão de proteínas. Ao contrário da tripsina, o ArgC se cliva apenas nos resíduos de arginina e não requer bloqueio da lisina. Isso elimina a necessidade de uma estratégia de derivatização em duas etapas, simplificando o protocolo. Além disso, o método incorpora um esquema de marcação isotópica de dois plexos usando anidrido propiônico e anidrido propiônico-d10, permitindo que 2 células sejam analisadas^{simultaneamente 7,3}. Após a digestão e marcação, amostras de célula única são recuperadas e analisadas por cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS)/MS usando aquisição independente de dados (DIA). Em nossas mãos, esse método demonstrou proporcionar aumento tanto na sensibilidade quanto na reprodutibilidade para quantificação dos PTMs de histonas, em comparação com a versão anterior deste^{método 8}.

Para demonstrar o método, perfilamos a dinâmica do PTM de histonas unicelulares em esferoides derivados de células hepatocelulares do carcinoma HepG2/C3A. Tratamos esses esferoides com butirato de sódio, um inibidor de desacetilase de histonas bem caracterizado que aumenta a acetilação das histonas e serve como referência para a avaliação da regulação^{da cromatina 9,10}. Ao comparar esferoides controle e tratados com butirato de sódio em resolução de célula única, demonstramos uma prova de princípio de resultados representativos, destacando o potencial para aplicações mais amplas na biologia da cromatina e epigenética do câncer. Notavelmente, para o protocolo, referimo-nos a uma publicação anterior que descrevia o crescimento e tratamento de esferoides 3D¹⁰, aquisição de peptídeos de histonas na espectrometria^{de massa 11} e análise de dados usando o software^{EpiProfile 12}.

Protocol

1. Buffers e reagentes

1. Meios de crescimento celular para células HepG2/C3A: Prepare o Meio de Águia Modificado (DMEM, 4,5g/L de glicose) da Dulbecco, contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), aminoácidos não essenciais (1% v/v), L-glutamina (1% v/v) e penicilina/estreptomicina (0,5% v/v). O meio de cultivo é armazenado a 4 °C.
2. Mistura master: Prepare ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n-dodecil-β-D-maltosido (DDM) 0,03%, Ditiotreitol (DTT) 10 mM em água de grau LC-MS.
3. Solução de HA: Prepare hidroxilamina a 1% (v/v) em água grau LC-MS.
4. Lavar solução: Prepare 10 mL de uma mistura 50:50 de acetonitrila/água contendo 0,1% (p/w) de ácido fórmico (todos grau LC-MS).
5. Fase A Móvel (MPA) - 0,1% ácido fórmico: Adicione 1 mL de ácido fórmico concentrado a 999 mL de água de grau HPLC e misture bem.
6. Fase B Móvel (MPB) - 80% acetonitrila grau HPLC + 0,1% ácido fórmico: Adicione 800 mL de acetonitrilo grau HPLC a 199 mL de água grau HPLC. Em seguida, adicione 1 mL de ácido fórmico concentrado a essa solução e misture.

2. Preparação dos esferoides

1. Para a preparação dos esferoides, consulte Stransky S et ^al.11.
2. Cultive células hepatocelulares de carcinoma HepG2/C3A em um biorreator tridimensional (3D) rotativo por 5-7 dias para promover a formação uniforme de esferoides até atingir ~400-600 μm de diâmetro. Use DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de L-glutamina e 0,5% de penicilina/estreptomicina. Mantenha os esferoides em 37 °C e 5% de CO₂ até o tratamento.
   NOTA: A Figura 1A representa o equipamento usado para preparar os esferoides no artigo de referência.

3. Cultura celular e tratamento

1. Coloque ~10 esferoides em uma placa de cultura de tecido com 6 poços contendo 2 mL de meio de crescimento.
2. Incube as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ .
3. Trate os esferoides por 24 horas com 5 mM de butirato de sódio ou adicione o mesmo volume de água para o controle (Figura 1B).

