Artigo de investigação

RNA não codificante longo IRAIN impulsiona a reprogramação imunometabólica no glioma via o eixo IGF1R-JAK-STAT-BIRC5

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DOI:

10.3791/69711

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12 de dezembro de 2025

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1Department of Neurosurgery, Zhangzhou Municipal Hospital of Fujian Province and Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 2The School of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Usando aprendizado de máquina integrado entre múltiplas coortes, construímos uma assinatura prognóstica robusta de IMRG para glioma. O IRAIN é marcadamente regulado para baixo, inversamente ligado ao grau e à sobrevivência, e suprime a sinalização IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5, restringindo a proliferação, migração e angiogênese. Os achados indicam IRAIN e IMRGs como biomarcadores e alvos terapêuticos.

Resumo

Glioma é uma malignidade agressiva com opções terapêuticas limitadas e prognóstico ruim. Sua progressão está intimamente ligada à reprogramação metabólica e à evasão imune, ressaltando a necessidade de identificar reguladores moleculares que integram esses processos. Aqui, estabelecemos uma assinatura prognóstica robusta do gene imunometabólico (IMRG) e elucidamos o papel do longo RNA não codificante IRAIN na regulação do imunometabolismo do glioma através do eixo IGF1R-JAK-STAT-BIRC5. Foram analisados dados transcriptômicos e clínicos das coortes TCGA, CGGA (693/325) e GEO (GSE43378). A expressão diferencial e a análise ponderada de redes de coexpressão gênica (β = 8) garantiram topologia livre de escala, e uma estrutura de validação cruzada leave-one-out combinando dez algoritmos de aprendizado de máquina produziu 101 modelos prognósticos. A assinatura ideal do IMRG de 17 genes foi validada em todas as coortes e previu independentemente a sobrevivência geral. Ensaios funcionais demonstraram que a superexpressão do IRAIN inibia o IGF1R, suprimia a fosforilação do JAK2/STAT3 e regulava a baixa o BIRC5, promovendo assim a apoptose e reduzindo a angiogênese. Baixa expressão de IRAIN correlacionou-se com Tregs imunossupressores e macrófagos M2 e com escores elevados no microambiente tumoral, sugerindo um fenótipo imuno-evasivo. Esses achados estabelecem o IRAIN como um regulador-chave da reprogramação imunometabólica do glioma e validam a assinatura IMRG como uma ferramenta prognóstica confiável, destacando a via IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 como uma ponte mecanicista que liga a desregulação imune e metabólica no glioma e oferece potenciais alvos para terapia de precisão.

Introdução

O glioma representa a malignidade primária mais comum do sistema nervoso central e permanece entre os cânceres humanos mais letais, apesar do progresso em neurocirurgia, radioterapia e quimioterapia. Gliomas de alto grau, particularmente o glioblastoma multiforme (GBM), são caracterizados por rápida proliferação, infiltração difusa e inevitávelrecorrência 1,2. Recentemente, surgiu uma variedade de abordagens terapêuticas eficazes, como intervenções cirúrgicas, imunoterapia equimioterapia 3. A sobrevivência mediana permanece aproximadamente de 14 a 18 meses, mesmo com a terapia máxima, ressaltando a necessidade de novas estratégias terapêuticas e biomarcadoresprognósticos 4.

A interação entre o microambiente tumoral (TME) e as células cancerígenas impulsiona criticamente o crescimento agressivo e a heterogeneidade molecular dos gliomas. Numerosos constituintes imunológicos, incluindo microglia, células precursoras neuronais, vasculares e células imunes adaptativas, estão intrinsecamente envolvidos na formação doTME 5,6,7. Nos últimos anos, houve avanços notáveis na imunoterapia, inaugurando uma era transformadora na oncologia. No entanto, o bloqueio imunológico de pontos de controle (ICB) e outras abordagens imunoterapêuticas mostraram sucesso limitado noglioma 8. A falha da imunoterapia nesse contexto decorre de várias características intrínsecas do microambiente do glioma — a saber, baixa carga mutacional tumoral, heterogeneidade intratumoral pronunciada, permeabilidade fraca da barreira hematoencefálica, regulação em baixa das principais moléculas do complexo histocompatível e infiltração esparsa em células T 9,10,11,12.

