Apresentamos um protocolo para integrar multiômica randomização mendeliana, transcriptômica de célula única e triagem in silico baseada em estrutura, para delinear sistematicamente o eixo dos macrófagos semelhantes à drebrin (DBNL) na insuficiência cardíaca. Sugerimos DBNL como um alvo imunometabólico medicamentoso.
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Artigo de investigação
Mecanismos Moleculares da DBNL na Insuficiência Cardíaca: Do Imunometabolismo dos Macrófagos às Implicações Terapêuticas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A insuficiência cardíaca (IC) continua sendo um grande desafio global de saúde, com tratamentos eficazes limitados que visam seus principais mecanismos fisiopatológicos. Neste estudo, foi utilizada uma abordagem multiômica integrada que combina randomização mendeliana (RM) e sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) para identificar potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos para a IC. Utilizamos dados de estudos de associação genômica ampla (GWASs), loci quantitativos de expressão (eQTLs), loci quantitativos de traços de metilação (mQTLs) e loci quantitativos de características proteicas (pQTLs) para investigar os mecanismos genéticos da HF. O sequenciamento de RNA unicelular foi realizado para analisar a expressão gênica em macrófagos cardíacos, e a análise pseudotime foi usada para estudar a regulação dinâmica da DBNL durante a diferenciação de macrófagos. Simulações de acoplamento molecular e dinâmica identificaram ácido pirinídico (WY-14643; PubChem CID: 4594; Sinônimos: 50892-23-4; WY-14643) como potencial regulador do DBNL. A análise multiômica revelou que o DBNL (semelhante ao Drebrin) é um gene chave associado ao risco de IC. O sequenciamento de RNA de célula única revelou que o DBNL é expresso principalmente em macrófagos cardíacos e é regulado em alta sob condições patológicas. A expressão de DBNL pelos macrófagos está associada ao metabolismo imunológico e às vias profibrosivas, especialmente as vias de sinalização IL-6/JAK/STAT3, PI3K/AKT/mTOR e TGF-β. A análise de pseudotempo indicou que o DBNL tem um efeito regulatório dinâmico na diferenciação de macrófagos, especialmente em inflamação crônica. Acoplamentos moleculares e simulações dinâmicas mostraram que o ácido piridinínico tem um papel potencial na regulação do DBNL. Este estudo esclarece o papel da DBNL na progressão da insuficiência cardíaca e sugere seu potencial como alvo terapêutico. Importante destacar que a relevância terapêutica é inferida a partir de previsões computacionais. Essas descobertas oferecem novos insights sobre o metabolismo imunológico e a comunicação intercelular mediada por macrófagos, estabelecendo uma base teórica para futuras aplicações na otimização de medicamentos direcionados para DBNL e pesquisas funcionais. No entanto, validação experimental adicional e estudos pré-clínicos são necessários para comprovar a eficácia clínica do DBNL como alvo terapêutico.
Introdução
A insuficiência cardíaca (IC) representa um desafio global significativo e crescente de saúde que afeta milhões de pessoas ao redor do mundo e coloca uma pressão econômica considerável sobre os sistemasde saúde 1. Consequentemente, há uma necessidade urgente de intervenções eficazes no manejo da insuficiência cardíaca (IC).
A fisiopatologia complexa da insuficiência cardíaca origina-se da contrilidade miocárdica comprometida do ventrículo esquerdo, levando a uma cascata de complicações sistêmicas, como congestão pulmonar eperiférica 2. No entanto, abordar diretamente os mecanismos fisiopatológicos fundamentais que fundamentam a progressão da insuficiência cardíaca, especialmente a remodelação adversa do miocárdio, continua sendo um desafio crítico e não satisfeito3. Nas últimas décadas, o domínio da pesquisa biomédica passou por uma mudança de paradigma substancial, facilitada principalmente pela incorporação de tecnologias multiômicas e metodologias avançadas de bioinformática. Essas ferramentas oferecem oportunidades excepcionais para identificar novos biomarcadores e alvos terapêuticos de doenças. Randomização mendeliana (RM), uma abordagem rigorosa de epidemiologia genética, utiliza polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) como variáveis instrumentais para inferir relações causais entre exposições genéticas e desfechosclínicos 4. Ao adotar a estrutura metodológica dos ensaios clínicos randomizados, a randomização mendeliana (RM) aborda efetivamente os problemas de causalidade de confusão e inversa para fornecer evidências robustas para a identificação e reutilização de alvos de medicamentos. Paralelamente, o sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) revela heterogeneidade tecidual com resolução incomparável, oferecendo insights profundos sobre a expressão gênica específica de cada tipo celular e redes de comunicação intercelular dentro de órgãos complexos como ocoração 5. A abordagem multiômica, que sintetiza dados genéticos, transcriptômicos e proteômicos, oferece um potencial substancial para elucidar mecanismos de doenças e identificar vias terapêuticas.
