Artigo de método

Caracterização da secreção de vesículas extracelulares derivadas de adipócitos usando um modelo de camundongo repórter CD63-GFP In Vivo e In Vitro

DOI:

10.3791/69670

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5 de dezembro de 2025

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1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

Neste artigo

Resumo

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O protocolo utiliza uma linha de camundongos repórter CD63-GFP específica para adipócitos para visualizar e quantificar a secreção de vesículas extracelulares derivadas de adipócitos (EVs) e demonstrar sua absorção por células progenitoras, revelando uma via paracrina no tecido adiposo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os adipócitos são cada vez mais reconhecidos como células endócrinas ativas que secretam quantidades substanciais de EVs enriquecidos em proteínas, lipídios e ácidos nucleicos. No entanto, os mecanismos que regem a secreção de EVs e a dinâmica da liberação de EVs em diferentes contextos biológicos não são totalmente compreendidos. Para suprir essa lacuna, geramos uma nova linha específica de camundongos repórter CD63-GFP para adipócitos, na qual a expressão do CD63 marcado com GFP é impulsionada pelo promotor de Adiponectina, permitindo a rotulagem seletiva e o rastreamento dos AdEVs in vivo. Usando esse modelo repórter, examinamos a secreção de ADVs e sua entrega aos APCs dentro dos tecidos adiposos. Imagens confocais e citometria de fluxo revelaram que os VeVeA-A-E-S são ativamente absorvidos pelos APCs, destacando um mecanismo anteriormente subestimado de comunicação paracrina no microambiente adiposo.

Para complementar os estudos in vivo , foi estabelecido um sistema in vitro , permitindo o monitoramento direto da secreção de EV a partir de adipócitos diferenciados. As APCs foram isoladas de tecidos adiposos brancos subcutâneos dos camundongos repórteres e induzidas a diferenciar em adipócitos maduros. Nessas células, sinais CD63-GFP foram observados como pontos discretos e enriqueceram na membrana plasmática quando a secreção de EV foi inibida, consistente com o acúmulo de vesículas ao ser bloqueado da liberação. Em condições normais de crescimento, os EVs secretados no meio de cultivo foram concentrados e posteriormente purificados usando cromatografia de exclusão de tamanho, permitindo análises funcionais e bioquímicas posteriores.

Essa plataforma pode ser aplicada a APCs derivados de outros depósitos adiposos, como tecido adiposo branco e marrom epididimático, ou diferenciando-os em adipócitos específicos de depósito, permitindo assim comparações da secreção de EV entre diferentes tipos de adipócitos.

Juntas, essas abordagens introduzem uma ferramenta genética robusta e um sistema complementar in vitro para dissecar a dinâmica da secreção e direcionamento do AdEV. Esses avanços lançam luz sobre a comunicação celular intra-adiposa e lançam as bases para a compreensão da influência metabólica mais ampla dos VeVeA-A-EV na saúde e doença.

Introdução

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O tecido adiposo é cada vez mais reconhecido como um órgão endócrino dinâmico com papéis-chave na homeostase energética do corpointeiro 1,2,3,4,5. Além de sua função clássica como depósito de armazenamento de lipídios, os adipócitos regulam a sensibilidade sistêmica à insulina, e distúrbios na massa adiposa — seja em excesso ou deficiência — estão ligados à resistência à insulina e à doençametabólica 6,7,8,9. Um mecanismo proposto para contribuir para essa capacidade regulatória é a comunicação intercelular por meio de fatores secretados. Embora as adipocinas estejam bem estabelecidas como sinais endócrinos chave do tecidoadiposo 10,11,12,13,14,15,16,17,18, os adipócitos também liberam um número substancial de vesículas extracelulares (EVs), partículas ligadas à membrana contendo lipídios, proteínas, ácidos nucleicos e metabólitos. Se os VEs secretados por adipócitos (AdEVs) também contêm glicanos, assim como outros tipos de VEs, ainda não está claro 19,20,21,22,23,24. Os adipócitos têm sido comprovados como uma fonte principal de EVs, já que aproximadamente 80% dos microRNAs exossmais circulantes se originam de adipócitos em modelos camundongos, como demonstrado em camundongos knockout específicos de adipócitos sob condiçõesbasais 25. Os papéis dos ADVEs no metabolismo, inflamação, sensibilidade à insulina e adipogênese foram relatados, mas permanecem incompletamentecompreendidos 26,27,28,29. Outras funções potenciais, especialmente na mediação da diafonia com outros tipos celulares e órgãos, ainda são amplamente desconhecidas. Aabundância 26 de EVs sugere que eles podem desempenhar papéis importantes tanto na sinalização local quanto no sistêmico, mas a importância biológica e os mecanismos de ação dos ADVs são amplamente pouco explorados. Essa lacuna de conhecimento destaca a necessidade de métodos robustos e especializados para estudar a secreção e a função do AdEV.

