Artigo de método

Estabelecimento de um modelo de periimplantite de rato via colocação de implante de titânio maxilar e indução de ligaduras por Porphyromonas gingivalis

DOI:

10.3791/69682

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6 de março de 2026

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1Department of Prosthodontics, The Affiliated Stomatological Hospital, Southwest Medical University, 2School of Stomatology, Southwest Medical University, 3Institute of Stomatology, Southwest Medical University, 4Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Southwest Medical University, 5The First People's Hospital of Yibin, 6The Second People's Hospital of Deyang, 7Department of Periodontics & Oral Mucosal Diseases, The Affiliated Stomatology Hospital, Southwest Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo estabeleceu um modelo de peri-implantite em ratos usando implantes de titânio maxilar, envolvendo extração dentária, implantação cirúrgica de dispositivos de titânio e subsequente indução da perda óssea inflamatória por meio da colocação de ligaduras embebidas em Porphyromonas gingivalis ao redor do pescoço do implante após a cicatrização.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A peri-implantite (PI) é uma das principais causas de falha do implante dentário, caracterizada por lesões inflamatórias de tecidos moles e perda óssea progressiva, exigindo modelos animais confiáveis para pesquisas mecanicistas e terapêuticas. Este estudo estabeleceu um modelo inovador de ratos que combina sinergisticamente irritação mecânica com infecção bacteriana para melhor imitar a patogênese da PI humana. Após a extração dos primeiros molares maxilares em 12 ratos machos de Sprague-Dawley (4 semanas) e um período de cicatrização de 8 semanas, foram colocados implantes de titânio. Após 4 semanas de osseointegração, o grupo PI (n = 6) recebeu ligaduras impregnadas com Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) ao redor dos covos do implante, enquanto o grupo controle negativo (NC) (n = 6) não recebeu tratamento com ligadura. Duas semanas após a indução, análises por meio de microtomografia computadorizada (micro-CT) e histologia revelaram perda significativa do osso alveolar e inflamação severa dos tecidos moles, incluindo marcante infiltração celular inflamatória e destruição tecidular, no grupo PI em comparação ao grupo NC. Esse modelo validado recapitulou efetivamente características-chave do PI clínico. Suas limitações incluem um desafio simplificado de monopatógeno e um curso acelerado da doença em comparação com a PI humana. No entanto, ele oferece uma ferramenta robusta e clinicamente relevante para estudos investigativos e terapêuticos.

Introdução

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Com os avanços na odontologia protética, os implantes dentários têm aplicação clínica em constanteexpansão 1. No entanto, a periimplantite (PI), como a complicação mais prevalente, compromete significativamente a sobrevivência a longo prazo dos implantes dentários e leva a efeitos prejudiciais persistentes na saúde bucaldos pacientes 2. A PI é uma condição inflamatória patológica dos tecidos periimplantais, principalmente impulsionada pela disbiose do microbioma do biofilme da placa, e é caracterizada por inflamação progressiva dos tecidos moles peri-implantes e consequente perda do ossode suporte 3,4. Com taxas de prevalência em nível de paciente e implante estimadas em 19,53% e 12,53%, respectivamente5, e considerando a natureza complexa e custosa de seu manejo, o PI representa um ônus clínico e de saúde públicasubstancial 6.

A elucidação da complexa patogênese do PI e o desenvolvimento de terapias eficazes dependem fundamentalmente de modelos animais robustos que replicam fielmente a doençahumana 7,8. Embora modelos animais grandes como cães e mini-porcos ofereçam semelhanças anatômicas, seu uso em investigação mecanicista profunda é limitado por altos custos, preocupações éticas e habitacionais, e pela falta de ferramentas moleculares específicas paracada espécie. Modelos de roedores, por outro lado, apresentam vantagens de custo-benefício, manejo mais fácil e abundante manipulabilidade genética, facilitando a investigação detalhada das viasmoleculares 10. O modelo camundongo, no entanto, é frequentemente limitado por seu tamanho pequeno e pelos desafios técnicos dos procedimentoscirúrgicos 11. Essas limitações são agravadas por questões procedimentais em métodos estabelecidos, como a natureza focal e a perda prematura de ligadura comuns nos modelos12 de periodontite murina. O rato surge como um compromisso pragmático, oferecendo um campo operatório maior, utilidade estabelecida na pesquisa de cicatrização óssea e a disponibilidade de cepas transgênicas para sondar fatores genéticosespecíficos 13, tornando-o um candidato altamente adequado para modelagem de PI. Apesar do seu potencial, a adoção dos modelos PI em ratos é limitada por complexidades técnicas nos procedimentos cirúrgicos, incluindo extração confiável de dentes e colocação consistente de implantes.

