Artigo de método

Melhorando as telas CRISPR-Cas9 em células CAR T: Um método refinado para preparação de bibliotecas

DOI:

10.3791/69721

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2 de janeiro de 2026

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1Hemato-Oncology Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 2Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer (CIBERONC), 3Computational Biology and Translational Genomics Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 4Cancer Center Clinica Universidad de Navarra (CCUN), 5Data Science and Artificial Intelligence Institute (DATAI), Universidad de Navarra, 6Hematology and Cell Therapy Department, Clinica Universidad de Navarra, IdiSNA

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Desenvolvemos um protocolo otimizado de triagem knockout CRISPR-Cas9 para células CAR T primárias. Ao reduzir a transferência de gDNA por meio da digestão enzimática e da redução do de sgRNA, essa abordagem minimiza artefatos de PCR, garantindo a detecção precisa de sgRNA e a identificação robusta de alvos genéticos funcionais.

Resumo

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Terapias com receptor de antígeno quimérico (CAR) com células T demonstraram eficácia notável em várias malignidades hematológicas, mas seu sucesso não foi totalmente replicado em tumores sólidos. Além disso, mesmo em cânceres hematológicos, a recaída após a infusão de células CAR T continua comprometendo os resultados a longo prazo. Esses desafios destacam a necessidade urgente de desenvolver estratégias que aumentem a eficácia, persistência das células CAR T, superando a resistência mediada por tumores e microambientes. Plataformas de rastreamento agrupadas regularmente interespaçadas em repetições palindrômicas curtas (CRISPR)-Cas9 fornecem uma abordagem poderosa para identificar sistematicamente genes que regulam a função das células CAR T. Ao ligar perturbações genéticas a resultados fenotípicos, esses ensaios possibilitam a descoberta de vias que controlam ativação, proliferação, formação de memórias e citotoxicidade. Fluxos de trabalho padrão envolvem a transdução de um número substancial de células com uma única biblioteca de RNA-guia (sgRNA), edição mediada por Cas9, seleção de células editadas e amplificação por PCR de sgRNA a partir do DNA genômico (gDNA) antes do sequenciamento. No entanto, a amplificação por PCR usando grandes quantidades de gDNA apresenta desafios significativos e frequentemente falha em amplificar e recuperar sgRNAs de forma seletiva. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado de triagem knockout CRISPR-Cas9, que testamos em células CAR T humanas primárias. O método aqui incorpora uma etapa intermediária durante a preparação da biblioteca de sgRNA que reduz a transferência de gDNA por meio da digestão enzimática e da puxada seletiva da fita sgRNA, aumentando assim a eficiência da primeira amplificação por PCR. Essa modificação nos permitiu recuperar informações de sgRNA através das telas de células CAR T, que haviam permanecido elusivas em nossas tentativas anteriores usando protocolos tradicionais de amplificação PCR de 1 e 2 etapas. Em conclusão, esse fluxo de trabalho otimizado facilita a preparação da biblioteca de triagem do CRISPR em amostras desafiadoras e possibilita a identificação de determinantes genéticos chave que podem ser direcionados para melhorar a eficácia terapêutica.

Introdução

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A imunoterapia revolucionou o tratamento do câncer, oferecendo novas estratégias para aproveitar e modular o sistema imunológico. Entre elas, a terapia com receptor de antígeno quimérico (CAR) com células T emergiu como uma das abordagens mais transformadoras. Essa terapia envolve a engenharia genética das células T do paciente ex vivo com um receptor sintético projetado para reconhecer um antígeno tumoral específico, aumentando assim a atividadeantitumoral 1. As células T CAR demonstraram sucesso notável em malignidades hematológicas, com desfechos que variam desde remissões curtas até sobrevivência prolongada livre de doença com toxicidade mínima em pacientes que receberam terapias CD19 ou direcionadas paraBCMA2. Até o momento, a FDA aprovou sete produtos de células CAR T para câncereshematológicos 3. Apesar desses avanços, limitações significativas permanecem. Os desafios surgem do próprio produto de células T CAR, frequentemente influenciados pelo processo de fabricação ou pela aptidão das células T do paciente, que podem ser prejudicadas pela progressão da doença, terapias anteriores ou idade. Mecanismos de resistência intrínseca ao tumor, como a regulação para baixo do antígeno, também podem comprometer aeficácia 4. Além disso, o microambiente tumoral imunossupressor representa uma barreira adicional que limita severamente a persistência e a função das células CAR T, especialmente em pacientes com tumorsólido 5. Consequentemente, há uma necessidade urgente de aprimorar tanto a eficácia inicial quanto a longo prazo das terapias com células CAR T.

