Method Article

Desenvolvimento e Eficácia de Nanopartículas de Esqualeno-Quiamida Responsivas a Enzimas para Câncer de Pâncreas

DOI:

10.3791/69875

⸱

March 13th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalha a síntese e caracterização de nanopartículas de esqualeno-quitosano modificadas com ácido fólico, avalia sua liberação de fármacos responsivos a enzimas e captação celular in vitro, e as aplica para aprimorar a terapia do câncer de pâncreas por meio de entrega direcionada.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para lidar com a penetração intratumoral limitada de medicamentos de pequenas moléculas causada pela matriz extracelular densa (ECM) do adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Os Prodrugs oferecem grande potencial para superar esse desafio ao melhorar a penetração de fármacos e a eficácia para eliminar tumores. O esqualeno (SQ), um precursor natural para a biossíntese do colesterol com excelente biossegurança e biocompatibilidade, pode melhorar a compatibilidade membranar de medicamentos hidrofílicos e aumentar sua absorção celular quando conjugado a agentes quimioterapêuticos ou pequenas moléculas bioativas. Neste estudo, desenvolvemos um novo sistema pró-fármaco lipofílico baseado em SQ: o fármaco anticâncer hidrofílico chidamida (CHI) foi conjugado ao SQ por meio de uma ligação amida — uma ligação sensível à pancreatina e à catepsina B (enzimas chave superexpressas no microambiente PDAC). Essa conjugação resultou em um profármaco anfifílico SQ-CHI, que foi posteriormente auto-montado em nanopartículas modificadas por folato (FA) (FA-SQ-CHI Ns). Os NPs otimizados apresentaram um diâmetro hidrodinâmico uniforme de 173,3 ± 1,5 nm, índice de polidispersidade (PDI) de 0,181 ± 0,18, alta capacidade de carregamento de drogas de 59,0% ± 0,77%, e potencial Zeta estável de -13,10 ± 0,86 mV. Estudos de liberação in vitro mostraram que os NPs alcançaram 80,2% ± 4,22% de liberação acumulada de fármacos em 72 horas na presença de 0,25% de pancreatina, enquanto apenas 33%-38% de liberação foi observada em tampões ajustados pelo pH (pH 4,5 ou 7,4) sem enzimas. Ensaios de captação celular confirmaram que a modificação da FA aumentou significativamente a eficiência da entrega intracelular, com intensidade de fluorescência 1,8 a 2,3 vezes maior em células PDAC (PSN-1 e CFPAC-1) em comparação com NPs não direcionados entre 12 e 24 horas. O protocolo atual fornece uma metodologia abrangente para a síntese e caracterização do prodrug, avaliação in vitro da cinética de liberação responsiva a enzimas e análises comparativas da eficácia terapêutica e penetração tecidual, destacando as principais vantagens do nanocarrier em termos de entrega direcionada, alta carga de fármacos e liberação controlada desencadeada por enzimas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é um tumor altamente maligno do trato digestivo, com uma incidência quase igual à sua taxa de mortalidade, e uma taxa de sobrevivência em 5 anos de apenas 8%-9%1. Um microambiente tumoral complexo (TME) é a característica marcante doPDAC 2. É composto principalmente por uma matriz extracelular anormal (ECM), fibroblastos associados ao câncer ativados (CAFs) e um ambiente celular profundamente imunossupressor. O ECM do PDAC é rico em colágeno tipo I. Tanto seu conteúdo alterado quanto sua arquitetura anormal promovem a progressão tumoral e estão associados a um prognósticoruim 3. Os CAFs são as células estromais abundantes e consistem em subtipos funcionalmente distintos, como myCAFs produtores de matriz e iCAFs inflamatórios, que apresentam plasticidadefenotípica 4.

Imunologicamente, o TME do PDAC é dominado por células mieloides pró-tumorais. Linfócitos antitumorais são escassos ou disfuncionais. Linfócitos B maduros também contribuem para a imunossupressão 3,4. Coletivamente, esses componentes estabelecem múltiplas barreiras terapêuticas. O estroma denso, caracterizado por alta pressão de fluido intersticial, cria uma barreira de penetração significativa que dificulta severamente a administração de agentes terapêuticos nas regiões tumorais profundas, limitando substancialmente a eficácia clínica dos medicamentosquimioterapêuticos 5. Consequentemente, desenvolver sistemas de entrega de medicamentos capazes de superar essa barreira estromal e penetrar profundamente no tecido tumoral pancreático é de importância crítica.