Apesar desses avanços tecnológicos, persistem lacunas significativas de conhecimento sobre os mecanismos celulares e moleculares específicos que impulsionam a inflamação cardíaca e a remodelação na insuficiência cardíaca. Evidências acumuladas sugerem que as células imunológicas, especialmente os macrófagos, são cruciais para orquestrar respostas inflamatórias e subsequente remodelação dos tecidos durante processos de lesão miocárdica e insuficiência cardíaca crônica, que por sua vez são cruciais para a progressão dadoença 6. Pesquisas anteriores se concentraram predominantemente em mediadores inflamatórios amplos ou marcadores da superfície celular, resultando em uma lacuna significativa na exploração de alvos regulatórios intracelulares dentro dessas populações imunológicas cruciais. Além disso, embora estudos tradicionais de associação genômica ampla (GWASs) tenham identificado inúmeras associações genéticas relacionadas à insuficiência cardíaca, eles frequentemente enfrentam desafios para estabelecer relações causais definitivas, limitando assim sua aplicabilidade para tradução terapêuticadireta 7. Consequentemente, a implementação de um quadro abrangente multiômico de randomização mendeliana (RM), que incorpora variantes genéticas que influenciam a metilação do DNA (mQTLs), a expressão gênica (eQTLs) e a abundância de proteínas (pQTLs), é essencial para alcançar inferências causais mais robustas entre múltiplas camadas regulatórias biológicas. Essa abordagem aborda as limitações inerentes associadas aos estudos QTL de camada única. Notavelmente, a proteína semelhante ao Drebrina (DBNL) tem sido objeto de extensas pesquisas no contexto do desenvolvimento neuronal e da dinâmica docitoesqueleto 8; No entanto, sua importância funcional e potencial terapêutico em doenças cardiovasculares, especialmente insuficiência cardíaca, permanecem amplamente inexplorados. Essa lacuna significativa em nosso entendimento impede a consideração do DBNL como um alvo novo e potencialmente viável para o desenvolvimento de medicamentos no tratamento da insuficiência cardíaca.
Para abordar essas lacunas críticas de conhecimento, este estudo visa identificar de forma robusta genes-chave causalmente associados ao risco de insuficiência cardíaca por meio de uma estrutura integrada multiômica de RM que combina dados de eQTL, mQTL e pQTL. Este estudo apresenta uma abordagem inovadora envolvendo a integração de análises multiômicas de randomização mendeliana — incluindo loci quantitativos de expressão (eQTLs), loci quantitativos de características de metilação (mQTLs) e loci quantitativos de características proteicas (pQTLs) — com dados transcriptômicos de célula única de alta resolução (GSE161470) e dados transcriptômicos em massa (GSE161472) para identificar sistematicamente o gene DBNL como fator crítico de risco causal para insuficiência cardíaca. Esses achados demonstram que a DBNL é predominantemente e especificamente expressa em macrófagos cardíacos e que sua expressão muda dinamicamente ao longo do processo de diferenciação. Além disso, os resultados deste estudo elucidam o papel fundamental da DBNL na modulação do microambiente imunológico cardíaco e na orquestração de vias imunometabólicas associadas à insuficiência cardíaca, como a cascata de sinalização IL-6/JAK/STAT3, bem como as vias de sinalização profibrosas. Além disso, empregando técnicas de biologia computacional, esta pesquisa prevê que o ácido piridilo (WY-14643) seja um ligante de alta afinidade para DBNL, fornecendo assim uma estrutura teórica abrangente e multidimensional que apoia a designação do DBNL como um novo alvo terapêutico para insuficiência cardíaca e facilita o desenvolvimento de intervenções farmacológicas direcionadas. Utilizando sequenciamento de RNA de célula única, caracterizamos as vias de expressão celular específica e funcionais do gene chave DBNL identificado no microambiente cardíaco, e investigamos o papel do DBNL nas vias de sinalização imunometabólica e profibrosas, bem como na comunicação célula-célula entre tipos celulares cardíacos. Ligantes potenciais de pequenas moléculas para DBNL foram identificados por meio de acoplamento molecular computacional e simulações de dinâmica molecular. Hipotetizamos que a DBNL, que é expressa principalmente em macrófagos cardíacos, exerce um efeito causal na progressão da insuficiência cardíaca ao regular vias imunometabólicas e a diafonia intercelular. Em resumo, ao integrar a randomização mendeliana multiômica avançada com análise de célula única de alta resolução, identificamos e caracterizamos sistematicamente novos alvos terapêuticos para insuficiência cardíaca e exploramos potenciais alvos moduladores de pequenas moléculas.