O advento da edição gênica CRISPR-Cas9 forneceu ferramentas poderosas para dissecar a função gênica por meio de abordagens de triagem em larga escala. Nesses ensaios, as células são transduzidas com uma biblioteca de RNA de guia única (sgRNA), tipicamente entregue por vetores lentivirais, garantindo um sgRNA por célula e integração genômica estável. Após a edição e seleção de células transduzidas mediadas por Cas9, o DNA genômico (gDNA) é extraído, e os de sgRNA são amplificados por PCR para preparação da biblioteca. O sequenciamento de alto rendimento então permite a quantificação das distribuições de sgRNA entre diferentes fenótipos, identificando assim genes que regulam positiva ou negativamente o processo sob o estudo6.

A triagem CRISPR tem sido amplamente aplicada para explorar a biologia das células T e, mais recentemente, para aprimorar o desempenho das células CAR T. As triagens genômicas identificaram reguladores dos processos fundamentais das células T, incluindo ativação, proliferação e diferenciação. Por exemplo, FAM49B foi identificado como regulador da sinalização do receptor de célulasT 7, enquanto SOCS1, TCEB2, RASA2 e CBLB mostraram-se essenciais para a proliferação após a estimulação8. Além dessas vias centrais, a triagem CRISPR também elucidou genes envolvidos na memória e exaustão das células T. Estudos in vivo identificaram Fli1 como candidato a aprimorar as respostas dos efetores sem perturbar precursores de memória ouexaustão 9, e o remodelador de cromatina Arid1a como regulador cuja perda reduz o cansaçodas células T 10. Reguladores da diferenciação T helper tipo 2 (Th2) também foram caracterizados com essa abordagem11. Utilizando uma biblioteca personalizada de sgRNA direcionada a 25 quinases, foi constatado que p38 promove expansão, formação de memória e proteção contra estresse oxidativo egenômico 12. De forma semelhante, o knockout por REGNASE-1 em células T CD8+ conferiu um fenótipo efetivo de longa duração que melhorou o controle tumoral nos modelos13 de melanoma e leucemia. Testes genômicos adicionais identificaram o Dhx37 como regulador da ativação e citotoxicidade das célulasT 14, enquanto o LTBR e outros genes foram validados como potenciadores da função das células T em células T CAR T ecélulas T γδ 15. Mais recentemente, o rastreamento CRISPR tem sido aplicado diretamente em células CAR T, revelando novos alvos como PRODH2, uma enzima envolvida no metabolismo da prolina que aumenta a atividade antitumoralCAR T 16, e TLE4 e IKZF2, cuja inativação melhorou a eficácia da CAR T nos modelos17 de glioblastoma.

Um passo crítico nas triagens CRISPR é precisamente a amplificação seletiva de sgRNA a partir de quantidades extremamente grandes de gDNA, um desafio difícil de contornar dado o vasto número de células usadas nas triagens CRISPR. A amplificação por PCR a partir de grandes quantidades de DNA transportado apresenta vários desafios técnicos, incluindo aglomeração molecular que limita a difusão física de moléculas de DNA e polimerase, ligação transitória e inespecífica dos primers e da polimerase ao fundo do DNA, amplificação fora do alvo resultando em depleção do primer ou sequestro de Mg2+ pela espinha dorsal de fosfato de DNA, entre outrosdesafios 18, 19, 20, 21. Esses fatores frequentemente resultam em falha e/ou viés na PCR. Para mitigar esses problemas, diferentes estratégias foram propostas, incluindo separar a amplificação de sgRNA da adição de adaptadores em dois passosde PCR 22, o uso de enriquecimento de alvos com oligos biotinilados e captura de esferasmagnéticas 23,24, ou o projeto de plasmídeos com sítios de restrição flanqueando a fita de sgRNA para enriquecimentode fragmentos 25.

Neste estudo, apresentamos um protocolo otimizado de triagem knockout CRISPR-Cas9 para células CAR T humanas primárias. A biblioteca CRISPR utilizada é Brunello Kinome 1, uma biblioteca que contém 3052 sgRNAs únicos de 20nt de comprimento que têm como alvo 763 genes de quinases humanas (4 sgRNAs por alvo). As células T foram isoladas por seleção magnética positiva CD4+ e CD8+ a partir da fração enriquecida com células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de amostras de doadores saudáveis. Após a ativação com anti-CD3 e anti-CD28, as células T foram infectadas com a biblioteca de triagem CRISPR, depois transduzidas com o lentivírus CAR. As células foram expandidas e depois nucleofetadas para introduzir a proteína Cas9. Células portadoras de CRISPR foram selecionadas com puromicina, e células T CAR-positivas foram selecionadas. Após a extração, o DNA genômico foi digerido com enzimas de restrição (RE), e os fragmentos contendo sgRNA foram puxados para baixo por captura de sonda de biotina e estreptavidina. Em seguida, sgRNA foram amplificados seletivamente e indexados por meio de duas PCRs consecutivas, e as bibliotecas resultantes foram sequenciadas. Ao incorporar uma etapa intermediária para reduzir o transporte de gDNA, conseguimos recuperar e amplificar seletivamente nosso sgRNA de interesse, o que nos permite estudar o papel das quinases nas células T CAR.