4. Isolamento de células e preparação de suspensão de célula única

1. Após 24 horas de tratamento, incube as células com 1 mL de triple a 37 °C por 3-5 minutos.
2. Pipete suavemente para cima e para baixo até que o esferoide se desfaça e se obtenham células individuais.
3. Recolha as células em um tubo de 15 mL e lave, diluindo até 10 mL com PBS 1x gelado, centrifuge a 500 g por 5 minutos a 4 °C e aspire o sobrenadante.
4. Ressuspenda as células em 1 mL de PBS 1x gelado e adicione a coloração verde Sytox para células mortas com concentração final de 1 μM.
5. Incube a célula com Sytox Green por 20 minutos em gelo em um ambiente escuro.
6. Lave a célula com 10 mL de PBS 1x gelado, centrifuge a 500 g por 5 min a 4 °C e aspire o sobrenadante.
7. Ressuspenda as células em 1 mL de PBS 1x gelado e adicione paraformaldeído (PFA) com concentração final de 0,5%.
8. Incube a célula com PFA por 15 minutos no gelo.
   NOTA: Embora o Sytox verde normalmente não seja compatível com a fixação devido à permeabilização de membrana, para as células que testamos, a proporção de células verdes do Sytox permanece a mesma até 8 horas após a fixação, sem sinais de vazamento de proteínas de histonas.
9. Lave a célula com 10 mL de PBS 1x gelado, centrifuge a 500 g por 5 min a 4 °C e aspire o sobrenadante.
10. Reconstituir as células em uma concentração final de 200-500 células/μL.
    NOTA: Para células pequenas que não tendem a depositar, recomenda-se uma concentração de 500 células/μL, enquanto para células grandes que tendem a depositar, recomenda-se uma concentração de 200 células/μL. Se a suspensão da célula for propensa à agregação, passe-a por um filtro de 40 μm antes da aspiração para evitar entupimento do bico. Se células maiores que 40 μm forem de interesse e provavelmente presentes em uma amostra, um peneiro de 70 μm pode ser usado para remover agregados muito grandes.
11. Armazene as células no gelo até serem carregadas no instrumento para separação.

5. Conexão de software e inicialização do sistema

1. Ligue o sistema cellenONE (Figura 2A), inicie o computador de controle, inicie o software e abra o espaço de trabalho do usuário v2.0-nPOP2 ; todos os arquivos de campo e templates de execução necessários para nPOP são pré-carregados lá.
2. Certifique-se de que o resfriador do instrumento esteja ligado, depois defina o valor do ponto de orvalho de perseguir de acordo com a temperatura interna atualmente reportada pelo instrumento.
3. Prepare o sistema com bicos dispensadores tipo 2 de revestimento PDC-70 (Figura 2B) instalados nos slots 1 e 3, seguindo as instruções na tela.
4. Ajuste a largura de pulso e a tensão de acionamento de cada bico nos valores especificados na embalagem do fabricante.
   NOTA: Usar dois bicos separados preserva a consistência da dispensação: um entrega a suspensão da célula, o outro os reagentes, então qualquer detrito aderido ao bico não compromete gotas subsequentes. O uso de ambos os bicos durante a etapa final de coleta também acelera a recuperação da amostra.
   1. (PASSO CRÍTICO) Para máxima eficiência de captação, o deslocamento z entre os dois bicos deve diferir em <50 μm. Determine isso definindo a posição ótima de contato para cada bico e comparando as leituras de altura Z na aba Configuração do Bico.
5. Encha o reservatório do umidificador com água desionizada até a linha de enchimento indicada.

6. Configuração pré-rodada no manuseador de líquidos

1. Selecione a quantidade de lâminas de vidro (Figura 2C) a ser preparado. Essa escolha define diretamente o número total de células planejadas para análise.
2. Para um esquema de multiplexação 2-plex (Figura 3A), carregue um único slide com 320 células.

7. Dispensar um "fosso" de dimetil sulfóxido (DMSO) ao redor das bordas do deslizamento

NOTA: A Figura 3B representa os passos para preparar as amostras no cellenONE a partir do fosso do DMSO. Como prevenção adicional contra a evaporação das gotículas, o DMSO é dispensado ao longo das bordas das lâminas.

