Method Article

Um Protocolo de Microscopia de Localização de Molécula Única Multirótulo para Investigação da Cromatina em Ambiente Nuclear Denso

DOI:

10.3791/69868

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June 5th, 2026

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1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um protocolo de microscopia de localização de molécula única em três cores (SMLM) que permite o mapeamento reprodutível de eucromatina, heterocromatina e RNAP II para análise espacial. Esse protocolo permite a marcação eficiente de multicor em ambientes nucleares densos, incluindo alvos associados à cromatina, possibilitando detecção simultânea e confiável.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia de superresolução avançou dramaticamente nossa capacidade de interrogar estruturas biológicas além do limite de difração, tornando-a indispensável para estudar estruturas nucleares densamente compactadas, como cromatina, lâminas nucleares e corpos nucleares como nucleolos. A cromatina apresenta organização em múltiplas escalas — desde nucleossomos de tamanho nanométrico até domínios em escala microna — exigindo abordagens de imagem capazes de alta resolução e especificidade molecular. A microscopia de localização de molécula única (SMLM), especialmente a microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), permite o mapeamento preciso de marcas epigenéticas, oferecendo uma visão crítica sobre a estrutura e função da cromatina. No entanto, a imagem multi-marcador no ambiente nuclear apresenta desafios únicos, incluindo redução da acessibilidade de anticorpos, aumento da ligação inespecífica e instabilidade do fluoróforo. Para enfrentar essas questões, apresentamos um protocolo de imunomarcação sequencial otimizado para ambientes nucleares de alta densidade, permitindo SMLM robusto em três cores com diafonia mínima e menor degradação do sinal. Esse método inclui formulações tampão otimizadas, seleção de fluoróforos e estratégias de validação de anticorpos para garantir marcagem reprodutível e de alta fidelidade entre múltiplos alvos. Importante, integramos esse protocolo com uma pipeline de análise computacional que utiliza localizações de um alvo molecular como âncoras espaciais (pontos semente) para quantificar distâncias entre alvos, densidades locais e coafinidade entre rótulos. Isso permite uma análise espacial detalhada dos componentes da cromatina na escala nanométrica. Esse protocolo serve como uma estrutura reprodutível para imagens multicomponentes e análise quantitativa em ambientes subcelulares densos, oferecendo uma ferramenta poderosa para pesquisadores que investigam arquiteturas nucleares complexas como a cromatina.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O advento da microscopia de localização de molécula única (SMLM) possibilitou uma exploração sem precedentes de estruturas biológicas na escalananométrica 1,2,3,4,5. Além da imagem de alvo único, a extensão para o SMLM multicolor avançou ainda mais o campo ao permitir a visualização simultânea de múltiplas espécies moleculares, bem como as relações espaciais e temporais entre estruturas desubdifração 6,7,8,9,10,11 . No entanto, aplicar SMLM multiplexado a modificações de histonas abundantemente distribuídas continua sendo desafiador devido à natureza densa e polimérica do DNA nuclear e à limitada acessibilidade de anticorpos nesseambiente 12,13,14,15,16,17,18.

A cromatina apresenta uma organização hierárquica e multiescala, abrangendo várias ordens de magnitude em comprimento, desde conjuntos de nucleossomos em escala nanométrica até arquitetura nuclear em escala micrométrica. Nas maiores escalas, os cromossomos ocupam territórios cromossômicos distintos, dentro dos quais o genoma é ainda mais dividido em compartimentos A/B e domínios topologicamente associados (TADs) que restringem interações regulatórias de longo alcance por meio de mecanismos como a extrusão em loop 19,20,21,22. Em escalas abaixo de 200 nm, a cromatina é organizada como um polímero desordenado composto por domínios de empacotamento heterogêneos (PDs), em vez de blocos discretos de eucromatina e heterocromatina, com regiões transcricionalmente ativas preferencialmente localizadas nas fronteiras de PD 23,24,25,26,27,28,29. Nas menores escalas (5-20 nm), a cromatina consiste em conjuntos e embreduras nucleossômicas irregulares, ressaltando a ausência de um motivo uniforme de dobramento de ordem superior e enfatizando a natureza emergente e dependente da escala da organizaçãogenômica 24,26,30. Com o rápido avanço de abordagens baseadas em sequenciamento, como o sequenciamento por imunoprecipitação por cromatina e a captura de conformação de cromatina de altorendimento 19,30,31,32,33, várias características das estruturas organizacionais em mesoescala da cromatina foram identificadas 31,32. No entanto, essas técnicas, ao contrário da imagem, não capturam geometria espacial que só é observada após a resolução dessas estruturas. Métodos de microscopia eletrônica como a microscopia eletrônica de cromatina (ChromEM24) e a microscopia eletrônica de varredura de cromatina por transmissão (ChromSTEM25) revelaram que a cromatina é heterogênea e organizada em domínios de empacotamento em escalas de comprimento de 50-200 nm, 25, 28, 29. Embora essas técnicas permitam uma resolução impressionante para identificar domínios de empacotamento da cromatina, elas não podem fornecer o mapeamento molecularmente específico que o SMLM oferece. O acúmulo de pontos de DNA para imagem em topografia nanoescala (DNA-PAINT22) e hibridização in situ multiplexada por fluorescência (FISH)19permite alta multiplexação; no entanto, o DNA-PAINT é fortemente afetado por ruído de fundo elevado decorrente de eventos aleatórios de ligação no ambiente nuclear rico emoligonucleotídeos 12,34, enquanto métodos tradicionais baseados em desnaturalização térmica FISH requerem dobramento nativo de cromatina perturbado. Estudos anteriores aplicaram técnicas de imagem de super resolução para investigar a cromatina nessa escala de comprimento e identificaram uma composição híbrida de domínios de empacotamento, em oposição aos modelos anteriores de separaçãode fases 12,23,34,35. Esse protocolo deriva de um artigo publicado anteriormente que discute a importância biológica dessasdescobertas 34. Assim, dadas suas altas capacidades de resolução e multiplexação, o dSTORM baseado em imunocoloração permanece a estratégia mais viável para a imagem de cromatina multicolorida sob condições quase nativas.