Para suprir essa lacuna, geramos camundongos CD63-GFP específicos para adipócitos (AdipCD63-GFP) cruzando camundongos Adiponectina-Cre com camundongos Stopfl/fl/CD63-GFP (cepa#:036865, JAX). Irmãos de ninhadaStop fl/fl/CD63-GFP, que não expressaram CD63-GFP na ausência de Cre, foram usados como controles. A cepa repórter CD63-GFP foi usada com sucesso para rastrear EVs específicos de tipo celular in vivo, incluindo EVs derivados de endotelios eneurônios 30,31. Como a adiponectina é expressa apenas em adipócitos maduros e não em células progenitoras dos adipócitos (APCs)32,33, e CD63 é um marcador dos EVs34, os EVs GFP+ detectados na circulação e nos tecidos podem ser especificamente identificados como ADEs. Assim, neste estudo, os VEs GFP+ detectados nos APCs são interpretados como ADVs que foram absorvidos por essas células progenitoras. Esse sistema repórter permite o monitoramento direto da liberação de vesículas e das potenciais interações alvo in vivo e in vitro, possibilitando o estudo de ADEVs em outros tipos celulares de tecido adiposo. Importante destacar que os VeVe-A-E-A-E-S-O-S-E-S-O-S-E-S-E-S-O-S-E-S-E-D-E-S-O-S-E-E-S-O-S-E-S-O-S-E-S- Altas forças centrífugas podem danificar essas vesículas ou levar a perda significativa de amostras e contaminação, complicando a análise a jusante. Para superar essas limitações, otimizamos um fluxo de trabalho que combina múltiplos passos de centrifugação em baixa velocidade com cromatografia por exclusão de tamanho, que minimiza o esforzo de cisalhamento, preserva a integridade das vesículas e melhora a pureza e o rendimento, permitindo quantificação precisa e estudos funcionais. Juntos, o sistema CD63-GFP e esse pipeline otimizado de isolamento fornecem uma abordagem acessível e reprodutível para investigar a secreção e a função do AdEV na diafonia do tecido adiposo e na regulação metabólica sistêmica.

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Protocolo

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De acordo com as diretrizes de cuidado e uso animal do Albert Einstein College of Medicine, os ratos machos foram alojados em grupo a 22 °C com umidade relativa de 30-70% em um ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridão, receberam acesso ad libitum a comida e água, e foram mantidos em um fundo C57BL/6J.