As técnicas existentes de indução em modelos de ratos incluem colocação de ligaduras deseda 14,15, inoculação local contra patógenos16 e injeção de lipopolissacarídeos17. Modelos de infecção anteriores que dependiam da lavagem bacteriana oral frequentemente resultam em formação instável de biofilme e respostas inflamatóriasinconsistentes 18. O método de ligadura de seda é comum para promover o acúmulo rápido de placas. No entanto, a ligadura sozinha representa um insulto mecânico não fisiológico e não incorpora um desafio patogênico controlado, representando inadequadamente a etiologia da doença infecciosa do PI19. A monoinfecção por patógenos como P. gingivalis, por outro lado, frequentemente tem dificuldade em estabelecer um biofilme estável e pode não induzir inflamação robusta de formaconsistente. Hipotetizamos que o procedimento de ligadura causa insultos duplos: o ponto de seda atua como irritante mecânico e andaime para a formação de biofilmes complexos, enquanto o patógeno keystone, P. gingivalis, provoca e perpetua uma resposta inflamatória disbiótica21. Para resumir visualmente essa abordagem integrada dual-patogênica e sua progressão temporal, é apresentada uma visão esquemática do procedimento experimental e do cronograma para estabelecer esse modelo combinado de rato com ligação a P. gingivalis (Figura 1). Este artigo detalha o estabelecimento e validação desse modelo combinado de ligação de P. gingivalis, projetado para reproduzir de forma confiável a patologia crítica óssea e de tecidos moles da PI humana, aumentando assim a relevância clínica e a utilidade do modelo para pesquisas pré-clínicas.

Figura 1
Figura 1: Diagrama Esquemático da linha do tempo do procedimento experimental para estabelecer um modelo de peri-implantite em ratos induzido pelo método de ligadura com sutura carregada de bactérias. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Protocolo

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O tamanho da amostra foi determinado com base em práticas comuns em modelos de peri-implantite (PI) em roedores publicados anteriormente e nas limitações dos recursosdisponíveis 22. Doze ratos machos Sprague-Dawley de 4 semanas (fornecidos pelo Experimental Animal Center da Southwest Medical University, Licença nº: SCXK (Chuan) 2024-0046) foram usados para extração dentária, colocação de implantes e indução de PI. Todos os ratos foram mantidos em uma instalação padrão de barreira específica e livre de patógenos (FPS), com animais de diferentes grupos experimentais alojados separadamente. As localizações das gaiolas dentro do suporte eram randomizadas semanalmente. Os ratos foram designados ao grupo controle negativo (NC) ou PI (n = 6 por grupo) usando um gerador de números aleatórios. A ordem dos procedimentos cirúrgicos para todos os ratos é randomizada. Todos os procedimentos são aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Southwest Medical University (Aprovação nº 20241111-012) e seguem as diretrizes de bem-estar animal. Este estudo é conduzido de acordo com os princípios das 3R (Substituição, Redução, Refinamento) para a pesquisa ética com animais. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação pré-extração