1. Na aba Principal, selecione a corrida para 0_Dispense_DMSO_Moat.
2. Vá na aba Configuração de Alvo , carregue o arquivo DMSO_Moat.fld da pasta de esquema apropriada e defina o número de campos para Y, correspondendo ao número de slides planejados para processar.
3. Aliquota 150 μL de DMSO grau LC-MS em um novo tubo PCR e posicione-o na posição 2 da estação CellenWASH com a tampa do tubo voltada para a porta do instrumento.
4. Abra a aba Executar e clique em Iniciar Executar. O sistema aspirará 10 μL de DMSO e fará uma pausa para confirmação do usuário sobre a estabilidade da gotícula. Dispara três gotas de teste de autodrop (Figura 4A); se os três estiverem perfeitamente formados, clique em Continuar Executar.
5. Após a dispensação, os bicos se lavam automaticamente, e o instrumento captura imagens em todos os slides para controle de qualidade. Revise as imagens para verificar uma gota DMSO uniforme em cada lâmina e para verificar gotas ausentes ou fora do alvo (Figura 4B).

8. Dispensar DMSO

1. Na aba Principal , selecione a corrida para 1_Dispense_DMSO.
2. Abra a aba Configuração de Alvos , importe o arquivo de campo DMSO.fld (Figura 4C) do diretório de esquema apropriado e defina o Número de Campos para Y, correspondendo à contagem de slides que você pretende processar.
3. Aliquota 150 μL de DMSO grau LC-MS em um novo tubo PCR e posicione-o na posição 2 da estação CellenWASH com a tampa do tubo voltada para a porta do instrumento.
4. Abra a aba Executar e clique em Iniciar Executar. O sistema aspirará 10 μL de DMSO e fará uma pausa para confirmação do usuário sobre a estabilidade da gotícula. Dispare três gotículas de teste de autodrop; se os três estiverem perfeitamente formados, clique em Continuar Executar.
5. Quando a dispensação termina, o software lava automaticamente os bicos e captura imagens em cada slide para garantia de qualidade. Revise as imagens para verificar uma gota DMSO uniforme em cada lâmina e para verificar gotas faltantes ou fora do alvo.

9. Dispensar células

1. Na aba Principal , selecione a corrida para 2_Dispense_Cells.
2. Na aba Configuração de Alvo , abra a subpasta Arquivos de Campo de Células do diretório de esquema de multiplexação escolhido.
3. Como o experimento envolve duas condições, escolha o arquivo de campo que corresponde à amostra que está prestes a ser ordenada — seja CellType_A.fld ou CellType_B.fld.
4. Após o carregamento do arquivo, defina o Número de Campos para Y, para que seja igual ao total de slides dessa execução.
5. Desgasifice a suspensão da célula do passo 4.11 com uma bomba de vácuo por 10 minutos no gelo.
6. Transfira 150 μL da suspensão da célula preparada para um CellenVIAL limpo, depois coloque o frasco na ranhura 1 do carrossel CellenWASH com a tampa apontando para a porta do instrumento.
7. Vá na aba Configuração do Bocal > Fazer Tarefa e execute Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 para aspirar a amostra do frasco.
8. Permanecendo na aba Configuração do Bico , inicie o visualizador de distribuição de células (Figura 5A) e execute a rotina de mapeamento para definir a zona de ejeção e os objetos de gate com base no tamanho e alongamento. Os parâmetros de isolamento de célula única mostrados na Figura 5A correspondem exatamente às configurações usadas para dispensar células de HepG2/C3A dissociadas dos esferoides.
9. Depois, ative o modo fluorescente selecionando T > F. Defina o modo de seleção para negativo. Aumente a faixa de parâmetros de isolamento para tamanho e intensidade do mínimo aos máximos para garantir que nenhuma célula morta seja isolada.
10. Verifique com os parâmetros de mapeamento, abra a aba Executar e clique em Iniciar Execução, seguindo as instruções do software. Quando a dispensação termina, o instrumento lava automaticamente os bicos e captura imagens das lâminas para revisão da localização e uniformidade das gotículas.
    NOTA: Durante a separação de células, são tiradas imagens de cada célula individual isolada durante a execução (Figura 5B).
11. Após a separação das células, feche a janela de dispensação.
12. Mantenha qualquer suspensão de células restante no gelo até a seção 9 terminar; O excedente pode ser usado posteriormente para amostras em massa, construção empírica de bibliotecas ou estudos adicionais de validação.