1. Detecção in vivo de ADVs secretados por meio da absorção por APCs

  1. Preparação do tampão
    1. Buffer de digestão: Prepare DMEM tamponado com HEPES adicionando 0,5 mL de 1 M HEPES e 0,5 g de albumina sérica bovina pobre em ácidos graxos (BSA) a 50 mL de DMEM. Misture até dissolver.
    2. Lavar o tampão: Prepare PBS com 2,5 mM de ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) e 4% de soro fetal bovino (FBS).
    3. Prepare Liberase e DNase 1 estoque a 5 mg/mL e 5 KU/mL. Armazene a -20 °C. Descongele imediatamente antes do uso.
  2. Coleta e digestão do tecido adiposo inguinal
    NOTA: Camundongos controle AdipCD63-GFP e CD63-GFP de quatro meses foram eutanasiados por inalação de dióxido de carbono.
    1. Retirar tecidos adiposos com técnica estéril e colocar 1 g de tecido em 0,5 mL de tampão digestivo, e triturar finamente o tecido usando tesoura estéreis em pedaços no máximo de 1 mm.
    2. Suspenda o tecido picado em 10 mL de tampão digerido contendo 0,5 mg/mL de Liberase e 50 U/mL de DNase 1.
    3. Incube a 37 °C em um agitador orbital (100 rpm) por 30-60 minutos. Misture suavemente o tecido invertendo o tubo algumas vezes durante a incubação. Quando a solução parece turva e não restam fragmentos visíveis de tecido, a digestão é considerada concluída.
  3. Isolamento dos APCs
    1. Dilua a suspensão com dois volumes do buffer de digestão e inverta suavemente o tubo 3-4 vezes.
    2. Passe por um filtro estéril de 100 μm para remover qualquer tecido não digerido.
    3. Centrifuge o filtrado a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
    4. Descarte a parte do adipócito sobrenadante e rotule o pellet como fração vascular estromal (SVF).
    5. Prepare um tampão de lise de 1× glóbulos vermelhos (RBC) fresco com água estéril. Lisar os glóbulos vermelhos no SVF incubando no gelo por 5 minutos, protegido da luz.
    6. Adicione dois volumes de tampão de lavagem, depois filtrado com centrífuga a 400 × g por 5 minutos a 4 °C.
    7. Siga o protocolo de kit de isolamento progenitor do tecido adiposo (camundongo), ressuspenda o SVF em 80 μL de tampão (PBS, pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) por grama de tecido.
    8. Adicione 20 μL de coquetel de depleção de progenitores não adipócitos por grama de tecido.
    9. Misture e incube por 15 minutos a 2-8 °C no escuro.
    10. Passe a amostra pela coluna LS e colete o fluxo contínuo.
    11. Centrifuge o fluxo contínuo (negativo para CD31, CD45, Ter119) a 300 × g por 5 minutos a 4 °C para obter os APCs para o estudo.
  4. Detecção de ADEVs secretados por meio da captação de APC por microscopia confocal
    1. Semeie 250 μL de APCs isolados (1 × 104 células/mL) de camundongos AdipCD63-GFP ou CD63-GFP em lâminas de câmara de 8 poços revestidas com colágeno e permita que as células se conectem por aproximadamente 6 horas.
    2. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 10 minutos para preservar as estruturas celulares e EV para imagem.
      NOTA: Nesses ensaios, sinais de GFP marcam os AdEVs, e sua detecção em APCs por microscopia confocal indica a absorção de AdEVs por essas células progenitoras.
    3. Lave as lâminas três vezes com PBS, monte com meio antidescolorante e capture sinais de GFP usando um microscópio confocal equipado com uma meta de imersão em óleo de 63×. Adquira imagens como pilhas da série z com um passo de 0,5 μm, usando um laser de 488 nm para excitação GFP e detectando emissão em 500-550 nm.
  5. Detecção de ADEVs secretados por meio da captação de APC por citometria de fluxo
    1. Conte APCs e dilua o corante de viabilidade (por exemplo, Zombie) em 1:1000 em PBS 1X. Suspenda as células a 1 × 106 por 100 μL. Incube por 20 minutos no gelo, protegido da luz.
    2. Lave as células uma vez com o buffer de lavagem. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
    3. Suspenda as células em tampão de coloração brilhante a 1 × 106 células por 100 μL.
    4. Bloqueie a ligação inespecífica com o reagente bloqueador do receptor Fc (por exemplo, anti-CD16/CD32) 1:100 no gelo por 10 minutos.
    5. Pré-centrifugar o anticorpo Sca-1 a 6.000 × g por 10 minutos a 4 °C. Depois, adicione 1 μL do anticorpo Sca-1 ao tubo APC e incube por 20 minutos no gelo, mantendo o tubo coberto com papel alumínio.
    6. Lave duas vezes com 1 mL de tampão de lavagem, centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
    7. Suspenda as células em buffer de lavagem em torno de 1 × 106 células por 500 μL para classificação por citometria de fluxo. Adquira dados para células Sca1+ e GFP+ em um citômetro de fluxo espectral equipado com um laser violeta de 405 nm (filtro 450/50 nm para Pacific Blue) e um laser azul de 488 nm (filtro 530/30 nm para GFP). Analise as amostras usando o software em execução do instrumento, com células Sca1+ com gate, e o subconjunto GFP+ dentro dessa população analisado, conforme mostrado na Figura 2.