Evidências crescentes sugerem que o microambiente tumoral (EMT), que apresenta disfunção metabólica, é marcado por condições ácidas, privação de nutrientes e acúmulo de metabólitos que suprimem as respostas imunológicas. Essa condição subsequentemente leva à disfunção das células imunes que infiltram tumores e diminui a eficácia da imunoterapia13. Simultaneamente, as células imunes dentro da TME passam por mudanças metabólicas dependentes do contexto que ditam suas funções de diferenciação e efetoras. Por exemplo, células T ativadas dependem da glicólise para uma proliferação rápida, enquanto células T reguladoras (Tregs) e macrófagos associados a tumores (TAMs), particularmente o subtipo M2, dependem da fosforilação oxidativa e do metabolismo dos ácidos graxos para manter sua atividadeimunossupressora 14,15.

Portanto, integrar assinaturas imunes e metabólicas oferece uma estrutura racional para melhor classificar os gliomas e prever o prognóstico do paciente. RNAs longos não codificantes (lncRNAs) emergiram recentemente como reguladores versáteis da arquitetura da cromatina, transcrição gênica e modificação pós-transcricional. Vários lncRNAs foram implicados na patogênese do glioma, influenciando proliferação, invasão e modulaçãoimunológica 16. Entre elas, o transcrito antisense impresso IRAIN (IGF1R antisense impresso RNA não codificante de proteínas) chamou atenção por seu papel na regulação do gene do receptor do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1R) por meio de interações com cromatina cis-agente, que já se mostrou ser reduzido e diminuir o controle da competição cis, especialmente em células cancerígenas como câncer de mama e linhagens celulares de leucemia, câncer de laringe e leucemia mieloide aguda, que leva diretamente à regulação para cima deIGF1R 17,18,19. Como a sinalização IGF1R ativa as vias JAK-STAT e PI3K-AKT a jusante — ambas centrais para o crescimento tumoral e para a regulaçãoimunológica 20,21 — alterações na expressão de IRAIN podem afetar criticamente o imunometabolismo tumoral. No entanto, o papel da IRAIN no glioma e seu potencial impacto no cenário imunometabólico ainda não foram esclarecidos. Abordar essa lacuna de conhecimento pode fornecer uma visão mecanicista de como RNAs não codificantes coordenam a adaptação metabólica e a evasão imune no glioma.

Neste estudo, combinamos dados transcriptômicos de múltiplas coortes com validação experimental para explorar a regulação imunometabólica no glioma. Utilizando frameworks integrados de aprendizado de máquina nas coortes TCGA, CGGA (693/325) e GEO (GSE43378), identificamos uma assinatura prognóstica robusta de 17 genes de genes relacionados ao imunometabólico (IMRG) capaz de estratificar a sobrevivência do paciente entre os conjuntos de dados. Posteriormente, focamos no IRAIN como um potencial regulador upstream dessa rede, dada sua interação prevista com o eixo de sinalização IGF1R-JAK-STAT. Ensaios funcionais revelaram que a superexpressão do IRAIN suprime a proliferação de gliomas e a angiogênese ao inibir a expressão do IGF1R e a fosforilação posterior do STAT3, resultando na redução da expressão da proteína antiapoptótica BIRC5 (também conhecida como Survivin). Em conjunto, esses achados apoiam um modelo funcional no qual o IRAIN funciona como uma ponte mecanicista que liga a regulação imune e a reprogramação metabólica no glioma. Hipotetizamos que a expressão desregulada do IRAIN promove a progressão tumoral ao perturbar esse equilíbrio, promovendo assim um microambiente imunossupressor e conferindo resistência à terapia.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo tecidos humanos estavam em conformidade com as diretrizes institucionais e a Declaração de Helsinque, sendo aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Médica de Fujian (Aprovação nº 2021KYB089). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da extração de tecido.