10. Dispensador de mistura master de digestão

1. Na aba Principal , selecione a corrida para 2_Dispense_Digest_10ulPickup.
2. Abra a aba Configuração de Alvo , carregue o Digest.fld da pasta apropriada do esquema multiplexado e defina o Número de Campos para Y para que fique igual à contagem de slides para esta execução.
3. Prepare uma mistura master de digestão fresca e desgaseiforme a solução com uma bomba de vácuo por 10 minutos em gelo (mistura master: ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, DDM 0,03%, DTT 10 mM em água grau LC-MS).
4. Pipete 20 μL da mistura master em uma placa de 384 poços e coloque a placa dentro do sistema X1.
5. Na aba Executar , clique em Iniciar Execução e siga as indicações. Após o sistema aspirar o reagente, confirme a estabilidade das gotículas quando solicitado.
6. Quando a dispensação termina, o instrumento automaticamente lava os bicos e fotografa cada lâmina; Revise as imagens para verificar se cada gota recebeu a mistura de digestão de forma uniforme.
7. Incube as lâminas durante a noite para digestão, mantendo as configurações especificadas de umidade e ponto de orvalho. Cada gota contém ~13,5 nL de mistura digestiva. Realize a digestão durante a noite a ~75% de umidade relativa, mantendo o ponto de orvalho 1-2 °C abaixo da temperatura da câmara para evitar a evaporação das gotículas.

11. Incubação durante a noite

1. Na aba Principal , escolha a corrida para 4_Incubation_16h.
2. Mude para a aba Executar , clique em Iniciar Executar.
   NOTA: Os instrumentos tiram fotos das lâminas a cada 30 minutos para monitorar a condição das gotas. Se eles secarem ou incharem durante a incubação, ajuste a configuração do ponto de orvalho conforme necessário.
3. Quando a incubação termina, uma mensagem aparece dizendo que a incubação foi concluída.
   NOTA: Digestão rápida (≤4 h) pode ser possível com condições mais altas de enzima efetiva para substrato; Isso não foi avaliado aqui, então a condição validada permanece em 16 horas.

12. Evaporação

NOTA: Antes de passar à etapa da rotulagem, recomenda-se verificar o estado das gotículas para garantir que não estejam muito inchadas com água, pois a água pode interferir na eficiência da rotulagem. Para esse fim, recomenda-se a fase de evaporação.

1. Na aba Principal , escolha a corrida para 5_Evaporation.
2. Vá para Arquivo, Controle da Unidade de Resfriamento, e sob Controle de Ponto de Orvalho defina a Temperatura de Controle Fixa em 23 °C.
3. Mude para a aba Executar , clique em Iniciar Executar. A secagem dura 5 minutos, e os instrumentos capturam automaticamente fotos dos slides após a secagem.
4. Inspecionar as fotos; Se as gotículas estiverem suficientemente secas, pare a corrida. Se não, clique em continuar e secar por mais 5 minutos (Figura 6A).
5. Ao final da corrida, volte para o Controle de Ponto de Orvalho anterior.