Esse protocolo não é o primeiro a demonstrar a marcação de mais de dois alvos nucleares, com estudos anteriores marcando complexos proteicos individuais ou genes12,36. Apesar do sucesso na rotulagem de modificações histonas pós-traducionales dos nucleossomos, a marcação, imagem e análise multicolorida do SMLM em cromatina apresentam desafios significativos. Primeiro, a imunocoloração no ambiente denso de cromatina requer otimização da concentração de anticorpos, sequência de incubação e composição do tampão para garantir penetração e ligação adequadas sem excesso de fundo. Segundo, é necessária uma análise abrangente de múltiplos marcadores, pois as interações entre eucromatina, heterocromatina e enzimas como RNA polimerase tendem a ir além das simples exclusões binárias. Até agora, o número máximo de cores demonstradas na imagem da cromatina dSTORM permanece em dois 18,37,38,39.

Aqui apresentamos um protocolo robusto para imagens e análise SMLM de cromatina em três cores. Nosso fluxo de trabalho de coloração otimiza o tempo de incubação de anticorpos e utiliza buffers de imagemaprimorados 40para sessões de imagem prolongadas para múltiplos marcadores. Descrevemos ainda pipelines computacionais para análise de distância de duas cores e análise de densidade de juntas em três cores, permitindo a caracterização quantitativa das relações entre heterocromatina, eucromatina e máquinas de transcrição. Em contraste com estudos anteriores com cromatina bicolor SMLM, que sugeriam uma separação entre heterocromatina e eucromatina, a imagem de cromatina tricolor revela que o genoma está organizado em domínios de empacotamento, com eucromatina e transcrição ativa localizadas na periferia dos núcleos constitutivos deheterocromatina 34.

Esse protocolo fornece à comunidade uma estrutura reprodutível para realizar SMLM de cromatina multicolorida e estabelece estratégias de análise adequadas para múltiplos alvos nucleares conjugados funcionalmente. Ao preencher lacunas metodológicas, permite a exploração sistemática da organização dos domínios da cromatina no nível supra-nucleossômico, complementando as abordagens de sequenciamento e microscopia eletrônica, preservando a arquitetura nuclear nativa. Este artigo é um protocolo estendido de um artigopublicado 34.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: A seção subsequente do protocolo será dividida no processo de coloração e no processo de aquisição descrito abaixo. Para tutoriais de análise de dados, consulte a publicaçãoassociada 34, que detalha a análise de múltiplos rótulos para modificações de histonas rotuladas.

1. Processo de tingimento:

NOTA: Ao longo do protocolo, há menção a pratos de 35 mm ou 8 placas bem compartimentadas. Esses são os vasos que nosso grupo usa para cultivo celular, porém métodos menores e mais eficientes são possíveis. Certifique-se, se materiais alternativos forem usados, que as concentrações recomendadas para anticorpos tampão sejam mantidas. Devido à natureza sequencial desse protocolo, a seleção de anticorpos é importante para o sucesso da marcação. Usamos raciocínio padrão para garantir que nossos anticorpos do hospedeiro para nossos alvos sejam diferentes, de modo que nossos anticorpos secundários possam atingir espécies distintas de hospedeiros, minimizando efetivamente os efeitos fora do alvo. A ordem de marcação é determinada com base na localização do alvo dentro do núcleo. Como estamos mirando nos domínios de empacotamento decromatina 25, 28, 34, 35 e entendemos que este é um processo impulsionado por difusão, sempre rotulamos primeiro os alvos heterocromáticos, seguidos pela eucromatina e, por fim, por RNAPII para minimizar a exclusão estérica em regiões heterocromáticas densas. A otimização dos buffers foi feita empiricamente durante o desenvolvimento do protocolo. Descobrimos que a inclusão de soro de cabra após o primeiro alvo foi útil para reduzir os efeitos fora do alvo nas etapas seguintes.