Análise de expressão gênica e sobrevivência
Os dados de sequenciamento de RNA e as informações clínicas correspondentes foram obtidos de múltiplos bancos de dados públicos. 1) Coorte TCGA: Dados de RNA-seq (FPKM) para 175 amostras de glioblastoma multiforme (GBM) e 534 amostras de glioma de baixo grau (LGG) foram baixados do The Cancer Genome Atlas (https://portal.gdc.cancer.gov/); 2) Controles normais: Perfis de expressão de 211 tecidos cerebrais normais e 662 tecidos gliomas foram baixados do banco de dados UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/); 3) Validação externa: Dados de coortes de CGGA693 e CGGA325 foram obtidos do Atlas Genoma do Glioma Chinês (http://www.cgga.org.cn); 4) Conjunto de dados GEO: O conjunto de dados GSE43378, contendo dados de expressão e clínicos de 50 amostras de glioma, foi baixado do Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Todos os dados brutos de contagem foram convertidos para transcritos por milhão (TPM) e transformadosem logarítmic 2. Para conjuntos de dados já normalizados, matrizes de expressão foram examinadas para garantir distribuições comparáveis. Genes com valores de TPM < 1 em mais de 80% das amostras foram excluídos. Informações clínicas ausentes (idade, status IDH, codeleção 1p/19q, metilação MGMT) foram removidas usando filtragem completa do caso. Os efeitos em lote entre conjuntos de dados foram ajustados usando o algoritmo ComBat implementado no pacote R sva. Os valores de expressão foram padronizados por transformação z-score dentro de cada conjunto de dados. As análises de sobrevivência foram realizadas usando os pacotes R survival e survminer. Os pacientes foram dichotomizados em grupos de alta e baixa expressão de acordo com o nível mediano de expressão do IRAIN. Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram geradas, e a significância estatística foi avaliada pelo teste log-rank. Razões de risco (HRs) e intervalos de confiança (ICs) de 95% foram estimados usando modelos de regressão de riscos proporcionais de Cox.

Definição de conjuntos de genes imunes e metabólicos
Genes relacionados ao sistema imunológico (IRGs, n = 2.483) foram obtidos do banco de dados ImmPort (https://www.immport.org/shared/), e genes relacionados ao metabolismo (MRGs, n = 948) foram obtidos do Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/). O conjunto combinado desses genes foi definido como genes relacionados a imunometabólicos (IMRGs). Essas listas de genes serviram como referências para análises subsequentes de expressão diferencial e de rede.

Análise de expressão diferencial e co-expressão gênica ponderada
Genes diferencialmente expressos (DEGs) entre cérebro normal e tecidos gliomas foram identificados usando o limma do pacote R. Os dados de expressão foram ajustados a um modelo linear seguido de moderação Bayes empírica. Genes com |log₂ mudança de dobra| > 1,5 e a taxa de falsas descobertas (FDR) < 0,05 foram consideradas significativamente expressas de forma diferencial. A análise ponderada da rede de coexpressões gênicas (WGCNA) foi realizada usando o pacote R WGCNA. Amostras outlier foram excluídas por meio de agrupamento hierárquico. A potência de limiar suave foi definida para β = 8 para alcançar um índice de ajuste topológico livre de escala (R2 ≥ 0,85), mantendo conectividade média adequada. Matrizes de sobreposição topológica (TOM) foram construídas, e os genes foram agrupados em módulos com tamanho mínimo de 50 usando o algoritmo de corte dinâmico em árvore. Os autogênios do módulo foram correlacionados com características clínicas, e o módulo mais fortemente associado ao glioma (Pearson's r > 0,7, P < 1×10-10) foi selecionado para identificação do gene central.