13. Etiquetas dispensam

1. Na aba Principal , escolha a corrida para 6_Dispense_PA_Labels.
2. Vá até a aba Configuração de Alvo , carregue o arquivo Labels.fld da pasta de esquema apropriada e defina o Nº de Campos para Y, correspondendo ao número de slides planejados para processar.
3. Aliquota 150 μL de DMSO grau LC-MS no slot 2 da estação CellenWASH.
4. Prepare uma solução de stock dos dois estoques de marcação para derivatização multiplexada de histonas: anidrido propiônico 25% (v/v) em DMSO e anidrido propiônico 25% (v/v)_{d-d 10} em DMSO.
   NOTA: Desgasifice ambas as soluções antes de transferi-las para a placa para minimizar a formação de bolhas.
5. Dispense 20 μL de cada reagente de marcação nos poços designados de uma placa de 384 poços e coloque a placa dentro do sistema X1. Cada gota recebe ~10 nL de reagente de marcação (25% anidrido propiônico ou 25% anidrido propiônico-d₁₀ em DMSO).
6. Mude para a aba Executar , clique em Iniciar Execução e siga as instruções.
7. Deixe as etiquetas reagirem em movimento por 1 hora.
8. Após a dispensação, o instrumento lava automaticamente os bicos e fotografa cada lâmina. Revise as imagens para confirmar a distribuição uniforme e a colocação correta das gotas em todas as lâminas.

14. Dispensar HA

1. Prepare a solução de HA e desgaseine-a antes do uso.
2. Carregue o frasco. Pipete 150 μL da solução HA em um tubo de PCR limpo, posicione-a no slot 2 do CellenWASH e oriente a tampa em direção à porta do instrumento.
3. Selecione o perfil de corrida. Na aba Principal , escolha 7_Dispense_Quench.
4. Configure o arquivo de campo. Abra a aba Configuração de Alvo , carregue o HA.fld da pasta apropriada do esquema multiplexado e defina o Número de Campos para Y para que seja igual à contagem total de slides.
5. Comece a corrida. Navegue até Executar, clique em Iniciar Executar e siga as instruções na tela.
6. Incubar. Deixe o HA reagir nos slides por 30 minutos.
7. Verifique a dispensação. Após a conclusão, o sistema lava os bicos e captura imagens de cada slide-review essas imagens para confirmar a posição uniforme das gotas e o volume.

15. Coleta de amostra

1. Prepare a solução de lavagem no WashTray XL.
2. Prepare a placa de coleta. Dispense 2 μL de DDM 0,01% (p/w) em água de grau LC-MS em cada poço de uma placa fresca de 384 poços e coloque a placa dentro do manipulador de líquidos.
3. Escolha o percurso de coleta. Na aba Principal , selecione o perfil 8_Pickup_2plex.
4. Carregue o arquivo de campo. Abra a aba Configuração de Alvo , importe o Pick-up.fld do diretório correto do esquema de multiplexação e defina o Número de Campos para Y para que corresponda à contagem de slides.
5. Execute a corrida. Mude para a aba Executar , clique em Iniciar Execução e siga as instruções. O instrumento coletará cada gotícula, lavará os bicos e irá imagear as lâminas para revisão e confirmar que todas as amostras foram retiradas.

16. Processamento pós-retirada

1. Sele a placa de 384 poços com folha adesiva e centrifuge brevemente para trazer gotículas até o fundo dos poços.
2. Remova o papel alumínio e seque as amostras em baixa temperatura em um concentrador a vácuo.
3. Sele a placa com papel alumínio adesivo e armazene a placa seca a -80 °C até estar pronta para análise LC-MS/MS.

17. Preparação de amostras em grande quantidade

1. Usando a suspensão restante da seção 9, centrifuge as células e resuspenda em 1x PBS para obter uma concentração de 2.000 células/μL. Isso deve ser realizado após a conclusão da seção 10.
2. Lisis térmica: congele bruscamente a suspensão restante a -80 °C por 10 minutos, depois choque térmico a 90 °C por 10 minutos.
3. Deixe o tubo esfriar de volta à temperatura ambiente.
4. Transfira 25 μL do lisado para um tubo de PCR e adicione 5 μL da mistura de digestão previamente preparada.
5. Incube durante a noite (≈ 16 h) a 37 °C em um termificador.
6. Derivização por marcador de luz: adicione 5 μL de uma nova marca leve de 25% (v/v) em acetonitrila e incube por 1 hora.
7. Têmpera por reação: adicione 5 μL de solução de hidroxilamina (HA) a 1% (p/w) e incube por 30 minutos.
8. Seque a amostra em um concentrador a vácuo ajustado para baixa temperatura, depois armazene a -80 °C até estar pronta para LC-MS/MS.