  1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos (explorador dentário #5, suporte de agulha, pinças oftálmicas, cotonetes médicos, pinças de tecido, etc.) por autoclavagem. Realize todos os procedimentos subsequentes dentro de um armário de biossegurança Classe II para manter condições assépticas.
  2. Administrar injeção intraperitoneal de tribromoetanol (250 mg/kg) para anestesiar osratos 23 (seguindo protocolos institucionalmente aprovados). Confirme a profundidade da anestesia pela ausência de reflexo de retirada em resposta a um beliscão na pata traseira.
  3. Aplique lubrificante oftálmico para evitar a dessecação da córnea durante os procedimentos.
  4. Desinfete cuidadosamente todas as superfícies de trabalho usando uma solução de etanol a 75%.
  5. Posicione o rato em posição supina sobre uma plataforma cirúrgica estável. Retrair os incisivos maxilares e mandibulares usando elásticos para alcançar e manter a máxima abertura da boca. Ilumine a cavidade bucal com um farol cirúrgico.
  6. Segure a língua suavemente com pinças de tecido e retraha-a para um lado. Certifique-se de que a língua esteja segurada com segurança para manter uma visão clara e desobstruída dos molares maxilares.

2. Procedimento de extração dentária

  1. Desinfete o local cirúrgico com povidona-iodo. Posicione um explorador dentário #5 na superfície distal do primeiro molar maxilar (espaço interproximal entre o primeiro e o segundo molar) e aplique força mesiodistal para alcançar a luxação inicial (Figura 2A).
  2. Reposicione o explorador na superfície mesial do primeiro molar e reaplique a força mesiodistal para mobilizar ainda mais o dente (Figura 2B).
  3. Coloque a ponta do explorador no sulco gengival palatal. Aplique uma combinação de movimento rotacional bucco-palatino suave e pressão oclusal sustentada ao longo do eixo longo do dente. Continue até que o dente esteja totalmente deslocado do alvéolo (Figura 2C,D).
  4. Inspecione cuidadosamente o dente extraído sob visão direta para confirmar que todas as raízes estão intactas e que não há fraturas. Irrige suavemente o alvéolo vazio com um jato de soro fisiológico normal de uma seringa estéril para remover quaisquer coágulos ou resíduos de sangue (Figura 2E,F).
  5. Alcance a hemostasia aplicando pressão estéril de cotonete por 1 minuto. Volte a língua à posição anatômica. Mantenha o animal na bolsa térmica até a recuperação total da anestesia.
  6. Forneça uma dieta suave e água potável suplementada com antibióticos (Amoxicilina 250 mg/kg) por uma semana.
    NOTA: Aplique força controlada e progressiva durante a luxação e evite movimentos abruptos para evitar fraturas radiculares ou danos no osso alveolar.

Figura 2
Figura 2: Procedimento de extração dentária. Uma sonda dentária foi inserida nos aspectos distal e proximal do primeiro molar maxilar do rato para liberar os ligamentos periodontais (A,B). Aplicação palatina de forças rotacionais e oclusais para luxar o dente (C,D). O alvéolo foi examinado minuciosamente em busca de fragmentos residuais de raiz (E). Um primeiro molar maxilar intacto do rato é mostrado (F). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Cirurgia de colocação de implante

  1. Oito semanas após a extração, crie uma incisão mesiodistal de 5 mm sobre a crista edêntula usando uma lâmina estéril 12c, penetrando até a superfície óssea (Figura 3A).
  2. Utilize o explorador #5 para dissecação obtusa e eleve retalhos mucoperiosteis de espessura total, expondo o local cirúrgico (Figura 3B).
  3. Conecte uma broca de carboneto de tungstênio (1,5 mm de diâmetro) a um adaptador de chave de fenda manual e realize osteotomia por rotação manual no sentido horário com irrigação salina intermitente para controle térmico, preparando um sítio de implante de 4 mm de profundidade dentro do soquete de extração cicatrizado, mantendo feedback tátil contínuo para evitar perfuração cortical (Figura 3C).
  4. Insira implante de titânio feito sob medida (1,8 mm de diâmetro, 3,2 mm de comprimento, superfície usinada) usando rotação no sentido horário. Verifique a estabilidade pela ausência de mobilidade na aplicação do explorador (Figura 3D-F).
  5. Permita um período de cicatrização de uma semana com dieta suave contínua e tratamento de antibióticos conforme descrito anteriormente.
    NOTA: Empregue uma técnica cirúrgica suave e evite força axial excessiva para evitar perfuração iatrogênica do assoalho do seio maxilar.