Protocolo

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Esse protocolo foi realizado de acordo com as diretrizes da Universidad de Navarra. Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito. Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento e ativação das células T

  1. Isolamento PBMC
    1. Colete amostras de sangue de doadores em tubos de ácido etilenediaminetetraacético (EDTA), transfira amostras de sangue para tubos cônicos de 50 mL e dilua o sangue com PBS (diluição 1:1).
    2. Adicione 15 mL de meio gradiente de densidade ao fundo de um tubo cônico de 50 mL (densidade para PBMCs: 1,07). Depois, adicione cuidadosamente 25 mL de sangue diluído sobre a camada média do gradiente de densidade (velocidade mais lenta do controlador da pipeta). Centrifugar por 30 minutos a 800 × g sem freio.
    3. Recolha o anel/camada de PBMCs com uma pipeta Pasteur em um tubo cônico de 50 mL e adicione PBS a um volume total de 50 mL para lavar. Centrifuge a 650 × g por 8 minutos. Descarte o supernadante.
      NOTA: Verifique a turbidez do sobrenadante para garantir que não há células ali. Em caso de dúvida, divida a suspensão em duas vezes o número original de tubos cônicos de 50 mL, adicione PBS até 50 mL e centrifuge novamente.
    4. Resuspenda 50 mL de PBS. Conte com acridina iodeto de laranja-propidio (AOPI) em um contador celular. Centrifuge a 650 × g por 8 minutos.
  2. Seleção magnética CD4 e CD8
    1. Prepare o tampão de filtragem celular ativada por fluorescência (FACS): PBS, EDTA 2,5 μM, BSA 0,5% e filtre por 0,2 μm.
    2. Ressuspenda PBMCs em 80 μL de buffer FACS estéril por 10 × 106 células e adicione 10 μL de microesferas CD4 e 10 μL de microesferas CD8 por 10 ×10 6 células. Incube por 20 minutos a 4 °C.
    3. Adicione 10 mL de tampão FACS e centrifuge por 8 minutos a 650 × g. Descarte completamente o sobrenadante.
    4. Resuspenda em 500 μL por 1 ×10 8 células de FACS Buffer em um tubo cônico de 15 mL.
      NOTA: Uma pista pode acomodar 200 x 106 células.
    5. Use o programa Possel para isolamento AutoMacs (classificador de células magnéticas de alta velocidade).
    6. Adicione até 10 mL de PBS, conte com AOPI em um contador de células fluorescentes e centrifuge a 650 × g por 8 minutos.
    7. Ressuspenda células 1 x 106/mL em meio de crescimento de células T contendo 3% de soro humano (HS), 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), 625 IU/mL de interleucina (IL)-7, 85 IU/mL de IL-15. Adicione 10 μL de reagente de estimulação de células T por 1 mL e misture bem. Placar 2 mL por poço em uma placa de 24 poços (p24w) e incubar por 24 horas a 37 °C.

