Efeitos anti-inflamatórios das lactonas sesquiterpenas do Eupatorium lindleyanum DC. em Modelos de Roedores

Resumo

Este estudo demonstra que lactonas sesquiterpenas provenientes de Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) exercem efeitos anti-inflamatórios significativos em edema de orelha de camundongos induzido por xileno e edema de pata de rato induzido por carragenina, aliviando danos histopatológicos, reduzindo a liberação de citocinas e inibindo a ativação da sinalização de NF-κB.

Resumo

A inflamação aguda é um processo patológico fundamental envolvido em muitas doenças relacionadas ao sistema imunológico. Eupatorium lindleyanum DC., uma erva medicinal tradicional, é rica em lactonas sesquiterpenas (SLEL), que foram relatadas como apresentando atividade farmacológica; no entanto, seus efeitos anti-inflamatórios e as alterações moleculares associadas permanecem incompletamente caracterizados. Neste estudo, respostas inflamatórias agudas foram induzidas em um modelo de edema de orelha de camundongos induzido por xileno e em um modelo de edema de pata de rato induzido por carragenina. Lesão tecidular e infiltração inflamatória foram avaliadas por coloração por hematoxilina e eosina. Os níveis de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6 e IL-1β) foram quantificados no soro pelo ELISA, e sua expressão transcricional em tecidos inflamados foi analisada por PCR quantitativa (qPCR). Alterações nas proteínas associadas à via NF-κB, incluindo IκBα fosforilada e p65, foram avaliadas por western bloting. O tratamento com SLEL reduziu o edema de ouvido e patas e aliviou características histopatológicas da inflamação aguda, incluindo edema tecidual, infiltração de células inflamatórias e congestão vascular. Paralelamente, a administração de SLEL esteve associada à diminuição dos níveis séricos e à expressão de mRNA tecidular de Tnf-α, Il-6 e Il-1β. A análise por Western blot demonstrou redução na fosforilação de IκBα e p65 em tecidos inflamados após o tratamento com SLEL, indicando modulação dos eventos de sinalização relacionados ao NF-κB. Juntas, essas descobertas demonstram um fluxo experimental de trabalho para avaliar a atividade anti-inflamatória do SLEL em modelos de inflamação aguda e sugerem que seus efeitos estão associados à redução da expressão de citocinas pró-inflamatórias e à alteração da sinalização relacionada à via NF-κB.

Introdução

A inflamação é uma resposta defensiva complexa desencadeada por invasão patogênica ou lesão tecidular e desempenha um papel crítico na limitação da infecção, eliminação de estímulos nocivos e promoção da reparação^tecidual. Embora as respostas inflamatórias controladas sejam essenciais para manter a homeostase tecidual, inflamação excessiva ou persistente pode levar a danos tecidos, disfunção dos órgãos e progressão de doenças crônicas. Clinicamente, a inflamação é caracterizada por vermelhidão, inchaço, calor e dor, e em casos graves pode resultar em respostas patológicas sistêmicas. Evidências crescentes associam a inflamação desregulada ao desenvolvimento de câncer, doenças cardiovasculares e distúrbios autoimunes²˒³.

Os anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) são atualmente os agentes mais utilizados para o controle da inflamação. Apesar de sua eficácia no alívio dos sintomas, o uso prolongado de AINEs está frequentemente associado a efeitos adversos, incluindo irritação gastrointestinal, reações de hipersensibilidade e^{hepatotoxicidade 4}, que limitam sua aplicabilidade clínica. Como resultado, há um interesse crescente em identificar agentes anti-inflamatórios alternativos com perfis de segurança aprimorados. Produtos naturais, incluindo remédios tradicionais à base de plantas, têm sido explorados como fontes potenciais de compostos bioativos com propriedades imunomoduladoras. No entanto, alegações generalizadas sobre baixa toxicidade ou funções regulatórias sistêmicas devem ser interpretadas com cautela e exigem validação experimental em modelos definidos^{de doença 5}.

Eupatorium lindleyanum DC. é uma planta medicinal tradicional cujos fitoquímicos característicos incluem lactonas sesquiterpenas, principalmente compostos do tipo guaianólito e eudesmanolide, juntamente com germacranólitos e^{xantanólidos 6}. Extratos de Eupatorium lindleyanum DC. foi relatado que apresentam atividades de redução de lipídios, antiateroscleróticas, antitumorais e anti-inflamatórias em diversos ambientes^{experimentais 6}. Em particular, extratos de etanol de Eupatorium lindleyanum DC. apresentaram efeitos protetores em modelos de lesão pulmonar aguda induzida por lipopolissacarídeos (^{LPS) 7}. No entanto, a atividade anti-inflamatória do SLEL e seus efeitos em modelos clássicos de inflamação aguda permanecem insuficientemente caracterizados.