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Protocolo
Download de Dados
Dados de Expressão Gênica
Os dados de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) utilizados no presente estudo foram obtidos do repositório Gene Expression Omnibus (GEO) mantido pelo Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), especificamente a partir do conjunto de dados com número de acesso9 GSE161470 (tecido cardíaco humano composto por quatro amostras controle e uma amostra patológica). Este conjunto de dados foi originalmente publicado por Zhang et al. em 202210. O objetivo principal da investigação original foi examinar a heterogeneidade celular e os mecanismos regulatórios moleculares no tecido cardíaco humano sob condições de insuficiência cardíaca. Para a análise atual, cinco amostras deste conjunto de dados, cada uma composta por perfis abrangentes de expressão unicelular derivados de tecido cardíaco humano, foram selecionadas. O outro conjunto de dados utilizado neste estudo também foi obtido do repositório público GEO do NCBI, especificamente o Arquivo de Matriz Série correspondente ao número de acesso GSE161472, acompanhado pelo arquivo de anotação GPL11154. O perfil de expressão compreende um total de 84 amostras, incluindo 37 amostras controle e 47 amostras de doença. Essa pesquisa abrange uma análise integrativa de multiômica, com todas as investigações realizadas usando dados acessíveis ao público.
Dados eQTL
Os dados do eQTL, obtidos do consórcio eQTLGen, focam em elucidar a estrutura genética da expressão gênica no sangue e os fatores genéticos que influenciam característicascomplexas 3. O consórcio está atualmente envolvido na segunda fase de seu extenso projeto, realizando meta-análises de dados genômicos abrangentes relacionados à expressão gênica no sangue.
Dados de exposição - mQTLs
Os dados mQTL foram obtidos a partir de uma meta-análise publicada da coorte europeia (EUR), que examina a metilação do DNA no sangue inteiro dentro do arcabouço genético de 3.701 amostras de populações de ascendênciaeuropeia 11. O conjunto de dados incluiu informações sobre 426.636 características mQTL.
Dados de exposição - pQTL
Os dados de plasma pQTL foram adquiridos do banco de dados deCODE (https://www.decode.com/summarydata/)4. Este estudo utilizou a divulgação de dados de 2021 do conjunto de dados deCODE pQTL, abrangendo um estudo de associação genômica ampla (GWAS) dos níveis de proteínas plasmáticas medidos usando 4.907 aptamers em uma coorte de 35.559 indivíduos de descendência europeia.
Dados de resultado
Estatísticas resumidas para insuficiência cardíaca foram obtidas a partir de um estudo de associação genômica ampla em grande escala (GWAS) envolvendo principalmente participantes de ascendência europeia, acessado por meio do banco de dados do Instituto Europeu de Bioinformática (EBI) (GCST90162626). O conjunto de dados de insuficiência cardíaca incluiu 115.150 casos e 1.550.331 controles. O Catálogo GS, que abrange publicações, associações líderes e estatísticas resumidas detalhadas, atualmente oferece dados mapeados para a Genome Assembly e para a Build dbSNP.