2. Produção de células CAR T e triagem CRISPR

  1. Infeção de bibliotecas e transdução de CAR
    1. Adicione a quantidade correspondente da biblioteca CRISPR de lentivírus (por exemplo, biblioteca Brunello Kinome 1). Veja a Tabela Suplementar 1), determinado em um ensaio de titulação, e 8 μg/mL polibrene.
    2. Espefinar por centrifugação a 700 x g por 1 h 30 min a 32 °C.
    3. Substitua o meio por meio de crescimento de células T frescas contendo 3% de HS, 1% de P/S, 625 IU/mL de IL-7, 85 IU/mL de IL-15 (célula final = 106 células/mL).
    4. Após 6 horas, adicione a quantidade correspondente do vetor lentiviral CAR a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3 e incube por 4 dias.
  2. Eletroporação Cas 9
    1. Colete células CAR T, lave uma vez com PBS e conte células com AOPI em um contador de células fluorescentes.
    2. Prepare Cas9 de 4 μM em tampão de eletroporação.
    3. Resuspenda as células CAR T em 50 μL por 5 × 106 células. Misture e adicione cuidadosamente 50 μL de suspensão de células em cada poço de uma tira de cuveta multipoço sem formar bolhas. Depois, usando uma ponta de pipeta, remova quaisquer bolhas possíveis e passe a ponta ao longo das bordas do poço.
      NOTA: Se algum poço em uma cubeta ficar sem amostra, adicione o mesmo volume de tampão de eletroporação. Esse é um passo crítico: se a máquina detectar uma bolha ou diferença de volume, ela gerará um erro.
    4. Use o programa EXPANDIR CÉLULA T 3 para células CAR T nucleofettas.
    5. Deixe as células nas cuvetas em uma incubadora a 37 °C por 40 minutos.
    6. Resuspenda as células nucleofectadas em um meio de crescimento de células T contendo 3% de HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 (célula final = 106 células/mL) e incube a 37 °C por 3 dias.
  3. Seleção de puromicina
    1. Conte com AOPI em um contador de células fluorescentes.
    2. Ajuste para 1 x 106 células/mL com meio de crescimento de células T contendo IL7 e IL15.
    3. Adicione puromicina (2,5 μg/mL) ao meio.
    4. Conte as células a cada 2 dias por 6 dias e ajuste para 1 x 106 células/mL com meio de crescimento celular contendo 3% de HS, 1% P/S, 625 IU/mL de IL-7, 85 IU/mL de IL-15 e 2,5 μg/mL de puromicina.
    5. Verifique a porcentagem de CARRO.
  4. Separe as populações de células CAR T e armazene amostras (pellet de célula seca) a -80 °C.

3. Isolamento do gDNA

NOTA: Evite qualquer perda celular ou de gDNA durante o processo, pois isso pode comprometer a representatividade dos sgRNAs. Busque uma cobertura de sgRNA de pelo menos 500x.

  1. Extraia gDNA de amostras usando o kit de extração de células e DNA de tecido. Elute duas vezes para maximizar a recuperação de gDNA.
    NOTA: Não use mais de 4 x 106 células/coluna para recuperar o gDNA de forma mais eficiente.
  2. Meça a concentração de gDNA com o kit de quantificação de dsDNA.
    NOTA: Se a concentração for muito baixa para etapas subsequentes do protocolo, utilize um reagente de limpeza em esferas reversíveis em fase sólida (SPRI) para concentrar o DNA.

4. Enriquecimento de sgRNA (e eliminação da herança de gDNA)

  1. Digestão por enzima de restrição
    1. Digerir no máximo 5 μg de gDNA com 20 U da enzima(s) (por exemplo, para lentiGuide-puro backbone para a biblioteca Brunello Kinome 1, use a combinação NdeI e PspXI) em um volume total de 50 μL. Aumente o número de reações para alcançar a representatividade desejada do sgRNA.
      NOTA: Selecione as enzimas de restrição a serem cortadas nas regiões laterais da, mas tenha em mente que alguns dos sgRNAs podem conter um sítio de restrição. Esses sgRNAs serão perdidos nessa etapa e não aparecerão no sequenciamento. A ausência deste guia serve como controle da digestão. A Tabela Suplementar 1 mostra uma lista de sgRNAs do Kinome 1 que são clivados por PspXI e NdeI.
    2. Incube durante a noite a 37 °C em um termociclador.
    3. Faça uma limpeza de SPRI 2x.
      1. Prepare 10 mL de Elution Buffer (EB) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) e 50 mL de etanol fresco a 70%.
      2. Faça vórtice nas esferas e adicione 100 μL ao produto da digestão.
      3. Misture bem pipetando e incube por 5 minutos. Magnetize por mais 5 minutos.
      4. Enquanto estiver no ímã, adicione 200 μL de etanol a 70% sem perturbar o pellet. Espere 30 segundos e então descarte o sobrenadante.
      5. Repita o passo 4.1.3.3 para um total de 2 lavagens. Deixe as contas secarem por 2 minutos.
      6. Remova do ímã, adicione 40 μL de buffer de elução e resuspenda as esferas pipetando. Incube por 2 minutos.
      7. Magnetize por 2 minutos e transfira o sobrenadante para um novo tubo.
        NOTA: Ao configurar este protocolo pela primeira vez, verifique a digestão por eletroforese (capilar). Certifique-se de que uma mancha seja observada.
  2. Puxão para baixo da fita sgRNA.
    1. Preparação de contas magnéticas de estreptavidina.
      1. Prepare Wash/Binding Buffer 2x: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA. Dilua metade do volume comH2Opara 1x.
      2. Faça vórtice nas contas por 1 minuto.
      3. Transfira o volume desejado de esferas para um tubo (normalmente 1 mg é suficiente), adicione um volume igual de Wash/Binding Buffer 1x, ou pelo menos 1 mL, e resuspenda.
      4. Coloque o tubo em um ímã por 1 minuto e descarte o sobrenadante.
      5. Remova o tubo do ímã e resuspenda as esferas lavadas no mesmo volume de 1x Wash/Binding Buffer que o volume inicial de esferas retiradas do frasco.
      6. Repita para um total de 3 lavagens.
      7. Resuspenda as esferas em 2x Wash/Binding Buffer.
    2. Adicione 5 μL de espoletas de pulldown de 10 μM listadas na Tabela 1 à digestão purificada da etapa 4.1.3.6.
    3. Incube em banho seco a 96 °C por 5 minutos e depois leve imediatamente ao gelo por 5 minutos.
    4. Adicione 1 mg de esferas magnéticas de estreptavidina pré-lavadas.
      NOTA: A ligação biotina-estreptavidina funciona melhor com 1 M de NaCl. Certifique-se de misturar volumes iguais de contas e DNA biotinilado.
    5. Incube por 20 minutos enquanto resuspende a mistura a cada 4 minutos.
    6. Magnetize por 5 minutos.
    7. Lave as esferas 3 vezes com 1× Wash/Binding Buffer.
    8. Resuspenda as esferas em 50 μL de EB 8.0.
      NOTA: Os de sgRNA usados aqui estão ligados às esferas de estreptavidina. Não os descarte.