  1. Preparação do tampão
    1. Componentes do buffer:
      NOTA: Para mais informações sobre os componentes, incluindo tempos de armazenamento e preparação, consulte a Tabela de materiais. Recomendamos que o usuário tenha todas as soluções prontas antes de iniciar o protocolo para evitar erros experimentais. A solução de têmpera deve ser feita por último.
    2. Faça o buffer de bloqueio
    3. Pese a albumina sérica bovina (BSA) de modo que a concentração final no volume tampão necessário para o experimento seja de 3% e adicione a um tubo centrífuga. Incline o tubo para um ângulo de 45° para que os cristais de BSA fiquem espalhados dentro do tubo, depois adicione soro salino tamponado com fosfato (PBS). Isso é feito para evitar a formação de aglomerados de cristais que não se dissolvem.
    4. Deixe o tubo em temperatura ambiente até que todos os cristais estejam dissolvidos. Não agite tubo ou vórtice – isso causará a formação de bolhas, que atrairá proteínas para a superfície e impedirá que o BSA se dissolva completamente.
    5. Uma vez completamente dissolvido, adicione o Triton X-100 de modo que sua concentração final seja 0,2% (v/v) dado o volume escolhido no passo 1.3. Se os cristais não estiverem completamente dissolvidos, pipete várias vezes para misturar a solução lentamente sem formar bolhas.
      NOTA: Se for feito um tampão modificado, inclua o soro de cabra 10% nesse processo. No entanto, os tampões de bloqueio modificados devem ser feitos frescos durante o uso e não armazenados por longos períodos, mas garantam que as concentrações finais sejam as mesmas indicadas na Tabela de materiais - 3% BSA, 0,2% Triton X-100.
    6. Faça a lavagem um amortecedor:
      Repita os passos para bloquear o buffer na 1.1.2, mas use as concentrações listadas na seção de materiais e aqui para sua conveniência (0,2% BSA, 0,1% Triton X-100 em 1X -DPBS, e para modificações inclua 1% soro de cabra)
    7. Prepare uma solução fixadora:
      1. Adicione PBS a um tubo centrífuga.
      2. Adicione a quantidade apropriada de 16% de paraformaldeído ao tubo da centrífuga para uma concentração final de 4%.
        NOTA: Prepare fresco e pronto ao retirar as células da incubadora. Embora a solução fixativa atual normalmente não utilize glutaraldeído, ela pode ser incluída e pode ser útil devido à fixação mais robusta e à fixação mais duradoura em comparação com o paraformaldeído. O sistema para dSTORM não possui capacidades para sinais de vida útil de fluorescência provenientes de glutaraldeído (GA), porém usuários que possuem essa capacidade podem achar útil isso para se diferenciar das estruturas marcadas com fluoróforo.
    8. Faça solução de têmpera:
      1. Pese o borohidreto de sódio no papel de pesagem.
      2. Prepare o tubo da centrífuga.
      3. Adicione borohidreto de sódio ao tubo.
      4. Adicione PBS ao tubo.
        NOTA: A solução deve ter bolhas após adicionar o PBS.
    9. Transforme a imagem em buffer:
      1. Dissolva 1,4-Diazabiciclooctano (DABCO) em RNASE desionizada, água livre de DNASE, para produzir uma solução de DABCO de 13 mL com concentração de 1 M.
      2. Adicione 12 M HCl (~240 μL) até que o DABCO esteja completamente dissolvido e o pH atinja 8,0.
      3. Prepare 1 M de sulfito de sódio dissolvendo em 10X PBS. O DTT não precisa de preparação.
      4. Para a preparação final, utilize estoques prévios para produzir 65 mM DABCO com 30 mM de sulfito de sódio e 30 mM de DTT (1 M de estoque) em água desionizada.
      5. Ajuste o pH por meio da titulação com HCl e NaOH até que o pH esteja em 8,0. Armazene coberto e selado com Parafilm a 4° C no máximo 2 meses. Monitore o pH durante todo o uso.
  2. Detalhes do processo de tingimento da primeira etiqueta:
    1. Fixação:
      1. Pegue células vivas da incubadora e retire o meio de cultura celular do prato. Descarte o meio de cultura celular em um recipiente de resíduos de risco biológico.
      2. Adicione PBS suficiente para cobrir as células (1 mL para uma antena de 35 mm e 500 μL para uma lâmina de vidro de câmara).
      3. Gire o prato suavemente para lavar as células com PBS e depois retire o PBS do recipiente. Descarte o PBS em um recipiente de resíduos de risco biológico.
      4. Adicione solução fixadora suficiente para cobrir as células (1 mL para um prato de 35 mm e 500 μL para uma lâmina de vidro de câmara), depois deixe as células fixarem por 10 minutos.
      5. Enquanto as células estão sendo fixadas, pese o borohidreto de sódio para a solução de têmpera e adicione-o a um tubo centrífuga.
      6. Remova a solução fixadora do prato e descarte-a no recipiente de resíduos químicos líquidos devidamente rotulados.
    2. Extinção
      1. Adicione PBS suficiente ao prato para cobrir a superfície (1 mL para um prato de 35 mm e 500 μL para um lâmina de vidro de câmara), depois coloque o prato sobre um cotelêter (qualquer shaker padrão serve) por 5 minutos para lavar as células.
      2. Retire o prato do shaker, retire o PBS e descarte-o no recipiente de resíduos químicos líquidos devidamente rotulados.
      3. Adicione solução de têmpera suficiente (250 μL, recipiente de 8 poços) ao prato para cobrir a superfície (1 mL para um prato de 35 mm e 500 μL para uma lâmina de vidro de câmara), depois coloque o prato sobre um shaker por 7 minutos para temperar a autofluorescência nas células.
      4. Enquanto as células estão no shaker, descarte a solução de têmpera restante no tubo da centrífuga no recipiente de resíduos químicos líquidos devidamente rotulados.
      5. Retire o prato do shaker, retire a solução de têmpera e descarte-o no recipiente de resíduos químicos líquidos devidamente rotulados.
      6. Adicione PBS suficiente (250 μL, prato de 8 poços) à placa para cobrir a superfície (1 mL para uma antena de 35 mm e 500 μL para uma lâmina de vidro de câmara), depois coloque a taça sobre um coteleiro por 5 minutos para lavar as células.
      7. Retire o prato do shaker, retire o PBS e descarte-o no recipiente de resíduos químicos líquidos devidamente rotulados.
      8. Repita os passos 1.2.2.6 e 1.2.2.7 mais duas vezes (totalizando 3 lavagens PBS).
    3. Bloqueio
      1. Adicione buffer de bloqueio suficiente ao prato para cobrir a superfície (250 μL, antena de 8 poços, 1 mL para um prato de 35 mm e 500 μL para um lâmina de vidro de câmara).
      2. Coloque o prato em um shaker por pelo menos 1 hora para permeabilizar as membranas celulares e bloquear os locais de ligação (ocupar os locais não especificados, para que não interfiram nos sítios alvo). (Embora tenhamos testado várias vezes para determinar a duração mínima bem-sucedida do bloqueio como 20 minutos, recomendamos fortemente bloquear por pelo menos 1 hora ou mais até a noite fora. Otimização pode ser necessária, dado o alvo e a linhagem celular.)