Análise de randomização mendeliana de mQTLs, eQTLs e pQTLs
Para investigar sistematicamente as potenciais relações causais entre expressão gênica, abundância de proteínas, níveis de metilação do DNA e risco de insuficiência cardíaca, foram realizadas análises de randomização mendeliana (RM) utilizando loci de traços quantitativos de expressão (eQTLs), loci quantitativos de características de proteínas (pQTLs) e conjuntos de dados de loci de traços quantitativos de metilação (mQTLs). Durante a fase de pré-processamento dos dados de exposição, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) associados a cada variável de exposição (gene, proteína ou sítio de metilação) foram extraídos dos respectivos bancos de dados com um limiar de significância genômica de P < 1 × 10⁻⁵ para servir como variáveis instrumentais (IVs) candidatas iniciais. Posteriormente, foi realizado agrupamento por desequilíbrio de ligação (LD) para cada IVs de fatores de exposição usando uma janela de 10.000 kilobases (kb) e um limiar LD R² de 0,001 para garantir a independência entre os instrumentos. Esses IVs selecionados foram então harmonizados com estatísticas resumidas de um estudo de associação genômica em toda a insuficiência cardíaca (GWAS; ID: GCST90162626) empregando a função read_outcome_data, mantendo apenas aqueles SNPs que apresentam valor de associação P abaixo de 5×10⁻⁵ no conjunto de dados de resultados. Para mitigar o viés fraco do instrumento, a estatística F para cada IV foi calculada como F = (β_exposure/SE_exposure)², e apenas instrumentos com F > 10 foram incluídos nas análises subsequentes. Para a estimativa do efeito causal, o alinhamento de alelos entre os conjuntos de dados de exposição e resultado foi realizado usando a função harmonize_data do pacote TwoSampleMR. Análises de RM foram então realizadas empregando quatro abordagens estatísticas complementares: (1) o método ponderado inversamente da variância (IVW), que fornece meta-análises das estimativas da razão de Wald entre SNPs; (2) Regressão MR-Egger, que leva em conta a pleiotropia direcional incorporando um termo de interceptação sob a suposição Instrument Strength Independent of Direct Effect (InSIDE); (3) o método da mediana ponderada, que fornece estimativas causais consistentes mesmo que até 50% dos instrumentos sejam inválidos; e (4) o método do modo ponderado, que identifica o agrupamento de estimativas de efeitos causais mais frequente, oferecendo poder estatístico aprimorado e redução do erro do tipo I em relação à MR-Egger. Em casos em que apenas uma única variável instrumental estava disponível, o método da razão de Wald era aplicado exclusivamente. Para avaliar a robustez dos achados, foram realizadas análises abrangentes de sensibilidade, incluindo testes de heterogeneidade via a função mr_heterogeneity, avaliação de pleiotropia usando mr_pleiotropy_test e análises leave-one-out implementadas pela função mr_leaveoneout, que exclui iterativamente cada SNP para determinar a influência de variantes individuais nos resultados gerais. Associações significativas foram visualizadas usando ferramentas gráficas como mr_scatter_plot e mr_forest_plot. Esse pipeline analítico foi aplicado de forma uniforme nos conjuntos de dados eQTL, pQTL e mQTL para manter a consistência metodológica ao longo do estudo.
Análise de colocalização
Foi realizada uma análise de colocalização pelo método Coloc, dados resumidos eQTL e um GWAS de insuficiênciacardíaca 5. O polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) de índice foi utilizado para calcular a probabilidade posterior dentro de uma janela de aglomeração de 100 kb. Na análise de colocalização (coloc), a Hipótese H3 denota a posteriori a probabilidade de que as duas características, a saber, expressão gênica e insuficiência cardíaca, estejam correlacionadas, mas possuam variantes causais distintas. Por outro lado, a Hipótese H4 indica a posteriori a probabilidade de que a associação entre as duas características seja atribuível a uma única variante causal compartilhada. Um limiar do SNP. PP. H4 maior que 0,90 foi usado para determinar a colocalização.
Infiltração imune
O método CIBERSORT é uma técnica amplamente adotada para avaliar tipos de células imunológicas no microambiente12. Ao utilizar princípios de regressão de vetores de suporte, é possível realizar uma análise de desconvolução da matriz de expressão dos subtipos de células imunes. Ao incorporar 547 biomarcadores, o CIBERSORT pode diferenciar 22 fenótipos de células imunes humanas, incluindo células T, células B, células plasmáticas e várias subpopulações de células mieloides. Utilizando o conjunto de dados GSE161472, foi realizada uma análise utilizando o algoritmo CIBERSORT em conjunto com sua matriz integrada de assinatura LM22, que caracteriza os perfis de expressão gênica de 22 tipos distintos de células imunes humanas. Os níveis de infiltração dessas 22 populações de células imunes foram quantificados para cada amostra individual. Subsequentemente, a função cor.test foi aplicada para avaliar as correlações entre a expressão de genes-chave e os níveis correspondentes de infiltração das células imunes.