Para suprir essa lacuna, empregamos dois modelos complementares de inflamação aguda: edema auricular induzido por xileno em camundongos, que captura respostas inflamatórias neurogênicas e vasculares rápidas, e edema das patas induzido pela carragena em ratos, um modelo bem estabelecido que reflete inflamação aguda dependente do tempo envolvendo produção de citocinas e infiltração celular. Modelos alternativos, como a inflamação sistêmica induzida por LPS, não foram selecionados devido à ênfase na ativação imunitária sistêmica em vez do edema tecidular localizado e à sua adequação limitada para análises histológicas e moleculares em nível de tecido^{pareado 8}.

Utilizando essa estratégia combinada, as respostas inflamatórias foram avaliadas por meio de medições quantitativas de edema, avaliação histopatológica por coloração de hematoxilina e eosina (H&E), perfil de citocinas séricas, análise transcricional em nível de tecido e alterações proteicas associadas à NF-κB. Esse protocolo é particularmente adequado para a triagem da atividade anti-inflamatória em inflamação aguda, onde formação de edema, expressão de citocinas e leituras moleculares associadas às vias são de interesse. No entanto, as limitações dos modelos agudos devem ser reconhecidas, incluindo a extrapolação restrita para condições inflamatórias crônicas e limites interpretativos ao inferir causalidade a partir de alterações de sinalização em nível tecidular.

Coletivamente, este estudo destaca uma abordagem orientada por protocolos que integra modelos complementares de inflamação aguda com análises histológicas e moleculares paradas, fornecendo uma estrutura reprodutível para avaliar o potencial anti-inflamatório de compostos derivados de fitoteráceas.

Protocolo

O protocolo de estudo animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Universidade Médica de Chongqing (IACUC-CQMU-2025-10073).

Preparação de fração enriquecida com lactona sesquiterpeno (SLEL)

Materiais medicinais secos de Eupatorium lindleyanum DC. foram pulverizados e submetidos à extração por refluxo 2x com etanol de 70% (v/v) sob pressão reduzida. Cada extração foi realizada com uma relação solvente-material de 10:1 (v/w) durante 2 horas. Os extratos combinados eram filtrados, concentrados sob pressão reduzida a ≤60 °C e, posteriormente, liofilizados a vácuo para obter o pó de extrato de etanol bruto.

O extrato seco foi totalmente dissolvido em água destilada (concentração final: 100 mg/mL) e submetido sequencialmente a cromatografia em resina de poliamida, seguida pela cromatografia de resina por adsorção macroporosa D101 para enriquecer lactonas sesquiterpenas. Após o equilíbrio de adsorção, a resina D101 era lavada com água destilada para remover impurezas polares e então eluída com etanol anidro. Após a elução do etanol, a fração coletada era concentrada sob pressão reduzida e submetida à liofilização para produzir a fração SLEL, que era armazenada a −20 °C até o uso.

A separação foi alcançada em uma plataforma UPLC que emprega um sistema binário de fase móvel de acetonitrila e 0,1% (v/v) de ácido fórmico em água. O programa de gradiente compreendia uma pausa isocrática inicial de 25 minutos com baixo conteúdo orgânico, uma rampa linear curta para 70% acetonitrila, uma fase de alto escalão orgânico a 90% acetonitrila e uma etapa final de equilíbrio retornando às condições iniciais. O sistema operava a 0,25 mL·min⁻¹ com temperatura de coluna de 35 °C e volume de injeção de 0,1 μL (Figura Suplementar S1).

Animais

Um total de 36 ratos machos de Sprague–Dawley (200 ± 20 g) e 36 ratos BALB/c machos (20 ± 2 g) foram usados neste estudo. Os animais eram alojados em condições padronizadas (22 ± 2 °C, 55 ± 5% de umidade, 12 horas de ciclo claro/escuro) com livre acesso a alimento e água. Os animais foram aclimatados por 7 dias antes da experimentação e monitorados diariamente quanto à saúde geral. Todos os procedimentos foram realizados para minimizar o sofrimento animal, e a anestesia foi aplicada antes da coleta de sangue e coleta de tecidos.

Edema auricular induzido por xileno em camundongos

O modelo de edema da orelha do camundongo foi estabelecido conforme descrito^{anteriormente 9}. Após a aclimatação, os camundongos foram aleatoriamente divididos em seis grupos (n = 6 por grupo): controle (CG), modelo (MG), dexametasona (DEX, 10 mg/kg) e SLEL em baixa dose (75 mg/kg), média (150 mg/kg) e alta dose (300 mg/kg). Todos os tratamentos foram administrados por gavage oral uma vez ao dia por 7 dias consecutivos (volume final de dosagem: 10 mL/kg). Em 1,5 h após a administração final, a inflamação foi induzida aplicando 30 μL de xileno de forma uniforme em ambas as superfícies do ouvido direito, exceto no grupo controle. Trinta minutos depois, os camundongos foram anestesiados, amostras de sangue coletadas e punções circulares de 8 mm nas orelhas foram obtidas a partir de posições anatômicas idênticas de ambas as orelhas.