      3. Enquanto as células estão no shaker, prepare a solução primária de coloração por anticorpos (veja concentração recomendada no site do fornecedor ou consulte a tabela na seção de materiais).
      4. Para determinar o volume total das soluções de coloração a serem produzidas, adicione 0,5 mL ao volume necessário para cobrir as células (ex., para um prato de 35 mm, prepare uma solução de 1,5 mL).
      5. Remova o volume determinado na seção 1.2.3.1 do material tampão bloqueante e adicione esse volume a um novo tubo centrífuga para preparar a solução de coloração.
      6. Adicione um volume apropriado de estoque primário de anticorpos ao tampão de bloqueio para obter a concentração final correta. Os volumes primários de estoque de anticorpos para vários anticorpos frequentemente usados podem ser encontrados na seção de materiais.
      7. Retire o prato do shaker, remova o buffer bloqueador e descarte-o no recipiente de resíduos químicos líquidos devidamente rotulados.
    4. Coloração primária de anticorpos:
      1. Adicione solução primária suficiente de tingimento de anticorpos ao prato para cobrir a superfície (1 mL para um prato de 35 mm e 500 μL para uma lâmina de vidro de câmara), depois coloque o prato em um shaker por pelo menos 1-2 horas até durante a noite para marcar os alvos celulares.
      2. Retire o prato do shaker, remova a solução primária de mancha de anticorpos e descarte-a no recipiente de resíduos químicos líquidos devidamente rotulados.
      3. Adicione buffer suficiente para lavar a panela para cobrir a superfície (1 mL para uma placa de 35 mm e 500 μL para uma lâmina de vidro de câmara), depois coloque a taça sobre um shaker por 5 minutos para lavar as células.
      4. Retire o prato do shaker, remova o buffer de lavagem e descarte-o no recipiente de resíduos químicos líquidos devidamente rotulados.
      5. Repita os passos 1.2.4.3 e 1.2.4.4 mais duas vezes (totalizando 3 lavagens de lavagem do buffer).
      6. Enquanto as células estiverem no shaker durante a última lavagem, prepare uma solução secundária de coloração por anticorpos (veja a concentração recomendada no site do fornecedor ou consulte experimentos anteriores).
      7. Para determinar o volume total das soluções de coloração a serem produzidas, adicione 0,5 mL ao volume necessário para cobrir as células (ex., para um prato de 35 mm, prepare uma solução de 1,5 mL).
      8. Remova o volume determinado na seção 1.2.4.7 do buffer de bloqueio e adicione esse volume a um novo tubo centrífuga para preparar a solução de coloração.
      9. Adicione um volume apropriado de estoque de anticorpos secundários ao tampão de bloqueio para obter a concentração final correta. Volumes de estoque secundário de anticorpos para vários anticorpos frequentemente usados podem ser encontrados na tabela de materiais.
      10. Enrole o tubo da centrífuga com a solução secundária de anticorpos com papel alumínio até estar pronto para adicionar às células do prato.
    5. Coloração secundária por anticorpos:
      1. Adicione solução secundária suficiente para tingir anticorpos na placa para cobrir a superfície (1 mL para uma antena de 35 mm e 500 μL para uma lâmina de vidro de câmara), depois coloque a antena sobre um shaker por pelo menos 40 minutos para adicionar fluoróforos aos alvos celulares marcados.
      2. Certifique-se de que o prato esteja coberto com papel alumínio para evitar o branqueamento por fluoróforo.
      3. Retire o prato do shaker, remova a solução secundária de anticorpos e descarte-a no recipiente de resíduos químicos líquidos devidamente rotulados.
      4. Adicione PBS suficiente à placa para cobrir a superfície (1 mL para uma taça de 35 mm e 500 μL para uma lâmina de vidro de câmara), depois coloque a taça em um shaker por 5 minutos para lavar as células.
      5. Retire o prato do shaker, retire o PBS e descarte-o no recipiente de resíduos químicos líquidos devidamente rotulados.
      6. Repita as seções 1.2.5.4 e 1.2.5.5 mais uma vez (totalizando 2 lavagens PBS).
      7. As células agora podem ser visualizadas ou armazenadas para imagem posterior. Se fizer a imagem imediatamente, siga os passos na seção de Aquisição. Se for armazenado para imagem posterior, continue seguindo os passos abaixo.
      8. Adicione PBS suficiente ao prato para cobrir a superfície (1 mL para um prato de 35 mm e 500 μL para uma lâmina de vidro de câmara) antes de armazenar.
      9. Envolva o prato com parafilme, depois com papel alumínio para evitar tanto a evaporação do líquido quanto o branqueamento por fluoróforo.
      10. Armazene a travessa embrulhada a 4°C até estar pronta para a imagem.
        NOTA: Para os rótulos usados neste protocolo, os pratos podem ser armazenados por 2-3 dias antes que a qualidade da imagem seja significativamente impactada; no entanto, diferentes anticorpos podem ter estabilidades variadas, mas, com armazenamento adequado, permanecem estáveis por algum tempo após a conclusão do protocolo. O armazenamento de um prato rotulado por mais de uma semana não é recomendado, pois a solução fixadora não está concentrada o suficiente para estabilidade a longo prazo.
  3. Processo subsequente de tingimento da etiqueta:
    1. Bloqueio:
      1. Consulte 1.2.3.1 - 1.2.3.2, mas use o buffer bloqueador com soro de cabra. O tempo de incubação para bloqueio pode ser tão curto quanto 1 hora, mas recomendamos tempos mais longos com um limite superior de uma noite (18-24 horas) para esses marcadores subsequentes, a fim de reduzir a ligação fora do alvo. Por favor, consulte experimentos anteriores.
      2. Enquanto isso, prepare soluções primárias de anticorpos, em vez de tampão bloqueante, em tampão bloqueador com soro de cabra.
    2. Coloração primária de anticorpos:
      1. Prepare o buffer bloqueador modificado e o buffer de lavagem com soro para cabra e o buffer de lavagem com soro para cabra, conforme detalhado na seção de preparação do buffer.
      2. Consulte as seções de etapas 1.2.3-1.2.4 (Bloqueio e coloração primária de anticorpos) usando os tampões modificados de bloqueio e lavagem:
        NOTA: O tempo de incubação do anticorpo primário pode ser tão curto quanto 1 hora, e até durante a noite (8-24 horas). Embora o melhor desempenho de rotulagem tenha sido alcançado com tempos de incubação mais longos, especialmente para múltiplas etiquetas. Os dados deste protocolo foram preparados com etapas de incubação durante a noite.
      3. Pouco antes do tempo de incubação terminar, prepare soluções secundárias de anticorpos no buffer de bloqueio modificado 1.1.3.
    3. Coloração secundária por anticorpos:
      1. Consulte a seção 1.2.5 (Coloração secundária de anticorpos), mas use um tampão bloqueador com soro de cabra.
        NOTA: Por favor, note que o tempo de incubação pode ser tão curto quanto 1 hora, mas já testamos tempos mais longos (2-4 horas) com desempenho semelhante. Para os próximos nomes, repita a seção 1.3.