Construção de modelos prognósticos baseados em aprendizado de máquina
Uma estrutura abrangente de validação cruzada leave-one-out (LOOCV) integrando dez algoritmos de aprendizado de máquina foi aplicada para construir e avaliar modelos prognósticos. No total, 101 fluxos de trabalho combinatórios foram implementados usando a coorte TCGA como conjunto de dados de treinamento. Genes relacionados ao imunometabólico associados ao prognóstico (IMRGs) foram identificados pela primeira vez por regressão de Cox univariada (P < 0,05). O modelo ideal foi determinado maximizando o índice de concordância de Harrell (C-index) médio em três conjuntos de dados de validação (CGGA693, CGGA325 e GSE43378). O modelo RSF-Enet resultante (α = 0,3) demonstrou o maior desempenho preditivo e manteve uma generalizabilidade robusta entre coortesindependentes 22.

TME e infiltração imune
Para caracterizar de forma abrangente o cenário imunogenômico, empregamos uma abordagem analítica em múltiplos níveis. Primeiro, os níveis de infiltração imune e estroma foram quantificados usando o algoritmoESTIMATE 23. A expressão diferencial de moléculas de checkpoint imunológicos-chave, incluindo PDCD1, CTLA4 e LAG3, foi então avaliada por meio de análise baseada em limma, e as correlações entre os genes dos checkpoints foram visualizadas usando matrizes de correlação. Perfis de mutação somática de 903 amostras de glioma na coorte TCGA foram usados para calcular a carga mutacional tumoral (TMB), instabilidade de microssatélites (MSI) e as pontuações de disfunção imunológica e exclusão tumoral (TIDE) para prever possíveis respostas à imunoterapia. Os pacientes foram posteriormente estratificados em quatro grupos prognósticos de acordo com o estado combinado de TMB (alto/baixo) e escores de risco (alto/baixo), e os desfechos de sobrevivência foram comparados usando análise de Kaplan-Meier.

Análise de enriquecimento funcional
Análises de enriquecimento de vias da Ontologia Genética (GO) e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) foram realizadas usando o cluster Profiler do pacote R. Os resultados de enriquecimento com valores ajustados de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Processos biológicos super-representados, componentes celulares e funções moleculares foram visualizados usando gráficos de pontos e gráficos de barras. Redes de interação proteína-proteína (PPI) foram construídas usando o banco de dados STRING (≥ 0,4) e visualizadas no Cytoscape. Módulos funcionais dentro da rede PPI foram identificados usando o algoritmo MCODE. Interação gene-gene e redes de co-expressão foram analisadas adicionalmente usando o GeneMANIA (https://string-db.org; escore de confiança ≥ 0,4) e visualizadas no Cytoscape. Módulos funcionais dentro da rede PPI foram identificados usando o algoritmo MCODE. Interação gene–gene e redes de co-expressão foram analisadas mais detalhadamente usando o GeneMANIA (https://genemania.org), que integra informações sobre interações físicas e genéticas, vias compartilhadas e padrões de co-expressão para inferir possíveis associações funcionais.

Amostras clínicas
Tecidos gliomas frescos (n = 6) e tecidos cerebrais não tumorosos adjacentes pareados (n = 6; localizados a pelo menos 3 cm da margem tumoral e histologicamente confirmados como livres de tumor) foram coletados de pacientes submetidos a resseção primária de glioma no Hospital Afiliado Zhangzhou da Universidade Médica de Fujian. Nenhum dos pacientes havia recebido quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Todos os diagnósticos patológicos foram verificados independentemente por dois neuropatologistas, de acordo com a classificação de tumores do sistema nervoso central da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2021. Imediatamente após a excisão cirúrgica, as amostras de tecido eram enxaguadas com soro salino fosfatado tamponado (PBS) gelado para remover o sangue residual, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido (-196 °C) e armazenadas a -80 °C até a extração de RNA.