Nos últimos anos, o esqualeno (SQ), precursor natural da biossíntese do colesterol, tem atraído considerável atenção devido à sua excelente biossegurança ebiocompatibilidade 6. Por ser altamente hidrofóbicos, os SQ podem ser conjugados com fármacos hidrofílicos para formar profármacos anfifílicos, melhorando assim a biocompatibilidade dos fármacos hidrofílicos de pequenas moléculas com membranas celulares e aumentando sua eficiência de absorçãocelular 7. Estudos anteriores demonstraram que a SQ pode ser conjugada covalentemente com vários agentes quimioterapêuticos, como cisplatina, paclitaxel e gemcitabina, formando nanopartículas de profármacos com alta capacidade de carga de fármacos, o que melhora a entrega de fármacos aos tumoressólidos 8,9. Essas propriedades ressaltam o amplo potencial de aplicação da SQ no desenvolvimento de sistemas de entrega de medicamentos.

Para aprimorar o direcionamento tumoral, este estudo utiliza ácido fólico (FA) como ligante direcionador. A FA é uma vitamina solúvel em água crucial para o metabolismo de um carbono, biossíntese10, homeostase redox11 e reações demetilação 12. A conjugação da FA via seus grupos carboxila com o nanotransportador permite o reconhecimento específico e a ligação ao receptor de folato (FR), seguida pela endocitose mediada peloreceptor 13. Aproveitando o aumento da permeabilidade e do efeito de retenção das células tumorais, Zheng et al.14 avaliaram a expressão do receptor de folato α (FRα) em câncer de pâncreas, pâncreas normal, tecidos adjacentes e pancreatite crônica usando Western blotting e imunohistoquímica, e analisaram sua correlação com características clinicopatológicas. FRα foi expresso em 94,7% (72/76) dos casos de câncer de pâncreas, correlacionando-se com metástase, mas estava ausente nos tecidos pancreáticos normais. Nanopartículas modificadas por FA podem se acumular seletivamente em tecidos FR-positivos, possibilitando terapias molecularmente direcionadas.

A quidamida (CHI) é um novo inibidor de histona desacetilase. Estudos pré-clínicos demonstraram que ele também apresenta uma atividade antitumoral potente contra tumores sólidos, como câncer de pâncreas e de mama, e pode reverter a resistência a medicamentos em célulastumorais 15,16. No entanto, sua forte hidrofilicidade está associada a baixa eficiência de penetração no microambiente tumoral e distribuição ruim nos tecidos sólidos do tumor, o que limita severamente seu potencial clínico terapêutico para câncerde pâncreas 5. Utilizando a chidamida (CHI) como medicamento modelo, este estudo propõe a preparação de nanopartículas auto-montadas por meio da conjugação do CHI com a SQ e subsequente modificação com FA. Essa estratégia visa aumentar a eficácia antitumoral do CHI contra o câncer de pâncreas, superando sua penetração inadequada no microambiente tumoral e sua distribuição subótima no tecido tumoral sólido. Além disso, ao avaliar a eficácia in vitro do CHI em linhagens celulares de câncer de pâncreas, espera-se que essa abordagem melhore significativamente a penetração e os efeitos citotóxicos do CHI — um fármaco representativo hidrofílico de pequenas moléculas — no microambiente tumoral pancreático, fornecendo assim uma base experimental para orientar a terapia baseada em CHI no câncer de pâncreas.

Nosso estudo detalha os procedimentos experimentais para preparar nanopartículas de profármaco auto-montadas CHI-SQ-PEG-FA para o tratamento do câncer de pâncreas. Especificamente, descrevemos a otimização e caracterização do processo de preparação para nanopartículas CHI-SQ-PEG-FA, juntamente com estudos de liberação in vitro de fármacos. O processo envolve: primeiro, otimizar a formulação usando uma abordagem experimental de fator único e determinar o tamanho ideal de partículas e a carga de medicamentos; segundo, caracterizar as nanopartículas usando ensaios UPLC e MTS; e, finalmente, estabelecer um modelo de esferoide tumoral co-cultivado in vitro . Usando a cumarina-6 (C6) como sonda fluorescente em nanopartículas alvo, validamos ainda mais a penetração e distribuição das nanopartículas dentro dos esferoides tumorais tridimensionais e obtemos dados relevantes.

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Protocol

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1. Síntese de SQ-CHI e SQ-PEG-FA