18. Configuração de LC/MS e aquisição de dados

NOTA: Para coletar os dados deste manuscrito, foi configurado um sistema LC-MS\MS com uma coluna analítica de Óptica Ionica de 75 μm x 25 cm x 1,7 μm.

1. Prepare as fases móveis para rodar no HPLC:
   Fase Móvel A (MPA): 0,1% de ácido fórmico em água de grau HPLC
   Fase B Móvel (MPB): 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila grau HPLC
2. Programe o método HPLC para um gradiente ativo de 30 minutos: 5-23% MPB em 25,7 min, 23-35% MPB em 2,6 min e 35-45% MPB em 1,7 min, com uma vazão de 200 nL/min. Programe o autosampler para resuspender a amostra em 0,1% FA + 0,01% DDM para captação 'seca'.
3. Configure o método de aquisição do MS para realizar aquisição independente de dados (DIA):
   NOTA: Essas configurações são específicas para um Thermo Exploris 480 equipado com FAIMS Pro Duo e podem variar dependendo do seu instrumento. Recomenda-se o uso daqueles que são comuns para proteômica unicelular DIA com intervalos m/z semelhantes, conforme descrito abaixo.
   1. Defina o MS para uma varredura completa de 300-1100 m/z com resolução de 120.000, alvo AGC de 300%, tempo máximo de injeção de 246 ms e CV FAIMS de -50 V.
   2. Defina o MS/MS para ser uma varredura DIA de 300-1100 m/z com resolução de 60.000, janela de isolamento de 50 m/z, energia de colisão HCD de 27%, primeira massa de 120 m/z, alvo AGC de 1000%, tempo máximo de injeção de 118 ms e CV FAIMS de -50 V.
4. Remova o selo de folha da placa de 384 poços contendo as células individuais. Reconstitua a amostra em massa a 100 células/μL em 0,1% FA + 0,01% DDM e transfira 10 μL para um poço vazio, como P24. Depois, sele a placa com um tapete de borracha perfurável e coloque no autosampler.
5. Execute as missões em fila: execute primeiro as amostras em massa e depois os conjuntos de células individuais.

19. Análise de dados

1. Rode os dados brutos com o EpiProfile2.1 para obter a saída com as abundâncias dos peptidoformas para as células marcadas com anidrido propiônico.
   NOTA: As amostras devem ser adquiridas em um instrumento Thermo para usar o EpiProfile 2.1 para processamento de dados. Este software extrai aproximadamente 250 peptidoformas com sua versão canônica, mas é editável dependendo do organismo, modificações adicionais de interesse, mutações, ^etc.12.
2. Rode os dados brutos com EpiProfile2.1_D5 para obter a saída com as abundâncias de peptidoformas para as células marcadas com anidrido propiônico-d10.
3. Realize o mapeamento que vincula os metadados com as saídas do Epiprofile com o programa quantQC.
4. Filtre amostras que falharam comparando com as bachas.
5. Filtre peptidoformas que não estejam em pelo menos 50% das amostras.
6. Filtrar peptidoformas cujo sinal da intensidade da célula única não seja maior que 150% em espaços em branco.
7. Obtenha a tabela de resultados (Figura 7A) e processe os dados conforme necessário.

Results

Para demonstrar a aplicação do nosso fluxo de trabalho de proteômica de histonas unicelulares usando nosso sistema, analisamos esferoides de células HepG2/C3A tratadas com 5 mM de butirato de sódio por 24 horas. Após a aquisição de LC-MS/MS, os dados brutos foram processados com EpiProfile tanto para marcação leve (anidrido propiônico) quanto pesada (anidrido propiônico-d10), obtendo dados normalizados que representam as abundâncias dos peptídeos e marcas de histonas. O pacote QuantQC R foi então usado para mapear os met...