5. preparação da biblioteca de sgRNA

  1. PCR1
    1. Prepare a mistura PCR1 com 20 μL de tampão Herculase 5x, 1 μL de dNTP (100 mM), 1 μL de DNA polimerase, 2,5 μL de 10 μM de primers PCR1 para frente e para trás listados na Tabela 1, e 23 μL de água de grau PCR. Misture pipetas e adicione mistura PCR1 às esferas do passo 4.2.8.
      NOTA: A Tabela 1 lista primers PCR1 projetados para a Biblioteca Brunello Kinome 1.
    2. Coloque os tubos em um termociclador e execute o programa para PCR1 descrito na Tabela 2.
      NOTA: Certifique-se de que o termociclador possa acomodar reações de 100 μL. Caso contrário, aliquota em reações de 50 μL. Escale conforme necessário.
    3. Agrupe todas as PCR1 das mesmas amostras em um único tubo.
    4. Limpeza do SPRI PCR1 usando 150 μL (1,5x) de esferas (siga os passos 4.1.3.3-4.1.3.7). Resuspenda cada reação PCR em 100 μL de EB 8,0.
      NOTA: Ao configurar este protocolo pela primeira vez, verifique o tamanho e a qualidade do produto de PCR rodando 2 μL de um produto de PCR de 30 ciclos em um sistema de eletroforese capilar (por exemplo, TapeStation Systems da Agilent).
  2. PCR2
    1. Prepare a mistura de PCR2 com 10 μL do produto da PCR1, 10 μL de tampão 5X, 0,5 μL de dNTP (100 mM), 1 μL de DNA polimerase, 1,25 μL de primers PCR2 de 10 μM listados na Tabela 1 (use uma combinação diferente de rP7-i7-BC e P5-i5-BC para cada amostra), e 26 μL de água de grau PCR para um volume total de 50 μL.
      NOTA: Para manter a representação da biblioteca, realize uma reação PCR2 a cada 104 construtos na biblioteca.
    2. Coloque os tubos em um termociclador e execute o programa para PCR2 descrito na Tabela 2.
    3. Limpeza SPRI PCR2 usando 75 μL (1,5x) de esferas (siga os passos 4.1.3.3-4.1.3.7). Resuspenda cada reação PCR em 50 μL de EB 8,0.
  3. Quantifique a PCR2 (ou seja, a biblioteca sgRNA) usando o kit de quantificação de dsDNA e verifique o tamanho do amplicão por eletroforese capilar (por exemplo, TapeStation Systems). Junte as amostras.
  4. Sequência em um instrumento Illumina.
    NOTA: Para a biblioteca Brunello Kinome 1 de 3052 sgRNA aqui, uma profundidade de sequenciamento de 100-200 milhões de leituras por amostra é tipicamente suficiente.