Figura 3
Figura 3: Procedimento de colocação do implante. Uma incisão mesiodistal foi feita usando uma lâmina curva nº 12 (A). O retalho mucoso foi refletido com uma sonda dentária (B). Uma osteotomia foi realizada usando uma broca de carboneto de tungstênio de 1,5 mm acoplada a uma broca manual (C). O implante foi colocado no osso maxilar por meio de um suporte personalizado (D). Após a implantação, uma sonda foi usada para verificar a mobilidade (E,F). Implante de titânio feito sob medida (rosca lisa de superfície, diâmetro 1,8 mm, comprimento 3,2 mm), suporte correspondente do implante (G,H) e mini furadeira manual (I). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Preparação de pontos ligados por P. gingivalis

  1. Cultive P. gingivalis anaeróbicamente a 37 °C em 5 mL de caldo de infusão cardíaca cerebral (BHI) até atingir 10,9 CFU/mL (OD600 = 1,0).
  2. Transfira a suspensão com diluição de 1:20 para 10 mL de meio BHI fresco.
  3. Imerga completamente suturas de seda 3-0 estéreis em meio inoculado. Incubar anaeróbicamente a 37 °C por 48-72 horas para estabelecer um biofilme maduro.

5. Indução de PI

  1. Quatro semanas após a implantação, ligue uma sutura embebida em P. gingivalis ao redor do pescoço do implante usando um suporte estéril para agulhas. Fixe com um nó triplo adjacente ao tecido gengival (Figura 4A-D).
  2. Mantenha a ligadura por 2 semanas enquanto monitora a progressão inflamatória.
  3. Realize a inspeção diária das ligaduras. Substitua se estiver solto ou perdido usando uma técnica asséptica.
    NOTA: Ao fazer nós, separe suavemente o tecido mole para evitar rasgos e certifique-se de que o nó de sutura esteja posicionado subgingivamente.

Figura 4
Figura 4: Procedimento de PI induzido por sutura: O fio preparado embebido em bactérias (3-0) foi colocado na posição subgingival na extremidade distal do implante (A). O primeiro nó era feito e preso com um suporte de agulha para evitar a luxação do nó (B). Em seguida, faça um nó triplo para evitar o deslizamento do ponto (C,D). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Eutanásia e coleta de amostras

  1. Após um período de indução de 2 semanas, eutanasie os animais por luxação cervical sob anestesia profunda de isoflurano (seguindo protocolos institucionalmente aprovados). Dissecar as maxilas intactas com os implantes usando instrumentos afiados.
  2. Imerga imediatamente as amostras em paraformaldeído a 4% para fixação a 24 horas. Remova o tecido mole residual com irrigação PBS e armazene 70% de etanol.
    NOTA: O experimento pode ser pausado nesta fase com armazenamento de longo prazo em etanol de 70% a 4 °C.

7. Análise de tomografia microcomputadorizada (micro-CT)

  1. Escaneie amostras usando tomografia microcomputada de acordo com a metodologiaestabelecida 24.
  2. Ligue o scanner e o computador. Inicie o software de aquisição. Clique no ícone de segurança radiológica e permita um aquecimento de 15 minutos.
  3. Abra a câmara de varredura. Monte a amostra em um tubo cônico de 15 mL estabilizado com espuma de baixa densidade, depois fixe o tubo no estágio rotativo e posicione-o dentro da câmara de varredura.
  4. Inicie a fonte de raios X (90 kV, 80 μA). Clique no ícone de pré-visualização para confirmar o posicionamento ideal. Defina os parâmetros: resolução de 12 μm , exposição de 20 Hz , 4000 quadros totais.
  5. Reconstrua imagens usando o software Recon 1.7.4.0.
  6. Analise os seguintes parâmetros ósseos no software Avatar 1.7.4.0 delineando um ROI na região do primeiro molar maxilar: fração de volume ósseo (BV/TV), razão superfície-volume ósseo (BS/BV), espessura trabecular (Tb.Th) e número trabecular (Tb.N).