Processamento de dados e controle de qualidade de sequenciamento de RNA de célula única
Os dados do perfil de expressão de célula única foram processados usando o pacote Seurat (V4.3.0) no ambiente R (V4.3.0) 6. Este estudo utilizou um fluxo de trabalho convencional para a análise de dados de sequenciamento de RNA de célula única. Inicialmente, os perfis de expressão eram importados utilizando o pacote Serat. As células foram filtradas com base em várias métricas de qualidade, incluindo a contagem total de UMI de cada célula, número de genes expressos, proporção de leituras mitocondriais e proporção de leituras ribossomais. Valores aberrantes foram identificados como valores que se desviam da mediana em mais de três desvios absolutos da mediana (MADs). Os limiares específicos de filtragem aplicados foram os seguintes: nFeature_RNA ≥ 200, percent.mt ≤ 2,15718, nFeature_RNA ≤ 2840,941 e nCount_RNA ≤ 5194,27. Tipicamente, células com contagens totais excessivamente altas de UMI e números de genes expressos foram classificadas como doublets, enquanto células com porcentagens elevadas de leituras mitocondriais ou ribossomárias foram consideradas de baixa qualidade, potencialmente sofrendo apoptose ou fragmentação. Seguindo essas etapas de filtragem, o DoubletFinder (versão 2.0.4) foi empregado para identificar e remover doublets de cada amostra individualmente, completando o processo de controle de qualidade da célula. Inicialmente, a normalização dos dados era realizada usando a função normalizeData. O status do ciclo celular foi posteriormente avaliado pela função CellCycleScoring, e genes altamente variáveis foram identificados pelo método FindVariableFeatures. O conjunto de dados foi então ampliado usando o ScaleData para padronizar os dados e mitigar a influência dos genes mitocondriais, genes ribossomos e efeitos do ciclo celular nas análises posteriores. A redução linear da dimensionalidade foi realizada usando análise de componentes principais (PCA) através da função RunPCA, com componentes principais significativos selecionados para análise posterior. Para lidar com efeitos em lote entre diferentes amostras, foi utilizado o algoritmo Harmony (versão 1.1.0). Essa abordagem agrupa iterativamente células semelhantes de lotes distintos dentro do espaço PCA, mantendo a diversidade de lotes dentro dos clusters. Dado os efeitos de lote relativamente leves observados no conjunto de dados, parâmetros padrão (θ = 2) foram aplicados. A redução de dimensionalidade não linear foi posteriormente realizada usando RunUMAP, seguida pela construção de um grafo de vizinhança de células via FindNeighbors e clusterização de células via FindClusters. Para anotação de tipos celulares, foi implementado um framework hierárquico de anotação: a anotação manual primária baseava-se em padrões característicos de expressão gênica informados pelo banco de dados CellMarker e pela literatura pertinente; isso foi complementado por resultados automatizados de anotação obtidos do software SingleR como referência. Para aumentar ainda mais a precisão e a abrangência da identificação de tipos celulares, foram consultados múltiplos bancos de dados autoritativos, incluindo o Human Primary Cell Atlas (HPCA), BlueprintEncode, MonacoImmune, DatabaseImmuneCell e NovershternHaematopoietic. A anotação celular era realizada consultando o banco de dados CellMarker (http://117.50.127.228/CellMarker/CellMarkerBrowse.jsp) e revisando a literatura, auxiliada pelo suporte automatizado de anotação fornecido pelo software SingleR (V2.4.0) 13. O objetivo é identificar os tipos celulares presentes no tecido correspondente e seus genes marcadoresassociados 14.