6. Análise

  1. Demultiplex samples usando bcl2fastq.
  2. Verifique a qualidade dos arquivos fastq gerados com o FastQC.
  3. Extraia a sequência do sgRNA usando como padrão as sequências de que flanqueiam o sgRNA, assim como o comprimento do guia (20 nt).
  4. Alinhe a sequência extraída à referência da biblioteca usando o Bowtie2 para verificar quantos dos guias hipotéticos são sgRNA autênticos da biblioteca. Use o samtools para converter o arquivo SAM com informações sobre o alinhamento para o formato BAM e gerar arquivos resumo.
  5. Conte e normalize o número de leituras para cada sgRNA nas amostras editadas e controle com a função de contagem do software MAGecK.
  6. Compare as contagens com a função de teste do MAGecK para obter as pontuações de RRA e a lista de genes candidatos.

Resultados

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Conforme descrito na Seção de Protocolo, as células CAR T foram geradas seguindo nosso protocoloestabelecido 26. Para a triagem do CRISPR, adaptamos o fluxo de trabalho desenvolvido por Wang et al.17 (Figura 1A). Brevemente, células T de dois doadores independentes foram isoladas e ativadas por 24 horas antes da transdução consecutiva tanto com a biblioteca de sgRNA CRISPR quanto com o vetor lentiviral CAR, atingindo 67 e 72% de células CAR-positivas no quinto dia. Uma fração das células foi nucleofectada com a proteína Cas9 para induzir knockouts, enquanto as células restantes serviram como base para a representação do sgRNA. Células transduzidas foram selecionadas com antibióticos, e populações distintas foram posteriormente classificadas de acordo com os fenótipos em estudo. A proliferação das células CAR T foi monitorada em toda a triagem usando contagens celulares baseadas em AOPI, expressa como mudança de dobra (Figura 1B). Após a suplementação de puromicina nos dias 8, 10 e 12, confirmamos o enriquecimento bem-sucedido das células CAR T transduzidas com a biblioteca CRISPR em ambos os doadores, evidenciado pela sobrevivência e proliferação contínuas. Células T não transduzidas (UTD) e células T CAR sem transdução da biblioteca CRISPR foram usadas como controles da seleção de antibióticos.

Após a extração genômica de DNA, bibliotecas de sgRNA foram preparadas por amplificação por PCR. Para superar problemas decorrentes do excesso de transferência de gDNA, implementamos um protocolo que incorpora digestão enzimática de restrição e puxão de biotina-estreptavidina do sgRNA (Figuras 2A,B). o gDNA foi digerido com as enzimas de restrição NdeI e PspXI que flanqueiam o sgRNA (Figura 2C). Oligos biotinilados, projetados para se ligar a montante dos sítios de recozimento do primer PCR1, foram usados para capturar fragmentos de de sgRNA, sendo então puxados para baixo com esferas de estreptavidina para eliminar o gDNA recarregado. Fragmentos contendo sgRNA foram então amplificados seletivamente (Figura 2D) e indexados por meio de 2 PCRs consecutivas.

As bibliotecas de cada amostra foram sequenciadas usando o Sequenciamento de Próxima Geração (NGS). Após a desmultiplexação, controle de qualidade e identificação do sgRNA, os dados foram analisados com o pipeline MAGeCK. Primeiro, o comando de contagem quantificou e normalizou as contagens de leitura de sgRNA em amostras controle (basais) e editadas por Cas9 (Figuras 3A,B). As correlações de Pearson e Spearman indicam que a representatividade do sgRNA foi mantida durante o experimento (gDNA doador) em comparação com a biblioteca plasmídica (Figura 3C). Em seguida, o comando de teste comparou ambas as condições, atribuindo escores robustos de agregação de classificações (RRA) a cada gene (Figura 3D). Genes significativamente enriquecidos ou esgotados foram identificados usando limiares de p < 0,05 e log fold change (LFC) > 0,5 (Figura 3E). Por fim, foi realizada a análise de enriquecimento de vias dos genes candidatos usando Metascape, revelando os principais termos da Ontologia Genética associados aos reguladores identificados (Figura 3F).