2. Processo de aquisição

NOTA: Para aquisição de dados, utilize o software Nikon Imaging Software (NIS) Elements compatível com o microscópio utilizado. Qualquer software que controle filtro, caminho de luz e configurações da câmera é adequado para esse protocolo. O seguinte protocolo de imagem é adaptado para iluminação por Fluorescência Interna Total (TIRF) da amostra; no entanto, o protocolo de rotulagem é compatível com múltiplas formas de imagem. Imagens não-TIRF são possíveis com esse protocolo de rotulagem para STORM e são necessárias para aplicações 3D STORM. Por favor, utilize um protocolo padrão para metodologias alternativas de imagem.

  1. Processo subsequente de tingimento da etiqueta:
    1. Ligue os componentes ópticos necessários e estabeleça conexão com o software adequado. Na maioria dos casos, como no NIS, o software não inicializa completamente a menos que o computador consiga se comunicar adequadamente com o microscópio, a câmera e o controle do palco.
    2. Abra o Software NIS (ou equivalente).
    3. Configurar a visualização ao vivo: Ative a visualização ao vivo >alterne, mantenha a escala automática > nas configurações da câmera, ajuste o tempo de exposição para 30 ms.
    4. Configure o caminho dos dados para aquisições.
    5. Navegar até o painel superior Adquirir> Quick Time Lapse> Caminho
    6. Selecione o nome do arquivo correto para a primeira aquisição e defina o número de quadros para 10.000.
      NOTA: Essas medidas são tomadas para limitar o tempo em que a amostra é exposta à fonte de luz após o início da imagem.
    7. Certifique-se de que o ângulo crítico e o ângulo zero do TIRF estejam pré-definidos antes da aquisição. Por favor, consulte fontes online sobre tutoriais sobre como fazer isso. Como mencionado antes, se você não usar iluminação TIRF, essa etapa pode ser pulada.
    8. Selecione o caminho de luz adequado para a câmera e desative a opção de Iluminação Epi , em Lâmpadas (em NIS ou software equivalente) para garantir que o espelho esteja configurado para iluminação de campo amplo a partir de fontes de luz padrão que não sejam laser.
  2. Preparação de exemplo:
    1. Recolha amostras e adicione um tampão de imagem (formulação descrita na seção 1.1 Preparação do tampão) à amostra. (Dependendo do buffer de imagem utilizado, diferentes precauções podem ser necessárias. Proteja as amostras da luz.)
    2. Após adicionar óleo ao objetivo, coloque a amostra no palco com o suporte correto e ative o Foco Perfeito e, em seguida, foque na amostra.
  3. Etapas de imagem:
    1. Encontre um ponto laser e navegue até um ponto no prato/prato sem células.
    2. Alterne a iluminação do TIRF .
    3. Troque o filtro para corresponder ao filtro apropriado para passar a luz vermelha (ou qualquer laser usado para adquirir dados para essa amostra específica).
      NOTA: Use um filtro multi-entalhe, conforme descrito na tabela de materiais. Filtro multi-entalhe não é necessário, e os usuários podem alternativamente fazer imagens de cubos de filtro não distintos projetados para os fluoróforos usados na coloração.
    4. Ligue o laser na menor potência ~ 1 mW (isso depende da fonte de iluminação, mas é feito para evitar clareamento acidental) e ajuste o ângulo do espelho para o ângulo crítico.
    5. Se não houver células próximas, aumente a potência do laser até que o ponto do laser fique claramente visível na visualização ao vivo.
    6. Use a ferramenta Região de Interesse (ROI), desenhe, defina e salve o ROI onde o ponto laser está localizado.
      NOTA: Para amostras multi-rótulo, por favor, certifique-se de que os pontos de laser para todas as fontes de luz necessárias para a amostra estejam alinhados. Neste protocolo, usamos três lasers e garantimos que todos os pontos estejam alinhados. Isso é essencial, pois o co-registro de dados espaciais requer alinhamento a laser.
    7. Volte para iluminação Epi e o filtro de campo brilhante.
    8. Usando a ferramenta de definição de ROI, navegue para encontrar uma célula saudável apropriada (por exemplo, uma célula HCT116 apropriada deve ter formato aderente, poligonal ou oval com limite claro da célula).
    9. Centralize o ROI no núcleo e clique em OK para dar zoom na posição ROI (Execute usando iluminação em campo brilhante, pois a saúde da célula não pode ser determinada diretamente a partir de imagens fluorescentes de campo amplo do núcleo.
    10. Retorne à iluminação TIRF usando o mesmo método usado na 2.3.2.
    11. Selecione o filtro apropriado para o alvo rotulado com o maior comprimento de onda (na maioria dos casos, este é o vermelho muito longo, ou seja, alvo rotulado com Alexa Fluor 647). Normalmente, o comprimento de onda mais longo é selecionado primeiro para evitar o fotobranqueamento da amostra com comprimentos de onda mais curtos, caso alvos marcados possuam secundários que se sobrepõem a espectros.
    12. Com potência de laser BAIXA para cada laser necessário (no caso multi-rótulo, seriam 3 lasers), ligue o laser e ilumine o núcleo para garantir que a amostra esteja devidamente alinhada.
    13. Use os controles TIRF para garantir que a amostra seja iluminada com TIRF.
    14. Selecione a posição Z apropriada para aquisição conforme as necessidades. No entanto, isso pode ser ajustado logo antes da aquisição.
    15. Set exposure time based on needs of the fluorophores (use anywhere between 10‬-30 ms).
    16. Clique em Adquirir> Timelapse Rápido.
    17. Defina os quadros para ≥10.000 e clique em Aplicar para criar o arquivo no diretório especificado.
    18. Ligue a potência do laser para 50% e faça uma amostra de descolorimento fotográfico.
    19. O núcleo deve inicialmente branquear, mas logo depois (segundos depois) deve começar a piscar.
    20. Retorne ao ângulo crítico desejado e à posição Z alternando as posições salvas ou controlando manualmente o ângulo do espelho e a posição Z, e adquira um lapso rápido de tempo.
    21. Certifique-se de que não haja desvio no estágio ou que a co-inscrição de imagens multicanal não seja feita corretamente. Use marcadores fiduciários (microesferas fluorescentes) ou salve a posição Z no início da aquisição para usar posteriormente na correção de deriva, usando o método de salvamento de posição para aquisição multiponto no dispositivo.
    22. Troque o filtro (ou deixe se estiver usando multi-entalhe com banda de passagem para o fluoróforo necessário) e repita as seções 2.3.17-2.3.20 (Para etiquetas seguintes, certifique-se de sempre começar com baixa potência do laser, ajustar parâmetros e adquirir).
  4. Processamento de dados:
    1. Carregue a pilha de imagens raw no FIJI usando o plugin Bio-Formats. Gerar uma projeção de intensidade mínima selecionando Imagem> Stacks> Z Project e escolhendo Intensidade mínima como tipo de projeção. Subtraia essa projeção mínima da pilha de imagens brutas usando o Process > Image Calculator. Na imagem resultante, realize a subtração de fundo (Processo > Subtrair Fundo) com um raio de bola rolante de 5 pixels.
    2. Defina a região de interesse (ROI) para células individuais, seja manualmente ou com o plugin Nuclei Outline (Plugins > GDSC > Cells > Nuclei Outline).
    3. Realize a análise de localização na pilha de imagens pré-processadas dentro do ROI definido usando o plugin ThunderSTORM (Plugins > análise ThunderSTORM > Run). Use parâmetros apropriados para localização robusta (por exemplo, filtro de imagem: B-spline, ordem = 3, escala = 2; limiar de intensidade máxima = 1,5× std (Onda.F1); método de localização sub-pixel: Gaussano, sigma = 2; raio de ajuste = 4; método de ajuste: máxima probabilidade). As coordenadas resultantes podem ser usadas para reconstruir a imagem de super-resolução.
    4. Para experimentos multicanais, mesclar canais para gerar uma imagem dSTORM composta reconstruída por cromatina (Imagem > Canal de Fusão > Cor).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imagens representativas de cromatina tricolor dSTORM