2. Detecção e análise dos AdEVs secretados in vitro

  1. Diferenciação de APCs em adipócitos maduros
    NOTA: Todas as culturas são mantidas a 37 °C, 8% de CO2 , salvo indicação em contrário.
    1. Dia 0: Cobrir os recipientes com gelatina 0,2% por 30 minutos em temperatura ambiente (RT), aspirar e semear APCs recém-isolados em DMEM/F12 + 15% FBS + 1% Penicilina/Estreptomicina (P/S) + 0,1% de Primocina para atingir 100% de confluência antes da diferenciação.
    2. Dias 1-8: Substituir pelo meio diferenciador adipopênico MesenCult (50 mL no total: 45 mL de base + 5 mL de suplemento + 0,5 mL de GlutaMAX + 50 μL de Primocina), trocar para meio de diferenciação fresco no quarto dia.
    3. Dia 9: Lave os adipócitos duas vezes com PBS, depois substitua por meio maduro de cultivo de adipócitos (DMEM +1% BSA + 0,2% Primocina) e mantenha por 16 horas.
  2. Isolamento e purificação de ADEV
    1. Passe 15 mL de cultura de adipócitos gerada acima, primeiro por um filtro de 40 μm e depois por um filtro de 30 μm.
    2. Centrifuge o filtrado a 500 × g por 5 minutos, depois 2.000 × g por 10 minutos para remover células residuais e detritos.
    3. Passe o filtrado por um filtro de 0,8 μm, depois concentre o meio de 15 mL a 0,5 mL usando uma unidade de ultrafiltração de corte de 100 kDa (volume de amostra de 15 mL) centrifugando a 4.000 × g por 15 min.
    4. Carregue a amostra nas colunas de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com um coletor automático de frações e colete frações F1-8.
    5. Concentre as frações de EV coletadas usando uma unidade de ultrafiltragem de corte de 100 kDa (volume de amostra de 4 mL) e prossiga para a verificação do conteúdo de EV de cada fração por western blot, instrumento de rastreamento de nanopartículas e microscopia eletrônica de transmissão (MET).
  3. Validação, quantificação e avaliação de tamanho/morfologia do AdEV
    1. Análise de Western blot de marcadores EV
      1. Concentre cada fração de 400 μL a 25 μL, depois adicione 50 μL de tampão de radioimunoprecipitação (RIPA) suplementado com protease e inibidores de fosfatase. Desnaturalize as amostras adicionando 2× de sulfato de dodecil de sódio (SDS) de tampão e resolva proteínas em um gel de trisglicina de 4-12%.
    2. Análise do tamanho, concentração e qualidade dos EVs usando um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas.
      1. Antes da análise, dilua as amostras de EV com PBS estéril filtrado de 0,1 μm na proporção 1:1000, garantindo que a concentração da partícula esteja dentro da faixa ótima de detecção (aproximadamente10 7-10 9 partículas/mL). Misture delicadamente as amostras diluídas para evitar a formação de bolhas.
      2. Carregue a amostra no instrumento equipado com uma câmera científica complementar de semicondutores de óxido metálico (sCMOS) de alta sensibilidade, um módulo laser verde de 532 nm e um limiar de detecção de 10 nm (até 1.000 nm)/ 106 a10 9 partículas/mL.
      3. Realize imagens e quantificação usando o software NS Xplorer, que aplica um algoritmo dinâmico de concentração baseado em volume de observação.
    3. Exame da morfologia dos EV por microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
      1. Submeta 50 μL de EVs, coletados antes da concentração, à instalação central para coloração negativa dos EVs. Aplique EVs em grades de cobre apenas de carbono, de 400 malhas, que foram limpas com plasma e um limpador de plasma.
      2. Após uma breve adsorção, enxágue as grades com água destilada, faça uma mancha negativa com acetato de uranila a 1% (p/v) e remova o excesso de mancha com papel filtro antes de secar ao ar. Depois, imageie as grades usando um microscópio eletrônico de transmissão operado a 120 KV.

3. Informações sobre segurança e resíduos

  1. Manuseie paraformaldeído e acetato de uranila em uma coifa com equipamentos de proteção individual (EPI), pois ambos são tóxicos. Colete resíduos de acetato de uranila em recipientes perigosos rotulados.
  2. Tratar todas as amostras biológicas como potencialmente infecciosas e descartar materiais de acordo com as políticas e protocolos institucionais de biossegurança aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal (IACUC).

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Resultados

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Usando esse protocolo de detecção de ADEVs por meio da captação de APCs por microscopia confocal, isolamos APCs dos tecidos adiposos inguinais de camundongos AdipCD63-GFP e Stopfl/fl/CD63-GFP e os colorimos com DAPI para visualização dos núcleos. Quando examinados por microscopia confocal, APCs de camundongos Stopfl/fl/CD63-GFP não mostraram pontos de GFP detectáveis (Figura 1A). Em contraste, APCs isolados de camundongos AdipCD63-GFP apresentaram numerosos pontos disti...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descrito preenche uma importante lacuna metodológica ao fornecer um sistema robusto e reproduzível para isolar e caracterizar os ADEVs e sua adoção por APCs. Comparados aos EVs de outras fontes, os AdEVs são mais ricos em lipídios e flutuantes, tornando as técnicas clássicas de isolamento de EVs baseadas em ultracentrifugação menoseficientes 35. No entanto, a maioria dos protocolos publicados para purificação de ADEV ainda depende da ultracentrifugação...