Linhas celulares e cultura celular
Linhagens celulares de glioblastoma humano SHG44, U251, A172 e T98G, assim como células gliais humanas normais (HEB), foram obtidas de repositórios autenticados e confirmadas como livres de contaminação por micoplasma antes do uso. As células foram mantidas no Meio de Águia Modificado (DMEM, alta glicose) de Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina, a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂. As células eram liberadas a cada 4-5 dias ao atingir 80-90% de confluência. Para estabelecer a superexpressão de IRAINs e controlar as linhas celulares, as células foram transduzidas com vetores lentivirais que transportavam o transcrito IRAIN de comprimento total ou um vetor vazio como controle. Clones estáveis foram selecionados usando puromicina (2 μg/mL) por 14 dias. A eficiência da sobreexpressão foi confirmada por PCR de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) antes dos ensaios posteriores.

Ensaio de proliferação celular de brometo de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)
As células foram semeadas em placas de 96 poços com densidade de 1 × 104 células por poço em 100 μL de meio de cultura completo. Às 24, 48 e 72 h após a semeadura, 20 μL de solução de MTT (5 mg/mL em soro salino tamponado com fosfato) foram adicionados a cada poço e incubados por 4 h a 37 °C. O sobrenadante foi então removido, e 150 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) foram adicionados para dissolver os cristais de formazan. A placa foi agitada suavemente por 10 minutos para garantir a solubilização completa. A absorvância foi medida em 490 nm usando um espectrofotômetro de microplaca. As leituras de fundo de poços vazios foram subtraídas. A viabilidade celular foi calculada em relação ao grupo de 24 horas ou controle (definido como 1,0). Todos os experimentos foram realizados com seis réplicas técnicas e três réplicas biológicas independentes. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DS), e a significância estatística foi determinada usando um teste t de duas caudas.

Citometria de fluxo para apoptose (Anexina V - coloração de fitc/pi)
As células foram semeadas em 60-70% de confluência e tratadas por 24 horas sob as condições indicadas. Células flutuantes e aderentes foram coletadas usando tripsina livre de EDTA, combinadas e lavadas duas vezes com PBS gelado. Os pellets celulares foram ressuspensos em tampão de ligação Annexin V (10 mM HEPES pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mMCaCl 2) a 1 ×10 6 células/mL. Para cada amostra, 100 μL de suspensão foram incubados com 5 μL de Annexin V-FITC e 5 μL de iodeto de propídio (PI; 50 μg/mL stock) no escuro por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a adição de 400 μL de tampão de ligação, as amostras foram mantidas no gelo e analisadas em até 1 hora em um citômetro de fluxo (excitação de 488 nm; 530/30 nm para FITC e >585 nm para PI). Foram incluídos controles apropriados de coloração única e fluorescência menos um para compensação. Pelo menos 10.000 eventos foram registrados por amostra. Os dados foram analisados por bloqueio de quadrantes: populações vivas (Annexin V⁻/PI⁻), populações apoptóticas iniciais (Annexin V⁺/PI⁻), apoptóticas tardias (Annexin V⁺/PI⁺) e necróticas (Annexin V⁻/PI⁺). Percentuais de células apoptóticas precoces + tardias foram relatadas (média ± DS, n = 3).

PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)
O RNA total foi isolado usando um reagente ácido fenol-guanidínio conforme o protocolo do fabricante. A pureza do RNA foi verificada por espectrofotometria (A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1), e a integridade foi confirmada por eletroforese em gel (número de integridade do RNA ≥ 7). Um micrograma de RNA total foi tratado com DNase I e transcrito reversamente em uma reação de 20 μL usando hexâmeros aleatórios e primers de oligo(dT). A reação foi realizada a 25 °C por 10 minutos, 50 °C por 30 minutos e 85 °C por 5 minutos. A PCR quantitativa foi realizada em um sistema de 10 μL contendo 5 μL de 2× SYBR Green Master Mix, 0,3 μM de cada primer e 1 μL de cDNA (≈ 20 ng de RNA equivalente). As condições de ciclo térmico foram de 95 °C por 5 minutos, seguidas por 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 30 s, seguida por uma análise da curva de fusão de 65 °C a 95 °C em incrementos de 0,3 °C. Todas as reações eram realizadas em triplicado, juntamente com controles sem template e sem RT. Valores de Ct > 35 ou SD réplica técnica > 0,5 foram excluídos. A expressão relativa foi calculada usando o método 2⁻ΔΔCt, com o GAPDH como controle interno. Valores médios ± SD de três réplicas biológicas independentes foram relatados, e as diferenças de grupo foram analisadas usando um teste t de duas caudas.