O protocolo proposto de coloração sequencial foi testado válido para uma variedade de linhagens celulares, incluindo fibroblastos BJ, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A, etc. A Figura 1 mostra as imagens representativas das células fibroblastos BJ, HeLa e MCF10A.

Validação do pipeline de análise usando conjuntos de dados simulados

O desenvolvimento de um protocolo de imunofluorescência em três cores exigiu a criação de uma abordagem computacional especializada capaz de lidar com a complexidade dos dados de SMLM nuclear multi-alvo (Figura 2A,2 B). Dado o ambiente denso de cromatina, onde múltiplos alvos coexistem em proximidade, implementamos uma estrutura de análise de nuvens de pontos que processa diretamente as coordenadas de localização em vez de imagens reconstruídas. Essa abordagem aproveita as extensas ferramentas de análise de clustering disponíveis para dados de nuvem de pontos 40,41,42. Avaliamos sistematicamente a capacidade do pipeline de análise de distinguir padrões espaciais biologicamente significativos usando conjuntos de dados simulados controlados. Quatro tipos de distribuição foram gerados para representar cenários distintos de organização da cromatina: distribuição normal para modificações fortemente agrupadas, distribuição uniforme para padrões dispersos, distribuição toroidal modelando zonas de exclusão e distribuição aleatória como controle organizacional (Figura 2C). Esses padrões simulados foram ancorados em posições genuínas de agrupamento de heterocromatina derivadas de dados experimentais de H3K9me3, preservando restrições espaciais nucleares realistas. Essa estrutura de análise utiliza clustering DBSCAN (épsilon = 50 nm, pontos mínimos = 3), que é um dos muitos métodos para análise de clusters em dadosSMLM 40,41,42. Para garantir parâmetros adequados de clustering, já descrevemos anteriormente um método de otimização voltado para a detecção dos domínios de empacotamentoda cromatina 34. Por favor, note que, ao usar isso como etapa inicial na análise, os usuários precisarão otimizar os parâmetros que informam a seleção por meio da estrutura, ambiente e função do alvo. Aqui, os limites do cluster são determinados por meio de cálculos de invólucro convexo, eliminando suposições sobre geometria do domínio. Nossa validação demonstrou uma discriminação clara entre todos os padrões de distribuição simulados por meio de perfis distintos de histogramas de distância (Figura 2D). Cada tipo de organização espacial produziu assinaturas características quando localizações foram analisadas em relação aos centróides de heterocromatina. A análise de ocupação conjunta foi testada usando simulações de marcadores duplos com relações espaciais controladas (Figura 2E). Marcadores espacialmente segregados (configuração normal-toroidal) proporcionaram densidade articular mínima como esperado, resultando em perfis de distribuição planos (Figura 2E). Padrões de marcadores sobrepostos (configuração normal-aleatória) produziram uma densidade decrescente da junta com o aumento da distância dos pontos de referência, correspondendo às previsões teóricas. Esses resultados de validação demonstram a capacidade do nosso framework de detectar e quantificar relações de acoplamento espacial em conjuntos de dados complexos com múltiplos alvos. Para mais informações sobre como esses conjuntos de dados simulados foram gerados, consulte a publicaçãocompleta 34.

Resultados representativos da análise da organização da cromatina

A implementação de nossa abordagem de análise validada em amostras biológicas revela padrões característicos de organização espacial alcançáveis por meio desse protocolo. Usando células HeLa processadas com nosso procedimento de coloração em três cores para H3K9me3, H3K27ac e RNA Polimerase II, demonstramos as capacidades analíticas possibilitadas por essa metodologia. A heterocromatina H3K9me3 serve como sistema de referência ideal, dado o estabelecimento de evidências estabelecidas para a organização concêntrica da cromatina na escala de 200 nm de investigações anteriores de superresolução 23,28,35. A análise começa com a identificação baseada em DBSCAN de domínios de heterocromatina, que são posteriormente categorizados pelo raio efetivo: domínios pequenos (25-40 nm), domínios médios (40-80 nm) e domínios grandes (80-253 nm). Essa estratificação de tamanho explica a heterogeneidade documentada nas dimensões dos domínios de empacotamento do DNA, com domínios médios medindo aproximadamente 80 nm noraio 25. As medições de distância utilizam uma janela de busca do raio de aglomerado de 1,5x (Figura 2B acima) para capturar sinais proximais de eucromatina e polimerase (Figuras 3A,B).

Resultados representativos mostram que tanto H3K27ac quanto RNA Polimerase II localizam consistentemente próximos às fronteiras da heterocromatina em todas as categorias de domínio, alinhando-se com estudos anteriores28,44 e modelos de localização de transcrição relativos aos domíniosda cromatina 23,35,45,46. A análise quantitativa de distância revela posições médias muito próximas das periferias dos domínios: domínios grandes mostram H3K27ac a -1,0 nm e RNA Polimerase II a 8,4 nm das fronteiras, enquanto domínios menores exibem associações periféricas comparáveis com pequenas diferenças posicionais. Essas medições indicam que elementos ativos de cromatina se concentram na interface entre domínios repressivos e permissivos, em vez de serem completamente excluídos. A análise de densidade conjunta demonstra a capacidade do protocolo de revelar acoplamento espacial entre alvos co-rotulados (Figura 3C-F). A análise relativa aos domínios de heterocromatina mostra densidade de articulação máxima ocorrendo logo fora dos limites do domínio (r/r₀> 1), indicando colocalização preferencial da H3K27ac-RNA Polimerase II em regiões periféricas (Figura 3G-I). Esses resultados mostram como esse pipeline de coloração e análise pode ajudar a investigar relações espaciais complexas em ambientes densos.