Análise das interações ligante-receptor
Neste estudo, o CellCall (versão 1.0.7) foi usado para realizar uma análise abrangente das redes de comunicaçãointercelular 15. Ao utilizar anotações de tipo celular derivadas do Seurat junto com a matriz bruta de contagem, foi construído um objeto de análise normalizado com parâmetros configurados para o genoma humano. A função TransCommuProfile foi aplicada para quantificar a força das interações célula-célula por meio de um algoritmo ponderado, implementando um limiar de significância de um valor p < 0,05 para identificar pares ligante-receptor confiáveis. Os pares de interação significativos foram posteriormente submetidos à análise de enriquecimento de vias KEGG via a função getHyperPathway, e as relações entre tipos celulares e vias foram ilustradas usando gráficos de bolhas. A rede de comunicação geral foi visualizada por meio de um gráfico circular, no qual oito cores distintas indicavam diferentes tipos de células. A intensidade da interação e a direcionalidade foram representadas por características de setas, fornecendo uma caracterização detalhada da dinâmica da sinalização intercelular.
Análise de pseudotempo
Para investigar a regulação transcricional dinâmica dos macrófagos ao longo da progressão da insuficiência cardíaca, este estudo utilizou o algoritmo Monocle para realizar análise de pseudotempo em subpopulações de macrófagos. A matriz de expressão gênica correspondente às subpopulações celulares-alvo foi extraída para construir objetos de análise de trajetória de célula única, com genes altamente variáveis selecionados como características de ordenação. Ao empregar a técnica de redução de dimensionalidade DDRTree, as células foram mapeadas em um espaço bidimensional para reconstruir a trajetória de diferenciação. Análises de visualização foram realizadas para determinar a distribuição das células ao longo do eixo do pseudotempo e identificar genes cuja expressão mudou significativamente ao longo do pseudotempo. Análises subsequentes concentraram-se no gene-chave DBNL e caracterizaram sua dinâmica de expressão ao longo da trajetória celular, elucidando os mecanismos de reprogramação transcricional dos macrófagos durante a progressão da insuficiênciacardíaca 16.
Análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA)
Neste estudo, uma abordagem GSEA foi usada para elucidar os mecanismos regulatórios associados aos genes-chave envolvidos na insuficiência cardíaca. Utilizando genes-chave previamente identificados, as amostras foram estratificadas em coortes de alta e baixa expressão com base no valor mediano de expressão. A análise diferencial de expressão foi realizada utilizando o pacote limma, gerando uma lista de genes ordenada de acordo com a mudança de dobra log (logFC). A análise subsequente de enriquecimento de vias KEGG foi realizada usando a ferramenta clusterProfer, com conjuntos de genes provenientes do banco de dados MsigDB servindo como base de referência de fundo. O algoritmo GSEA foi então aplicado para identificar vias de sinalização significativamente enriquecidas entre os dois grupos de expressão, e um limiar ajustado de valor p inferior a 0,05 foi usado para determinar a significância estatística. Para ilustrar as funções regulatórias dos genes centrais dentro de vias críticas, várias técnicas de visualização, incluindo gráficos GSEA multivia e diagramas de redes circulares, foram utilizadas.
Análise de variação de conjuntos gênicos (GSVA)
GSVA é uma abordagem não paramétrica e não supervisionada utilizada para avaliar o enriquecimento de conjuntos gênicos dentro de dados transcriptômicos. Esse método transforma variações em nível gênico em variações em níveis de via ao calcular escores compostos para conjuntos específicos de genes, facilitando a avaliação de mudanças funcionais biológicas em várias amostras. No presente estudo, os conjuntos de genes foram obtidos do Banco de Dados de Assinaturas Moleculares. O algoritmo GSVA foi empregado para calcular escores compostos para cada conjunto de genes, permitindo a avaliação de possíveis alterações funcionais biológicas entre diferentes amostras. Os resultados da análise de enriquecimento GSVA são fornecidos no material suplementar (Tabela Suplementar 1).
Previsão de medicamentos para CTD
O gene-alvo (DBNL) foi inserido no campo de busca do Banco de Dados de Toxicogenômica Comparativa (CTD), a categoria de doença "doença cardiovascular" foi selecionada e a consulta foi executada para recuperar dados de predição de medicamentos associados à condição "insuficiência cardíaca". Os resultados obtidos da previsão foram posteriormente importados para o software Cytoscape para facilitar a visualização de dados e possibilitar a construção de um mapa de rede de interação gênico-química.