8. Processamento histológico

  1. Descalcifique amostras fixas em 10% de EDTA (pH 7,4) com trocas de solução a cada 72 horas por 4 semanas. Verifique a conclusão por meio de um teste de penetração por agulha.
  2. Amostras desidratadas por uma série de etanol: 75% de etanol por 4 horas, 85% de etanol por 2 horas, 90% por 2 horas, 95% por 1 hora, e duas trocas de 100% de etanol por 30 minutos cada.
  3. Amostra clara em xileno com duas mudanças de 10 minutos cada. Infiltre com parafina usando três mudanças por 1 hora cada.
  4. Infiltre os tecidos em parafina derretida e resfrie em um estágio de congelamento a -20 °C. Apare os blocos e armazene a 4 °C por 10 horas antes de seccionar.
  5. Bloqueios de parafina de seção com 5 μm de espessura. Coloque as seções flutuantes em banho-maria a 45 °C e monte em slides de vidro. Desliza a seco a 37 °C por 1 hora.
  6. Desparafinize as seções com duas mudanças de xileno por 5 minutos cada. Reidrate por uma série graduada de etanol: 100% etanol por 5 minutos, 90% etanol por 5 minutos, 80% etanol por 5 minutos e 70% etanol por 5 minutos.
  7. Enxágue as seções em água destilada por 1 minuto. Tinga com hematoxilina por 8 minutos e depois enxágue com água da torneira corrente.
  8. Diferencie em álcool ácido 1% por 3 segundos. Enxágue com água da torneira para azular. Contra-tinga com eosina por 5 minutos.
  9. Seções desidratadas por séries de etanol graduado: 70% etanol por 10 s, 80% etanol por 10 s, 90% etanol por 10 s e 100% etanol por 10 s. Limpo em duas trocas de xileno por 5 minutos cada.
  10. Monte coberturas com bálsamo neutro e examine sob um microscópio óptico.
    NOTA: O xileno é perigoso. Use em uma exaustão com EPI apropriado.

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Resultados

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Todos os doze ratos Sprague-Dawley de 4 semanas inscritos no estudo completaram com sucesso todos os procedimentos cirúrgicos e apresentaram osseointegração estável antes da ligadura, atendendo ao critério pré-definido de recuperação sem complicações. Nenhum animal é excluído da análise. Ratos são atribuídos aleatoriamente ao grupo NC ou PI (n = 6 por grupo) usando um gerador de números aleatórios. Pesquisadores que realizam quantificação por micro-CT e avaliações histopatológicas permanecem cegos para as atribuições em ...

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Discussão

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O presente estudo demonstra a viabilidade de induzir PI em um modelo de rato usando suturas embebidas com P. gingivalis e fornece uma documentação detalhada dos procedimentos cirúrgicos associados. Modelos de roedores, especialmente em ratos, são bem estabelecidos na pesquisa odontológica para estudo de periodontite e PI, devido à sua acessibilidade, baixo custo de manutenção e alta eficiência reprodutiva, conforme apoiado pela literaturaexistente 15,25

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Divulgações

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Os autores afirmam que não há potenciais conflitos de interesse que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