figure-results-1
Figura 1: Três imagens coloridas das células usadas. Imagens em três cores de (A) fibroblasto BJ (B) HeLa e (C) MCF10A. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Estrutura de análise quantitativa para organização espacial de alvos em relação a clusters de heterocromatina. (A) Pipeline de análise para dados de SMLM multicanal usados neste estudo. (B) Esquema dos cálculos de distância à periferia para agrupamentos de heterocromatina identificados e método de contagem de afinidade conjunta. Ambos os métodos são usados para determinar quantitativamente a disposição de dois alvos em relação à estrutura do agrupamento de heterocromatina. (C) Exemplos de distribuições de dispersão ao redor de aglomerados específicos de heterocromatina usados em um estudo34 para determinar organizações biológicas distintas de estruturas alvo (agrupadas dentro de um domínio vs ao redor do domínio vs não associadas e distribuídas aleatoriamente). (D) Histograma de distância à periferia para curvas de afinidade centralizada, distribuídas aleatoriamente e toroidais e (E) curvas de afinidade articular para casos de simulação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Relações espaciais quantitativas de marcadores de transcrição ao redor dos domínios histonicos. (A) Resultados do histograma distância à periferia para dados biológicos exemplares de células HeLa multi-marcadas. Para domínios pequenos (<40 nm), médios (40-80 nm) e grandes (>120 nm) para RNAPII e (B) H3K27ac em relação a clusters H3K9me3. (C-E) Imagens de exemplo para imagem dSTORM de três etiquetas de células HeLa (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p, com imagem inserida e ampliada para um único domínio. (F) Ajuste do invólucro convexo (vermelho) do domínio ilustrado em E com a zona de análise em cinza. (G) Gráficos de afinidade para RNAPII em relação a H3K27ac e H3K27ac (H) em relação a RNAPII na análise de ROI para todos os domínios dos dados de tamanho médio no conjunto de dados. (I) Densidade conjunta de RNAPII e H3K27ac em análise ROI para todos os domínios de porte médio. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussion

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Esse protocolo SMLM de três cores representa um avanço significativo em nossa capacidade de investigar a organização da cromatina dentro do denso ambiente nuclear. A abordagem sequencial de marcação por imunofluorescência, combinada com análise espacial pontual-nuvens que utiliza estimativas de localização como pontos como base da análise, oferece aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para examinar relações em nanoescala entre diferentes modificações de cromatina e máquinas de transcrição ativa que antes eram indetectáveis por técnicas convencionais de microscopia.

A estratégia de coloração sequencial do protocolo aborda desafios fundamentais inerentes à imagem nuclear multi-alvo. Ao contrário de estruturas citoplasmáticas ou associadas a membranas, que são relativamente escassas, alvos de cromatina nuclear existem em densidade extremamente alta com domínios espaciais sobrepostos. Nossa abordagem de bloqueio modificada, incorporando soro de espécies hospedeiras de anticorpos secundários após cada rodada de marcação, previne efetivamente a reatividade cruzada entre pares de anticorpos, mantendo a especificidade do alvo. As incubações noturnas a 4°C garantem penetração completa de anticorpos em todo o volume nuclear, fundamental para alcançar a densidade uniforme de marcação necessária para a análise quantitativa do SMLM. Esse protocolo produz imagens com resolução de 15-20 nm em múltiplas linhagens celulares, tornando-se amplamente aplicável para estudos de organização da cromatina.

A seguir, estão as dicas de solução de problemas para a sessão de imagem. Se os núcleos não branquearem, a causa mais provável é a intensidade insuficiente do laser na amostra, o que pode resultar de uma configuração de baixa potência ou de um ângulo incorreto do TIRF; nesse caso, faça a solução verificando o alinhamento do laser, aumentando a potência do laser e ajustando cuidadosamente o ângulo do TIRF. Se os piscades no núcleo são muito poucos, mas permanecem constantemente brilhantes, isso indica que os núcleos não desbotaram o suficiente. Se os piscades forem muito escassos e os núcleos não forem visíveis, a explicação mais provável é a coloração não bem-sucedida, e os reagentes e anticorpos devem ser verificados antes de repetir o protocolo. Por outro lado, se o número de piscadas nucleares for muito alto (um resultado desejável), é necessário um tempo de branqueamento mais longo até que piscas individuais e bem separadas de molécula única possam ser resolvidas visualmente. Em experimentos convencionais de SMLM, a densidade de marcação adequada pode frequentemente ser estimada usando estruturas de referência bem definidas, como microtúbulos; No entanto, a cromatina apresenta uma organização altamente heterogênea e carece de uma estrutura de verdade de base bem definida, tornando essa estimativa mais desafiadora. Com base em otimização empírica e experiência prévia, garantimos, portanto, que a densidade efetiva de marcação atinja aproximadamente 100 localizações por μm² para permitir uma reconstrução robusta dos domínios de empacotamento de cromatina. No nosso protocolo, não usamos nenhum marcador fiduciário, mas recomendamos se os usuários os possuem. Em nossos experimentos, os deslocamentos laterais permanecem dentro de 0,2 pixels (menos de ~5nm), o que pode ser negligenciado. Portanto, não usamos marcadores fiduciários.

A escolha de H3K9me3, H3K27ac e RNA polimerase II fornece informações complementares sobre a organização da cromatina em nível nanográfico. H3K9me3 serve como referência espacial ideal porque forma clusters discretos e bem definidos que representam heterocromatina constitutiva e podem ser identificados de forma confiável por meio de algoritmos automatizados de clustering. H3K27ac marca cromatina associada a potenciadores que participa ativamente da regulação gênica, enquanto a RNA Polimerase II indica diretamente locais de transcrição ativa. Juntos, esses três alvos permitem investigar como a maquinaria transcricional e as modificações regulatórias da cromatina se organizam em relação às regiões heterocromáticas dentro da arquitetura nuclear.