Análise do Western blot
As células foram lisadas no gelo em tampão RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% SDS) suplementado com inibidores de protease e fosfatase. Os lisados foram incubados por 30 minutos em gelo com vórtices intermitentes e limpos por centrifugação a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C. As concentrações de proteína foram medidas por ensaio de BCA, ajustadas para 1-2 μg/μL e misturadas 1:3 com tampão de Laemmli 4× (tampão final de 1× contendo 100 mM de DTT). As amostras foram desnaturadas a 95 °C por 5 minutos. Quantidades iguais de proteína (50 μg) foram resolvidas por 12% de SDS-PAGE a 100 V por 90 minutos e eletróctamente transferidas para membranas de PVDF a 250 mA por 90 minutos. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado em TBST (0,1% Tween-20) por 1 hora em temperatura ambiente (ou 5% de BSA para fosfoproteínas) e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra IGF1, IGF1R, JAK2, p-JAK2 (Y1007/1008), STAT3, p-STAT3 (Y705), BIRC5 e β-actina (diluição típica 1:1000, β-actina 1:5000). Após três lavagens de 10 minutos em TBST, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com HRP (1:5000) por 1 hora em temperatura ambiente, lavadas novamente e desenvolvidas usando substrato quimioluminescente. As intensidades das bandas foram quantificadas com o ImageJ, normalizadas para β-actina ou proteína total, e expressas como média ± SD a partir de três experimentos independentes.

Imunocitoquímica
Células cultivadas em coberturas de vidro estéreis foram enxaguadas duas vezes com PBS e fixadas em paraformaldeído a 4% por 15 minutos em temperatura ambiente. Após três lavagens de PBS, as células foram permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 por 10 minutos, bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA) a 5% por 1 hora e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpo anti-CD31 primário (diluição 1:200 em 1% de BSA). Após três lavagens de PBS, as células foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor (diluição 1:500) por 1 hora no escuro, contra-coloridas com DAPI (1 μg/mL, 5 min) e montadas em meio antidescoloração. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência sob configurações idênticas de exposição e ganho. A porcentagem de área positiva para CD31 foi quantificada em cinco campos aleatoriamente selecionados e não sobrepostos por amostra, usando o software ImageJ. Esse ensaio foi realizado em modelos celulares, e não em seções de tecido.

Análise estatística
Análises estatísticas foram realizadas utilizando a versão 4.3.0 do R junto com seus pacotes associados. Para comparar variáveis categóricas, foi utilizado o teste qui-quadrado, enquanto variáveis contínuas foram avaliadas usando o teste de soma de ranks de Wilcoxon ou o teste T. A avaliação das variáveis contínuas foi realizada por meio do coeficiente de correlação de Pearson. As análises de sobrevivência foram realizadas usando o pacote de sobrevivência, que incluiu a modelagem proporcional de riscos de Cox e a geração de curvas de Kaplan-Meier, com limiares de estratificação ótimos estabelecidos pelo pacote survminer e pela fórmula Riskscore = Equação 1. O pacote CompareC foi usado para avaliar os índices C de várias variáveis. A curva característica de operação do receptor (ROC), voltada para prever variáveis categóricas binárias, foi gerada usando o pacote pROC. Além disso, a área dependente do tempo sob a curva ROC (AUC) para métricas de sobrevivência foi analisada usando o pacote timeROC. Todos os testes estatísticos foram realizados com uma abordagem bilateral. Um nível de significância de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

O IRAIN é reduzido no glioma e associado a características clinicopatológicas adversas
O processo de análise é ilustrado na Figura 1. A expressão de IRAIN foi avaliada pela primeira vez por qRT-PCR em astrócitos primários, tecidos de glioma e linhas celulares de glioma. Os níveis de IRAIN foram marcadamente reduzidos tanto em tecidos gliomas de baixo quanto de alto grau e em todas as quatro linhagens celulares de glioma (SHG44, A172, U251 e T98G) em comparação com astróci...