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Divulgações

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Os autores não têm interesse financeiro a declarar.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Einstein Flow Cytometry Core pelo FACS e à Analytical Imaging Facility por todas as análises de imagens. Esse trabalho foi apoiado em parte por subsídios do National Institutes of Health DK128839 e por P30CA013330 de apoio ao centro de câncer do NCI.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 M EDTA, pH 8,0FisherAM9260GDiluição 500x
10x PBSFisher Scientific70-013-0321000x diluição com água
1 M HEPESGibco156300801000x diluição
Kit de Isolamento de Progenitores do Tecido Adiposo, camundongoMiltenyi biotec30-106-639Pronto para uso
Filtro Centrífugo Amicon Ultra, MWCO de 100 kDaSigmaUFC9100Volume de amostra de 15 mL
Filtro Centrífugo Amicon Ultra, MWCO de 100 kDaSigmaUFC9100Volume de amostra de 4 mL
BSASigmaA6003Pronto para uso
Anticorpo de CalnexinaCalnexinaAB225951000x diluição
Anticorpo CD63Abcamab217345Diluição 500x
CD81Tecnologia de sinalização celular10037sDiluição 500x
Corning  BioCoat  Slide da Cultura Colágeno ISigmaCLS354630Pronto para uso
Corning  Filtro de célulasSigmaCLS43175040 & mu; m tamanho dos poros
Corning  Filtro de célulasSigmaCLS431752100 & mu; m tamanho dos poros
Anticorpo COX IVTecnologia de Sinalização Celular48441000x diluição
DMEMGibco11965092Pronto para uso
DMEM/F-12, suplemento GlutaMAXThermofisher10565018Pronto para uso
Dnase 1SigmaD4513Estoque 5 KU/mL em -20 ° C
Suplemento GlutaMAXGibco35050061100x diluição
Halt & trade; Cocktail de Protease e Inibidor de Fosfatase (100X)Thermofisher78444Pronto para uso
Anticorpo HSP70Abcamab1816061000x diluição
Invitrogen eBioscience 10X Lysis Buffer de RBC (Multiespécies)Fisher Scientific50-112-974310x diluição em água
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPFisher ScientificNC2042225Pronto para uso
Microscópio confocal LEICA STELLARIS 8Microscópios LeicaN/A
Liberase TM Grau de PesquisaSigmaLIBTM-ROEstoque 5 mg/mL a -20 °C; C
Filtro de seringa Millex MCESigmaSLAA0250,8 & mu; m tamanho dos poros
NanoSight ProMalvern PanalyticalN/A
Novex Tris-Glicina Mini Géis de Proteína, 4– 12%,ThermofisherXP04120BOXPronto para uso
Buffer de Amostra SDS Tris-Glicina Novex (2x)ThermofisherLC2676Pronto para uso
Anticorpo anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1) Azul do PacíficoBioLegend108119Diluição 25x
Solução de paraformaldeído (16%)Fisher Scientific50-980-487diluir para 4% com PBS
pluriStrainer S / 30 & micro; m (Filtro de células)Fisher ScientificNC092245930 & mu; m tamanho dos poros
Solução Ponceau SSigmaP7170-1LPronto para uso
PrimocinInvivogenNC9141851Diluição 500x
Reagente Antifade de Ouro ProLong com DAPITecnologia de Sinalização Celular8961SPronto para uso
Anticorpo anti-camundongo purificado CD16/32BioLegend101301100x diluição
Buffer RIPA Fisher ScientificPI8990010x diluição em água
Citômetro de fluxo espectral (Aurora 3)Cytek BiosciencesN/A
Anticorpo Sintaxina 4Sistemas Sinápticos110042Diluição 5000x
Tecnai 20 (Microscópio Eletrônico de Transmissão)FEIN/A
Tergeo-EMPIE Scientific LLCN/A
Anticorpo vinculinaAbcamab18508Diluição 5000x

Referências

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