Edema das patas induzido por carrageniana em ratos

O modelo de edema da pata de rato foi estabelecido usando carragenina, conforme descrito^{anteriormente 10}. Os ratos foram aleatoriamente distribuídos em seis grupos (n = 6 por grupo): CG, MG, DEX (5 mg/kg) e SLEL de baixa dose (50 mg/kg), média dose (100 mg/kg) e alta dose (200 mg/kg). Os tratamentos foram administrados por via oral uma vez ao dia durante 7 dias (10 mL/kg). Os volumes basais das patas foram medidos antes da dosagem final. Trinta minutos após a última administração, 0,1 mL de solução de carragenina a 1% (p/v) foram injetados subcutâneamente na superfície plantar da pata traseira direita. Os volumes das patas foram medidos em 1, 2, 3 e 4 horas após a injeção usando um pletismômetro. O edema das patas foi calculado como:

Edema das patas (%) = (Vt − V0) / V0 × 100%

Exame histológico

Os tecidos do ouvido e das patas foram coletados imediatamente após as avaliações funcionais. Os tecidos foram fixados em formalina tamponada com 10% de neutro por 72 horas em temperatura ambiente, embutidos em parafina, seccionados (5 μm) e corados com H&E conforme os protocolos^{padrão 11}.

Ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA)

As amostras de soro foram obtidas por centrifugação a 3.000 × g por 10 minutos a 4 °C. Os níveis de TNF-α, IL-6 e IL-1β foram quantificados usando kits ELISA comercialmente disponíveis, de acordo com protocolos padrão.

Análise do Western blot

Extratos totais de proteína foram preparados a partir de tecidos de ouvido e patas usando o tampão de lise RIPA suplementado com inibidores de protease e fosfatase. As concentrações de proteína foram quantificadas usando um ensaio de BCA, e quantidades iguais de proteína (30 μg por amostra) foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidas para as membranas do PVDF. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% por 1 hora em temperatura ambiente, seguidas por incubação com anticorpos primários a 4 °C durante a noite e anticorpos secundários conjugados com HRP por 1 hora em temperatura ambiente. Bandas imunorreativas foram detectadas usando quimioluminescência aprimorada e quantificadas com o software ImageJ.

PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)

O RNA total foi isolado dos tecidos do ouvido e das patas usando o reagente de extração de RNA listado na Tabela de Materiais. Um micrograma de RNA total foi transcrito reversamente em cDNA usando um kit comercial de transcrição reversa, conforme as instruções do fabricante. A PCR quantitativa foi realizada usando química verde SYBR com primers específicos de genes (Tabela 1) em um volume de reação de 10 μL sob um protocolo de amplificação em duas etapas. Condições detalhadas de transcrição reversa e parâmetros de ciclo de PCR são fornecidos na seção de Protocolo. Os níveis relativos dos transcritos foram calculados usando o método 2^⁻ΔΔCT , com o Gapdh usado como gene de referência interno.

Análise de dados e estatística

Os dados são expressos como média ± SD. Comparações estatísticas entre dois grupos foram realizadas usando o teste t de Student não pareado, enquanto ANOVA unidirecional foi aplicada para análises envolvendo mais de dois grupos. A significância estatística foi definida como p < 0,05. A significância é indicada como # p < 0,05 e ## p < 0,01 em comparação com o grupo controle (CG), e * p < 0,05 e ** p < 0,01 em relação ao grupo modelo (MG).

Resultados

Composição química em SLEL até UPLC-Q/TOF/MSn

O perfil químico do SLEL foi examinado usando UPLC-Q/TOF-MSn em modos de íons positivos e negativos. Nove lactonas sesquiterpenas foram identificadas como constituintes predominantes (Figura Suplementar S1). As atribuições de fórmulas moleculares foram derivadas de íons adutos observados, incluindo [M+H]⁺ e [M+Na]⁺ em modo positivo, assim como [M−H]⁻ e [M+HCOO]⁻ em modo negativo (Tabela Suplementar S1

Discussão

Neste estudo, lactonas sesquiterpenas de Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) foram avaliados usando dois modelos de inflamação aguda estabelecidos, a saber: edema auricular induzido por xileno em camundongos e edema das patas induzido por carragenina em ratos. Ao incorporar pontuação histopatológica, medições de citocinas séricas, quantificação de mRNA em nível de tecido e leituras de sinalização em nível de proteína, esse protocolo fornece uma caracterização em múltiplas camadas ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anti-GAPDH	ImmunoWay	YN5585
anti Iκ Bα	Tecnologia de Sinalização Celular	4812
anti P65	Abmart	TA5006
anti-p-Iκ Bα	Tecnologia de Sinalização Celular	2859
anti-p-P65	Abmart	TP70621
BCA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P10010
IL-1 e beta; Uniforme	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20537r
Kit IL-6	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20746r
Micropipeta	Eppendorf
Leitor de microplacas	Gene Co., Ltd	Odyssey Fc
PVDF	Millipore	IPVH00010
Kit de transcrição reversa	MedChemExpress	HY-K051A
Buffer RIPA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0013B
SYBR Green Mastermix	MedChemExpress	HY-K0522
TNF-&alfa; Uniforme	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20039r
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596018CN
Freezer de ultra baixa temperatura	SANYO