Métodos de acoplamento molecular
Devido à estrutura cristalina tridimensional não resolvida da proteína DBNL humana (UniProt ID: Q9UJU6), este estudo previu a estrutura tridimensional da DBNL com base no AlphaFold317. Ácido pirínixo (WY-14643) está disponível para download no banco de dados PubChem (PubChem CID: 5694). Depois, a estrutura da proteína foi pré-processada usando o software MGLTools (versão 1.5.7)18, incluindo etapas como a adição de átomos de hidrogênio. Ao mesmo tempo, proteínas e pequenas moléculas foram convertidas no formato PDBQT necessário para acoplamento. O software AutoDock Vina (versão 1.1.2)19 foi usado para acoplamento molecular global (exogenicidade=16, num_modes=30) para explorar modos potenciais de ligação. Após a conclusão dos cálculos de acoplamento, a conformação complexa com maior afinidade, indicada pela menor energia livre de ligação, deve ser selecionada como estrutura inicial para simulações subsequentes de dinâmica molecular.
Método de simulação de dinâmica molecular
Para investigar sistematicamente a estabilidade da ligação e os mecanismos de interação entre compostos candidatos e proteínas, foram realizadas simulações convencionais de dinâmica molecular (MD) utilizando o pacote de software GROMACS (versão 2024.03)20. Os parâmetros da proteína foram gerados usando o campo de força Amber14SB21, o modelo de molécula de água foi gerado usando o modeloTIP3P 22, e os parâmetros da topologia do ligando foram gerados utilizando a ferramenta Antechamber Python Parser Interface (ACPYPE), baseada no Campo de Força Âmbar Geral (GAFF). O sistema complexo ligante-proteína foi posteriormente situado dentro de uma caixa octaédrica periódica de fronteira preenchida com moléculas de água TIP3P. Íons de sódio (Na⁺) e cloreto (Cl⁻) foram introduzidos para alcançar uma concentração de 0,15 mol/L e neutralizar a carga total do sistema. Após a conclusão da construção do sistema, o passo inicial envolveu minimizar a energia usando o método de descida mais íngreme por 50.000 degraus, com o objetivo de eliminar quaisquer conformações potencialmente irrazoáveis dentro da estrutura. Duas etapas de equilíbrio do sistema foram posteriormente realizadas: uma simulação NVT (número constante de partículas, volume e temperatura) de 100 ps seguida por uma simulação de 100 ps NPT (número constante de partículas, pressão e temperatura). Durante essas simulações, restrições posicionais foram aplicadas aos átomos pesados da espinha dorsal da proteína para preservar a integridade estrutural da proteína. A temperatura era mantida em 300 K usando o termostato V-rescale, e a pressão era regulada em 1 bar empregando o barostato de Parrinello-Rahman para acoplamento de pressão. Após a conclusão da fase de equilíbrio, uma simulação de fase de produção com duração de 100 nanossegundos foi realizada, durante a qual todas as restrições posicionais são eliminadas. A trajetória foi integrada usando um passo de tempo de 2 femtossegundos, e o método de malha de partículas (PME) foi empregado para gerenciar com precisão interações eletrostáticas de longo alcance. A trajetória era salva a cada 10 ps, e um total de 10.000 quadros eram gerados para análises subsequentes. Além disso, trajetórias estáveis no intervalo de 90-100 ns foram extraídas da simulação, e a energia livre de ligação dos complexos proteicos de ligantes foi calculada usando a ferramentaMMPBSA 23 do gmx.
Análise estatística
A validade dessa análise de randomização mendeliana (RM) depende de três pressupostos fundamentais. (1) Relevância: As variáveis instrumentais (IVs) devem apresentar forte associação com a exposição. (2) Independência: Os IVs devem ser independentes de quaisquer fatores de confusão que afetem tanto a exposição quanto o resultado. (3) Restrição de Exclusão: Os IVs devem influenciar o resultado exclusivamente por meio do impacto que têm na exposição. Uma violação dessa suposição, quando uma IV afeta o resultado por meio de vias que não envolvem a exposição, é chamada de pleiotropia horizontal. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando a versão R 4.3.0, com testes bilaterais, e um valor p inferior a 0,05 foi geralmente considerado indicativo de significância estatística.
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Resultados
Identificação do DBNL como gene associado ao risco de insuficiência cardíaca por meio de randomização mendeliana e análise de colocalização
O identificador de desfecho para amostras relacionadas à insuficiência cardíaca, GCST90162626, foi obtido a partir do conjunto de dados estatísticos resumidos. As relações causais entre 1.247 pares de loci quantitativos de traços de expressão (eQTLs) e desfechos foram determinadas utilizando as funções extract_instruments e extract_outcome_data (Tabela Sup...