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Figura 1: Triagem CRISPR em células CAR T. (A) Esquema da triagem CRISPR em células CAR T. (B) Seleção de células transduzidas com puromicina (P). As bibliotecas plasmídicas incluem um gene de resistência à puromicina para seleção positiva. O antibiótico foi adicionado no dia 8 ao meio em amostras não transduzidas de células T não transduzidas (UTD) e CAR T transduzidas. Amostras sem puromicina foram usadas como controle da proliferação. Os dados de dois doadores independentes são mostrados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Preparação da biblioteca para análise de enriquecimento de sgRNA. (A) Esquema do protocolo para preparação da biblioteca. (B) Esquema da localização relativa dos tamanhos de corte da enzima de restrição (tesouras) e das regiões de recozimento dos primers PCR1 (seta) e dos primers biotinilados (seta com ponto verde). (C) Eletroforese do gDNA pré e pós digestão de RE. (D) Enriquecimento seletivo de de sgRNA após PCR1. Os dados de dois doadores independentes de amostras basais e Cas9 dos dois fenótipos são apresentados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Guia análise de enriquecimento com MAGeCK. (A) Resumo da saída da função de contagem MAGeCK. (B) Distribuição das contagens de leituras. (C) Coeficientes de Pearson e Spearman para correlação entre o gDNA doador e a contagem de bibliotecas de plasmídeos. (D) Genes potenciais enriquecidos/esgotados classificados por uma agregação robusta modificada (escórrea RRA). (E) Gráfico vulcânico mostrando genes significativos (valor p < 0,05, LFC > 0,5) em vermelho. (F) Termos da Ontologia Superior de Genes (GO) após análise da via Metascape dos genes significativos enriquecidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Sequência de primers. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Condições de PCR. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela Suplementar 1: Lista de sgRNA na biblioteca Kinome 1 e sgRNAs perdidos durante a digestão com NdeI e PspXI Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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A triagem CRISPR baseia-se no princípio da perturbação de guia único, o que significa que apenas um sgRNA deve ser integrado por célula. Para isso, os sgRNAs são tipicamente entregues por vetores lentivirais, e a multiplicidade de infecções (MOI) deve ser cuidadosamente controlada. Um MOI de ca. 0,3 é geralmente recomendado, resultando em 25% a 30% das células sendo transduzidas por uma única partículaviral 6. A titulação precisa é, portanto, essencial para determinar o volume de partículas virais necessárias. Outro passo crítico é a perda da cobertura de sgRNA durante o protocolo. A perda celular durante a colheita, ineficiências durante a extração de gDNA (principalmente sobrecarga na coluna e elução incompleta do DNA) ou molde excessivo durante a amplificação por PCR podem contribuir para essa perda, distorcendo assim nossa análise de sgRNA. Sobre os oligos biotinilados, é melhor que sejam purificados com HPLC para evitar que a biotina livre usada na síntese sature as esferas de estreptavidina. Além disso, um amino-modificador 3' é fortemente sugerido para evitar a amplificação pelos primers biotinilados em PCRs subsequentes. Além disso, ao projetar esses oligos, evite qualquer sobreposição com primers PCR1 para evitar competição durante a amplificação. Além disso, a análise bioinformática requer atenção cuidadosa: os padrões de extração de sgRNA dependem da espinha dorsal plasmídica (por exemplo, lentiGuide-puro ou lentiCRISPR v2), e a stringência do alinhamento pode variar desde correspondência exata até alguma tolerância a desajustes. Além disso, como esse protocolo inclui uma etapa de digestão, alguns sgRNAs contendo sítios de restrição podem ser perdidos, exigindo ajuste da biblioteca de referência.

Neste estudo, propomos um protocolo otimizado de preparação da biblioteca de triagem CRISPR que enriquece fragmentos contendo sgRNA por meio da digestão e, mais importante, de uma etapa de pulldown. A digestão de enzimas de restrição já foi sugerida anteriormente como uma estratégia para reduzir a entrada de gDNA e enriquecer para desgRNA 27. De forma semelhante, sondas biotiniladas têm sido amplamente aplicadas em biologia molecular para capturar ácidos nucleicos específicos ou complexos proteína-ácidonucleico 28,29,30,31.

Nosso protocolo se baseia nesses princípios e os adapta para a triagem CRISPR em células CAR T primárias, embora várias limitações devam ser reconhecidas. Primeiro, as células T CAR primárias impõem restrições na escala de proteção, pois sua capacidade de expansão é limitada. Para manter cobertura adequada e representação do sgRNA, é necessário um grande número de células iniciais. Quando isso não é viável, bibliotecas personalizadas menores podem serusadas 12, embora isso reduza a amplitude da interrogação genética. A variabilidade biológica é outro desafio; Diferenças entre doadores são esperadas, e a sobreposição de casos significativos costuma sermodesta de 17. Segundo, a estratégia de enriquecimento depende da presença e posição dos locais de corte da enzima de restrição. Em casos raros, esses sítios podem ocorrer dentro de sequências de sgRNA, o que é mais problemático para bibliotecas pequenas com redundância limitada. No entanto, a maioria das bibliotecas, especialmente os desenhos genômicos amplos, inclui múltiplos sgRNAs por alvo, minimizando o impacto geral da perda de guias. Por fim, estratégias alternativas de enriquecimento baseadas em fragmentação, como a sonicação acoplada à captura desonda 24, podem oferecer certa flexibilidade em casos em que a digestão por enzima de restrição não seja adequada.