A estrutura de análise de nuvens pontuais, abordando limitações críticas de estudos anteriores sobre organização da cromatina ao permitir uma análise espacial abrangente em ambientes nucleares densos. Métodos tradicionais de comparação par a par não conseguem capturar as complexas relações espaciais que ocorrem quando múltiplas modificações de cromatina coexistem dentro das mesmas regiões nucleares. Nossa abordagem utiliza análise de densidade conjunta para revelar onde H3K27ac e RNA polimerase II se co-localizam em relação aos clusters H3K9me3, fornecendo informações quantitativas que não podem ser obtidas em experimentos separados de duas cores.

Resultados representativos demonstram consistentemente um modelo organizacional coeso, em vez de compartimentalização estrita da cromatina. Tanto H3K27ac quanto RNA polimerase II localizam preferencialmente nas periferias de grupos de heterocromatina em diferentes tamanhos de domínio, com medições quantitativas mostrando posicionamento dentro de 10 nm das fronteiras de aglomerados, o que apoia achados de outros grupos com métodos e modelos de transcriçãosemelhantes 23,28,35,45,46 . A análise de densidade conjunta revela que a maquinaria ativa de transcrição e a cromatina associada a potenciadores se acoplam com mais frequência em regiões ao redor de aglomerados heterocromáticos. Esses achados desafiam modelos simples de separação de fases e apoiam princípios organizacionais integrados, onde diferentes modificações da cromatina mantêm proximidade espacial próxima, em vez de formar compartimentos separados e distintos.

O design modular do protocolo permite a investigação de diversas questões de biologia da cromatina por meio da substituição de alvos, mantendo o mesmo arcabouço analítico. Estudos sobre o tempo de replicação podem substituir proteínas do ciclo celular, como antígeno nuclear de células de proliferação (PCNA) e manutenção de mini cromossomos (MCM), enquanto investigações sobre resposta a danos ao DNA podem atingir γH2AX e fatores de reparação. Estudos do ciclo celular podem examinar modificações de histonas que mudam ao longo da divisão, e pesquisas de diferenciação podem focar em marcas epigenéticas associadas ao compromisso da linhagem. A abordagem de marcação sequencial acomoda qualquer combinação de proteínas nucleares ou modificações da cromatina para as quais existam anticorpos confiáveis, limitada principalmente por considerações de compatibilidade espectral e reatividade cruzada. Essa flexibilidade permite que os pesquisadores abordem questões fundamentais sobre a dinâmica da cromatina durante vários processos celulares, mantendo capacidades quantitativas de análise espacial.

Disclosures

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Os autores deste protocolo não têm divulgações ou interesses concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho foi apoiado por subsídios do NIH U54CA268084, U54CA261694 e R01CA228272, subsídios da National Science Foundation EFMA-1830961 e CBET-2430743, e apoio filantrópico de Rob e Kristin Goldman, Sr. David Sachs e da Christina Carinato Charitable Foundation.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Andor iXon Ultra 888 CCD  de multiplicação de elétrons;AndorDU-888U3-CSO-#BV NA
Albumina sérica bovinaSigma AldrichA7030Usado para bloquear e lavar amortecedores. Não armazene buffer de bloqueio baseado em BSA por mais de 1 mês em 4° C
Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd., Modelo MGL-FN-532 (532 nm) e nbsp;PSU-H-LED https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htmNA
Caixa de Laser Coerente OBIS (405 nm, 488 nm, 532 nm, 552 nm, 637 nm) & nbsp;Coerente1228877 Lasers colimatos com 3&ntraço; 10 kW/cm³ Potência média na amostra, mínimo de 10.000 quadros coletados por canal de comprimento de onda com&NBSP; 10– 30  ms  tempo de aquisição. 
DABCO (1,4-Diazabiciclo-(2.2.2)-octanagem)SigmaD27802NA
DBPS (1X)Thermo Fisher14190-136NA
Água destiladaNANAQualquer água destilada está ok...
DTT (Dithiothreitol), 1MSigma43816NA
Vidro de cobertura com oito bem câmarasCellvisC8-1.5H-NPode ser qualquer placa inferior de vidro, mas os volumes precisam ser ajustados dependendo do recipiente.
Goat anti Mouse AF568Thermo FisherA11004Concentração de estoque: 2 mg/mL
Estabilidade Pós-Marcagem: 2– 3 dias
Goat anti Rabbit AF647Thermo FisherA21245Concentração de estoque: 2 mg/mL
Estabilidade Pós-Marcagem: 4– 5 dias
A488 anti-rato de cabraThermo FisherA11006Concentração de estoque: 2 mg/mL
Estabilidade Pós-Marcagem: 2– 3 dias
Anticorpo primário H3K27acThermo FisherMA5-23516Concentração de estoque: 1,0 mg/mL 
Anticorpo Primário H3K9me3  AbcamAB1769156Concentração de estoque: 1,287 mg/mL 
Tubo Cônico de Polipropileno de Alta Clareza 15 mL   Corning 352096Usado para soluções fixativas e de têmpera  
Tubo Cônico de Polipropileno de Alta Clareza 50 mLCorning352070Usado para estoques de 40 mL de buffers de bloqueio e lavagem
Ácido clorídrico (HCl), 12MSigma258148NA
Nikon Eclipse Ti-E com sistema de foco perfeito  NikonTI-DH 611392 Microscópio invertido 
Nikon SR APO TIRF, ampliação 100x, 1,49 NA Nikonhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series  NA
Soro normal de cabraAbcamAB7481-1002Usado depois que a primeira etiqueta está pronta. Deve estar presente nos Buffers de Bloqueio e Lavagem
Paraformaldeído 16 % Ciências da Microscopia Eletrônica15710Usado em solução fixadora que deve ser consumida em até 2 semanas após a fabricação. Mantenha a proteção contra luz em 4° C
Soro salino tamponado com fosfato (PBS) 10XAmbionAM9625NA
Ponteiras de Pipeta 1000 uLSureOne02-707-404Qualquer ponta de pipeta é aceitável, desde que ela seja. s apropriado para o volume
RNAPII-PS2AbcamAB252855Concentração de Estoque: 0,98 mg/mL
Borohidreto de sódioThermo FisherS678-10Use fresh para tampão de têmpera toda vez.
Hidróxido de sódio (NaOH)Thermo Fisher & nbsp;A16037.36NA
Sulfito de sódioSigmaS0505NA
Triton X-100 10%Thermo Fisher & nbsp;28314NA

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