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Discussão
Embora a inflamação constitua um aspecto fundamental da fisiopatologia da insuficiência cardíaca (IC), investigações anteriores concentraram-se predominantemente em mediadores inflamatórios generalizados e marcadores da superfíciecelular 17,18,24. Esse foco restringiu a elucidação dos mecanismos celulares específicos envolvidos. Para superar essas limitações, utilizamos uma abordagem integrativa...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este programa de pesquisa foi apoiado pela Fundação Provincial de Ciências Naturais da China de Zhejiang (LTGY24H020001), pelo Projeto de Ciência e Tecnologia sobre Medicina Tradicional Chinesa na Província de Zhejiang (2023ZR131, 2023ZL158), pelo Projeto-Chave de Bem-Estar Público de Ningbo (2024S030), pelo Programa de P&D em Tecnologia Chave de Ningbo (2022Z149), pelo Laboratório Chave de Medicina de Precisão para Doenças Ateroscleróticas da Província de Zhejiang (2022E10026). e o Projeto do Fundo Especial para Pesquisa Médica Clínica da Associação Médica de Zhejiang (2021ZYC-A11).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Banco de Dados CellMarker | Universidade Médica de Harbin (CellMarker 2.0) | http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/ | Banco de Dados CellMarker; Para consulta de genes marcadores de tecido/tipo celular durante anotação de célula única |
| Banco de Dados Comparativo de Toxicogenômica (CTD) | CTD (Universidade Duke et al.) | http://ctdbase.org/ | Banco de Dados CTD; Para recuperar interações entre substâncias químicas, genes, fenótipos e doenças, usada para previsão de medicamentos |
| Conjunto de dados pQTL de plasma deCODE (2021, 4.907 aptamers, 35.559 amostras europeias) | Genética deCODE | https://www.decode.com/summarydata/ | Lançamento de dados pQTL de 2021; Usado como dados de exposição pQTL para análise de ressonância magnética |
| eQTLGen Whole Blood eQTL Data | Consórcio eQTLGen | https://www.eqtlgen.org/ | eQTLGen fase I/II (versão específica conforme uso); Usado como dados de exposição eQTL para ressonância magnética e análise de colocalização |
| Conjunto de dados GEO de RNA-seq de célula única GSE161470 (Tecido Cardíaco Humano: 4 amostras controle + 1 amostra patológica) | Omnibus de Expressão Gênica do NCBI (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161470 | GSE161470; Obter dados de sequenciamento de RNA de célula única do tecido cardíaco humano para análise a jusante |
| Catálogo GWAS | NHGRI– EBI | https://www.ebi.ac.uk/gwas/ | Catálogo GSA; Recuperar informações, anotações e análises auxiliares de GWAS relacionadas à HF |
| Estatísticas Resumidas GWAS (GCST90162626) de Insuficiência Cardíaca | NHGRI– Catálogo EBI GWAS | https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90162626 | Ingresso nos estudos: GCST90162626; Usado como dados de desfecho para RM e análise de colocalização |
| Banco de Dados de Assinaturas Moleculares (MSigDB) v7.0 | Instituto Broad | https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb | MSigDB v7.0; Para conjuntos de genes de fundo GSEA / GSVA e anotações de vias |
| Dados de Estrutura do ácido pirínixo (WY-14643) (PubChem) | NCBI PubChem | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5694 | PubChem CID: 5694; Usado para obter estrutura 3D de ligantes para acoplamento molecular e simulação dinâmica |
| Banco de Dados de Proteínas UniProt (DBNL, UniProt ID: Q9UJU6) | Consórcio UniProt | https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UJU6 | UniProt: Q9UJU6; Usado para obter a sequência de aminoácidos do DBNL para previsão estrutural e acoplamento |
| Meta-análise mQTL de sangue total (Ref 11, 3.701 amostras europeias, 426.636 características mQTL) | Autores / Consórcio (de acordo com sua referência 11) | Autor pendente para adicionar URL original do banco de dados / DOI | DOI de referência ou ID de conjunto de dados; Usado como dados de exposição mQTL para análise de ressonância magnética |
Referências
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