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Este trabalho é apoiado por subsídios da Associação Médica de Sichuan (Bolsa nº S2024052); o Departamento de Ciência e Tecnologia de Luzhou (Bolsa nº 2024JYJ070) e o Hospital de Estomatologia Afiliado da Universidade Médica do Sudoeste (Bolsa nº 2025DS03). Os autores também agradecem com gratidão a assistência técnica prestada pelo Centro de Experimentos Animais da Southwest Medical University. O diagrama científico é criado com o BioRender.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#5 Explorador OdontológicoZhengzhou Kangdetai Medical Co., Ltd., Zhengzhou, CN6970327120856Luxação e extração dentária
Álcool ácido 1%Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Xangai, CN10000018 (etanol) & 10000118 (Hcl)Diferenciação de hematoxilina
10% EDTA (pH 7,4)Servicebio Technology Co., Ltd, Wuhan, CNG1105Descalcificação óssea
Solução 100% de etanolMacklin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, ChinaE708068Desidratação completa e preparação com solvente
Lâmina 12c e bisturi cirúrgicoTianda Medical Co., Ltd., Huaian, CN6951933811154Criação de retalhos mucoperiosteis
Ligaduras de seda 3-0Jinhuan Medical, Xangai, CNNC9201232Ligadura
4% de paraformaldeídoBiosharp, Hefei, CNBL539AFixação de tecidos
70% de etanolPreparação laboratorial-Armazenamento de amostras
Solução de etanol 75%Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, ChinaE885996Desinfecção superficial e desidratação inicial
Amoxicilina 50 & mu; g/mLNorth China Pharmaceutical Co., Ltd, Shijiazhuang, CNH13020635Suplementação com antibióticos na água potável
Software AvatarAvatar Integrated Systems Inc, Munique, DE-Análise dos parâmetros ósseos
Médio BHICrown Lab Supplies Inc, Colúmbia Britânica, CA110052Cultura P. gingivalis
CT-VoxelBruker Corporation, Billerica, MA, EUA-Visualização de imagens micro-CT
EosinaBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pequim, CN
G1100		Coloração citoplasmática
Série de etanol (80%, 90%, 95%)Preparação laboratorialDesidratação/reidratação gradual dos tecidos
GraphPad PrismaGraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EUAVersão 9.0.0Análise estatística e geração de grafos
FarolShenzhen Supfire Lighting Co., Ltd, Shenzhen, CNHL23-XIluminação intraoral
HematoxilinaBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pequim, CNH8070Coloração nuclear
Portador de implanteSichuan Weisida Medical Device Co., Ltd, Sichuan, CNProduto únicoColocação manual do implante
IsofluranoRWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, CNR510-22-10 Manutenção da anestesia inalatória
Adaptador manual de chave de fendaDiqin Decorative Materials Co., Ltd, Hangzhou, CNDQ-80013Osteotomia
Cotonetes médicosKekang Pharmaceutical Co., Ltd, Suzhou, CNHN-02Hemostáse
Micro-CT scannerServicebio Technology Co., Ltd, Wuhan, CNVNC-102μ Tomografias computadorizadas
Suporte de agulhaShanghai Medical Instruments Co., Ltd, Xangai, CNJ32110Ligadura de sutura
Bálsamo neutroBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.
Pequim, CN		G8590Montagem histológica da seção
Pinças oftalmológicasSolingmed Technology Co., Ltd, Shenzhen, CNSS-5002Colocação da ligadura
ParafinaAmin Noori General Trading LLC, Dubai, AE8012-95-1Embedding de tecidos
PBSProcell Life Science & Ciência da Vida Technology Co., Ltd, Wuhan, CNPB180327Irrigação de tecidos
Porphyromonas gingivalisEquivalente-Indução de inflamação
PovidoneiodinaChengdu Yong'an Pharmaceutical Co., Ltd, Chengdu, CNH51023539Desinfecção
Software de reconhecimentoRecon Technology Ltd, Ilhas Cayman, GBVersão 1.7.4.0Reconstrução de imagem por micro-CT
ElásticoZhejiang Yueyi Rubber Products Co., Ltd, Taizhou, CNVYR43*1.4Tração e fixação da mandíbula
Ratos SDCentro Experimental de Animais da Universidade Médica do Sudoeste, Luzhou, CNSCXK(Chuan)2024-0046Procedimentos cirúrgicos
Tesouras cirúrgicas afiadasHunan Cofoe Medical Technology Co., Ltd., Changsha, CN1.0806E+13Corte de rosca
Pinças teciduaisFerramentas Científicas Finas, Foster City, CA, EUA11000-12Tração e fixação da língua
Implantes de titânio (& Oslash; 1,8 e vezes; 3,2mm)Sichuan Weisida Medical Device Co., Ltd, Sichuan, CNProduto únicoImplante de titânio
Tribromoetanol (Avertin)Henan Saihou Biotechnology Ltd., Zhengzhou, CN-Anestesia intraperitoneal
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Xangai, CN10023418Limpeza e desceragem de tecidos

Referências

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