Discussion

A capacidade de medir modificações pós-traducionais de histonas no nível de célula única representa um passo crítico para entender a verdadeira heterogeneidade da regulação da cromatina. Métodos tradicionais de bloco forneceram insights valiosos sobre a distribuição média dos hPTMs nos tecidos, mas mascaram a variabilidade célula a célula, cada vez mais reconhecida como biologicamente^{significativa 5}. Abordagens proteômicas de célula única agora nos permitem resolv...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos microcentrífugas de 1,5 mL	Bio-Rad	2239480
1000 & micro; Pontas de pipeta de amplo calibre L	Fisher Scientific	14222703
200 & micro; Pontas de pipeta de amplo calibre L	Fisher Scientific	14222730
Placa de PCR de 384 poços Lo Bind	Eppendorf	30129547
Coletor de vácuo de 96 poços	Millipore	MAVM0960R
Acetonitrila, grau Optima LC-MS/MS	Fisher Scientific	A955-1
Folhas adesivas de placas PCR	Thermo Fisher	AB0626
Acetonitrila anidro	Fisher Scientific	AA42311AK	Solução de estoque para etiquetas e lotes
Arg-C Ultra, grau de espectrometría de massa	Promega	VA1831
Água de grau de cultura celular	Corning	25-055-CV
CellenVIALs	DISCIPLINA	/	O número do catálogo vem acompanhado de uma citação
DMSO, Anidro	Thermo Fisher	D12345	Solução de estoque para etiquetas
DTT	Sigma	D0632-5G
Eagle's Medium Modificado (DMEM) de Dulbecco	Fisher Scientific	MT17205CV
Soro Fetal Bovino	Fisher Scientific	MT35010CV
Ácido fórmico	Termodinâmica	28905
Ácido fórmico 98%– 100% para LC-MS LiChropur	Sigma	5330020050
Solução Equilibrada de Sal de Hank (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
HEPES (Ultra Puro)	Thermo Fisher	11344041
Acetonitrilo grau HPLC	Fisher Scientific	A955-4
Água de qualidade HPLC	Fisher Scientific	W5-4
Solução de hidroxilamina 50% em H2O	Sigma	438227-50ML
L-glutamina	Fisher Scientific	MT25015CI
Detergente n-Dodecil-beta-Maltoside (DDM)	Fisher Scientific	BN2005
Aminoácidos não essenciais	Fisher Scientific	MT25025CI
Espectrômetro de Massa Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Paraformaldeído 16% Solução Aquosa Grau EM	Ciências da Microscopia Eletrônica	15710-S
PDC-CM (revestimento tipo 2)	DISCIPLINA	/	O número do catálogo vem acompanhado de uma citação
Penicilina-Estreptomicina	Fisher Scientific	MT3002CI
Soro salino tamponado com fosfato (PBS), 10x, pH 7,4, livre de RNase	Thermo Fisher	AM9625
Dimetilsulfóxido de Pierce (DMSO), grau LC-MS	Thermo Fisher	85190
Pistola de pipeta	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Anidrido propiônico ≥ 99%	Sigma	240311-50G
Anidrido propiônico-d10 ≥ 98 átomos % D, ≥ 99% (CP)	Sigma	615692-1G
Centrífuga refrigerada	Termodinâmica	75-217-420
Slides de vidro revestido SciCHIP H1	DISCIPLINA	/	O número do catálogo vem acompanhado de uma citação
Concentrador a vácuo SpeedVac (placas de 96 poços)	Termodinâmica	15308325	Savant SPD1010
Capuz estéril	Termodinâmica	1375
Pipetas sorológicas estéreis	Fisher Scientific	1367549
Coloração SYTOX Green Dead Cell, para citometria de fluxo	Thermo Fisher	S34860
TrypLE Express Enzima (1X), sem fenol vermelho	Thermo Fisher	12604013
Vórtice	Sigma	Z258415
Banho-maria	Fisher Scientific	FSGPD10