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Discussão

O glioma continua sendo uma das malignidades mais letais do sistema nervoso central, caracterizada por profunda heterogeneidade intratumoral e resistência à terapia convencional. Apesar da resseção cirúrgica combinada com quimiorradioterapia, a recidiva e a mortalidade permanecem altas, e a sobrevivência mediana dos pacientes, especialmente daqueles com glioblastoma, mostrou melhora limitada nas últimasdécadas 4,24. Evidências cr...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a todos os participantes e pesquisadores envolvidos no projeto Genotype-Tissue Expression (GTEx) e nos bancos de dados TCGA, CGGA, pelo compartilhamento dos dados disponíveis. Esse trabalho foi apoiado pelo Projeto Provincial de Tecnologia em Saúde de Fujian (2024GG01010154) e pelo Projeto de Escalada de Estação de Trabalho Doutoral do Hospital Zhangzhou (PDA202306). O financiador forneceu fundos para nossa pesquisa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de Apoptose Annexin V-PI  Southern Biotechnology, Birmingham, AL, EUANAUsado para avaliar a apoptose
Kit de Apoptose AnnexinV-PIBiotecnologia do Sul10010-02Usado para avaliação de apoptose por citometria de fluxo.
Anti-IGF1, Anti-IGF1R, Anti-JAK2, Anti-STAT3, Anti-Sobrevivência, Anti-β-actinaAbcamAB182408, AB108596, AB109085, AB76424, AB8227Anticorpos usados para análise de Western Blot em vias de sinalização.
BiocManagerCRAN1.30.25Instalar e gerenciar pacotes Bioconductor em R & ge; 3.6.
Sistema Bio-Rad CFX96Biocondutor1.5.1Acesso programático à proteína STRING– interações proteicas.
CaretCRAN0.4ROC/AUC dependente do tempo para modelos de sobrevivência.
Atlas do Genoma do Glioma Chinês (CGGA)NACGGA693 e CGGA325 Usado para constração e validação de modelos
ClusterprofilerBiocondutor2.18.0Analisar arquivos MAF; calcular a carga mutacional tumoral (TMB) e o cenário de mutações.
CorrplotCRAN3.5.0Plotagem geral (diagramas de caixa, gráficos de violino, dispersão, linhas de tendência).
CoxboostCRAN7.3-60stepAIC para seleção de modelos Cox passo a passo.
Data.TableCRANreadr2.1.5Leitura rápida de arquivos delimitados; dirigibilidade robusta do UTF-8.
DoseBiocondutor3.17.0Anotação genética humana (Entrez, Ensembl, mapeamentos SYMBOL).
DynamictreecutCRAN1.73Análise ponderada de redes de coexpressão gênica; pickSoftThreshold, TOM, detecção de módulo.
BordadorBiocondutor3.56.2Expressão diferencial (voom/modelos lineares); Wilcoxon/Bayes empírico; Entradas de vulcão/mapa de calor.
EnrichplotBiocondutor3.26.2Enriquecimento de Ontologia de Doenças e ajudantes GSEA (usados com clusterProfiler).
FlashclustCRAN1.63-1Corte adaptativo de ramificação para detecção de módulos WGCNA.
GBMCRAN1.12Componentes principais supervisionados para análise de sobrevivência.
Omnibus de Expressão Gênica (GEO)NAGSE43378Usado para constração e validação de modelos
GEOqueryBiocondutorNABaixe e analise conjuntos de dados GEO.
Ggplot2CRAN1.0.12Mapas de calor prontos para publicação das assinaturas de expressão.
GlmnetCRAN3.3.1Floresta de sobrevivência aleatória para resultados censurados certos.
Anticorpos secundários anti-coelho marcados com peroxidase de raiz-forteAbcamAB6721Anticorpos secundários para detecção em Western Blot.