No geral, o sgRNA representa uma fração minúscula do DNA genômico total em células editadas por CRISPR, tornando o enriquecimento eficiente fundamental para a preparação bem-sucedida da biblioteca. Comparado aos protocolos padrão, nosso fluxo de trabalho otimizado reduz a transferência de gDNA e favorece a amplificação por PCR do sgRNA de interesse. Embora a combinação de fragmentação de gDNA e pulldown da sonda biotinilada com esferas de estreptavidina não seja conceitualmente nova, sua integração na triagem CRISPR evita armadilhas comuns na PCR e aumenta a reprodutibilidade da tela CRISPR. Além disso, incorporar métricas padronizadas de QC em cada etapa-chave (como pureza pós-triagem das células T, proporção de células resistentes à puromicina, integridade do gDNA e eficiência da transdução do CAR) aumentaria ainda mais a robustez e reprodutibilidade do fluxo de trabalho. Em conclusão, embora desenvolvido no contexto de células T CAR primárias e com apenas dois doadores (o que pode representar uma limitação, embora várias amostras de cada doador tenham sido usadas), esse protocolo otimizado pode ser amplamente aplicável a outros rastreamentos CRISPR e fluxos de trabalho NGS com grandes portadores de gDNA.

Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado pelo projeto PID2022-137914OB-I00, financiado pela MICIU/AEI /10.13039/501100011033 e pela FEDER, UE. Este estudo foi apoiado pelo Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) por meio da Red de Terapias, Avanzadas, TERAV e TERAV+ (RD21/0017/0009 e RD24/0014/0010) e pelo Centro de Investigação Biomédica em Red de Câncer CIBERONC (CB16/12/00489). Este estudo foi apoiado pelo Governo de Navarra Salud (GN2023/08 e GN2024/04) e pelos Proyectos Estratégicos (DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 e 0011-1411-2023-000074). A Figura 1B e a Figura 2A foram criadas com BioRender.com

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4200 TapeStationAgilentG2991A
Laranja AcridinaInvitrogenA1301
AMPure XP Beckman CoulterA63881
Separador NEO autoMACSMiltenyi130-120-327Classificador de células magnéticas de alta velocidade
Oligos biotiniladosIDT
BSASigmaA9647
Contador de Células Fluorescentes K2 do VioloncêmetroRevvityCMT-K2-MX-150Contador de células fluorescentes
Câmaras de Contagem CHT4RevvityCHT4-SD100-002
Nanoesferas CD4 CytoSinctGenScriptL00863-1
Nanoesferas CD8 CytoSinctGenScriptL00864-1
dNTPAgilent200418-51
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen11206D
Ímã DynaMag-2Invitrogen12321D
EDTA 0,5 M pH 8,0Invitrogen15575-038
EtanolMerck1,00,98,31,000
Eletroporador ExPERT ATXMaxCyteExPERT ATx
Ficoll-PaqueCytiva17544203
Filtropur S 0.2 & micro; mSarstedt83,18,26,001
GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-ResearchGenScriptZ03621-1
Herculase Buffer 5XAgilent600675-52Buffer 5X
Enzima de Fusão Herculase IIAgilent600679-51DNA polimerase
IL-15Miltenyi130-095-765
IL-7Miltenyi130-095-362
Mastercycler X50aEppendorf6313HG006059
Buffer de Eletroporação MaxCyteCytivaEPB1
NdeIBiolaboratórios da Nova InglaterraR0111L
Tecido NucleospinMacherey-Nagel74,09,52,250
PBSGibco14190-094
PolybreneMerckTR-1003-6
PrimersThermoFisher
Propídio iodoSigmaP4864
PspXIBiolaboratórios da Nova InglaterraR0656S
PuromicinaGibcoA11138-03
Fluorômetro Qubit 3.0InvitrogenP33216
Ensaio de DNA Qubit HSInvitrogenQ32851
Montagem de Processamento de Poço Estéril R-50x3MaxCyteLM243882
Células T TransAct humanoMiltenyi130-111-160Reagente de estimulação das células T
Estação de Fita HSD1000Agilent5067-5585
TEXMACSMiltenyi130-097-196Meio de crescimento de células T
Tris Buffer, 1,0 m, pH 8,0, Grau em Biologia MolecularEMD Milipore648314
Água, para biologia molecular, livre de DNAse, RNAse e proteaseThermoScientific327390010

Referências

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