Linhagens celulares de glioblastoma humano (SHG44, U251, A172, T98G)Coleção Americana de Cultura de TecidosNALinhas celulares humanas de glioblastoma para pesquisa de glioma. As células foram cultivadas em DMEM + 10% FBS, 2 mM de L-glutamina.
IgraphCRAN10.0.1Acesse conjuntos de genes do MSigDB (por exemplo, MRGs metabólicos); Molduras convenientes e arrumadas.
Software Image J  Media Cybernetics, EUA152Usado para visualização
Vetor lentiviral codificando lncRNA-IRAINGeneChem, Xangai, China & nbsp;NAVetores lentivais usados para transfecção de células de glioma e HEB para estabelecer clones estáveis.
LimmaBiocondutor3.48.0Correção em lote (ComBat) e análise de variáveis substitutas.
MaftoolsBiocondutor1.52.0Harrell' s índice de concordância (índice C) e utilidades de comparação de sobrevivência.
MissaCRAN4.1-8Modelos Cox penalizados: Laço, Cumeeira e Rede Elástica.
MsigdbrCRAN0.0.5Métodos de máquina vetorial de suporte para dados de sobrevivência.
MTTSigma-AldrichM2128Usado para ensaios de proliferação celular.
Células gliais normais (HEB)Coleção Americana de Cultura de TecidosNALinha celular glial humana normal para estudos de comparação. Cultivado em DMEM + 10% de FBS.
Org.Hs.Eg.DbBiocondutor4.8.3enriquecimento GO/KEGG e GSEA; suporta múltiplos tipos de ID.
PheatmapCRAN2.0.0Gramática da ciência de dados; Inclui DPLYR, Tidyr, Purrr, GGPLOT2 para lidar com a organização e a planejação.
PlsrcoxCRAN1.5Aumento baseado em probabilidade para modelos Cox.
Membranas PVDFMilliporeIPVH00010Membranas usadas para transferência de proteínas após SDS-PAGE.
RandomforestsrcCRAN6.0-94Reamostragem unificada (incluindo LOOCV), grades de ajuste e pipelines de modelos.
ReadrCRANNARecuperar matrizes/fenótipos do UCSC Xena (por exemplo, hubs TCGA/GTEx).
SDS-Page Gel (12%)Bio-Rad185-5096Sistema usado para PCR quantitativa.
StringdbBiocondutor1.20.3Visualização para resultados de enriquecimento (dotplot, cnetplot, ridgeplot).
SuperpcCRAN1.7.7Regressão parcial de mínimos quadrados adaptada aos modelos de Cox.
SurvcompBiocondutor3.42.4Conta a normalização e a estimativa de dispersão quando necessário (opcional, complementa o limma voom).
SobrevivênciaCRAN1.01-2Clustering hierárquico rápido usado pela WGCNA (opcional).
SobrevivênciasvmCRAN2.2.2Modelagem de regressão amplificada generalizada (gradient boosting).
SurvminerCRAN3.8-3Modelos de riscos proporcionais de Cox; Kaplan– Curvas meias.
TCGAbiolinksBiocondutorT9039Acesso programático aos dados TCGA; Baixe/prepare dados de expressão e clínicos.
O Programa do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA)NAhttps://www.cancer.gov/tcga; 175 GBM e 534 LGGUsado para constração e validação de modelos
TidyverseCRAN1.17.6Manipulação de dados de alto desempenho para matrizes/tabelas grandes.
TimerocCRAN0.5.0Visualização de KM e renderização de tabelas de risco.
TrizolInvitrogen15596026Reagente para extração de RNA das células.
UCSC XenaNAhttps://xenabrowser.net/datapages/Usado para constração e validação de modelos
UcscxenatoolsBio-Rad4561044Usado para separação de proteínas na análise Western Blot.
WGCNACRAN0.95Matrizes de correlação para genes de checkpoint e relações de características.

Referências

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