  1. Síntese de SQ-CHI: Pesar 120,4 mg (0,3 mmol) de ácido 1,1',2-tris-norsqualenoico e dissolvê-lo em 1 mL de N, N-Dimetilformamida (DMF). Adicione sequencialmente NHS (46 mg, 0,4 mmol) e EDCI (72 mg, 0,38 mmol) e permita que a reação prossiga por 90 minutos sob proteção com nitrogênio.
  2. Dissolva a quidamida (58,56 mg, 0,15 mmol) em 1 mL de DMF e adicione em gota à mistura da reação. Agite a reação em temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio por 72 horas.
  3. Após a conclusão, evapore o solvente sob pressão reduzida a 5-15 kPa para obter o produto bruto. Purifique o produto bruto por cromatografia em coluna flash usando uma elução em gradiente de DCM/MeOH (99:1, 99:5, 85:5).
  4. Verificação estrutural do SQ-CHI: Coloque o produto sintetizado do SQ-CHI em um frasco de vidro e seco-o a vácuo em um dessecador por 24 horas. Dissolva o produto em aproximadamente 1 mL de clorofórmio deuterado (CDCl 3) e transfira-o para um tubo de amostra de RMN. Realize uma análise de RMN de 1H para confirmar a estrutura química doproduto 17.
  5. Síntese de SQ-PEG-FA: Dissolver 41,12 mg de ácido 1,1',2-trisqualenoico em 35 μL de DMF. Adicione sequencialmente N-hidroxisuccinimida (NHS, 15,71mg) e 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCI, 24,59 mg) a essa solução.
  6. Deixe a reação prosseguir por 90 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. Dissolva 20 mg de FA-PEG-NH2 em 35 μL de DMF e adicione em gota à mistura da reação.
  7. Mexa a mistura resultante em temperatura ambiente por 72 h sob nitrogênio. Purifique o produto bruto com um tubo de centrífuga de ultrafiltração MWCO de 3 kDa a 5.200 x g por 30 minutos para remover o ácido livre não reagível. Coloque a solução aquosa complexa SQ-PEG-FA purificada em um frasco de vidro e pré-congele a -50 °C. Liofilize a solução pré-congelada em um liofilizador para obter o complexo SQ-PEG-FA como um pó liofilizado.

2. Verificação estrutural do SQ-PEG-FA

  1. Coloque o complexo SQ-PEG-FA liofilizado em um tubo centrífugo de 2 mL e seque ainda mais a vácuo em um dessecador por 24 horas. Dissolva o produto em aproximadamente 1 mL de dimetil sulfóxido deuterado (DMSO-d 6) e transfira-o para um tubo de amostra de RMN. Realize uma análise de RMN de 1H para confirmar a estrutura química do complexo.
  2. Otimização da preparação e caracterização de NPs SQ-CHI-PEG-FA
  3. Pese 6,64 mg de SQ-CHI e dissolva em 2 mL de etanol absoluto para preparar uma solução de estoque de 3,32 mg/mL (4,3 μM).
  4. Adicione a solução de estoque etanol SQ-CHI (1, 0,2, 0,1 ou 0,05 mL) em gota a 1 mL de água deionizada sob mexer. Mexa por 5 minutos, depois retire o etanol por evaporação a pressão reduzida. Sonice a mistura resultante por 30 minutos para obter uma suspensão de nanopartículas CHI-SQ. Meça o diâmetro hidrodinâmico e o índice de polidispersidade (PDI) das nanopartículas com um Zetasizador para identificar a formulação ideal18.
  5. Adicione 0,1 mL da solução etanolica SQ-CHI em queda a 1 mL de água desionizada após diferentes durações de mexida (0, 5, 10 ou 20 min). Após o respectivo período de agitação, remove-se o etanol por evaporação que reduz a pressão, seguida de uma sonicação por 30 minutos para obter suspensões de nanopartículas CHI-SQ. Meça o diâmetro hidrodinâmico e o PDI para determinar o tempo ideal de agitação.
  6. Adicione 0,1 mL da solução etanolica SQ-CHI em queda a 1 mL de água desionizada sob mexida por 5 minutos. Após a mexer, remova o etanol por evaporação que reduz a pressão. Sonice a mistura resultante por diferentes durações (0, 5, 20 ou 30 min) para obter suspensões de nanopartículas CHI-SQ. Meça o diâmetro hidrodinâmico e o PDI para determinar o tempo ideal de sonicação.
  7. Confirme as condições ideais com base nos resultados acima. Aqui, a razão de volume obtida entre água e solução de estoque = 10:1, tempo de agitação = 5 minutos e tempo de sonicação = 30 minutos. Repita todos os experimentos independentemente em triplicado para garantir a confiabilidade.
  8. Use o método de fator único mantendo os outros parâmetros constantes. Varia sequencialmente os seguintes fatores para avaliar seu impacto na distribuição do tamanho das partículas e no potencial Zeta das nanopartículas: razão de massa dos componentes (SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0,05, 1:0,5, 1:0,7), razão de volume-fase (fase aquosa: fase orgânica = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20) e tempo de sonicação (5, 15, 30, 45 min).
  9. De acordo com o protocolo otimizado, misture as soluções originais SQ-CHI e SQ-PEG-FA na proporção determinada. Adicione essa mistura em gota em água desionizada sob mexer constantemente. Continue mexendo por 5 minutos para garantir uma mistura completa. Remover etanol por evaporação que reduz a pressão, seguida de sonicação com sonda por 30 minutos para obter a suspensão final de nanopartículas CHI-SQ-PEG-FA.
  10. Meça o diâmetro hidrodinâmico, a distribuição de tamanho (PDI) e o potencial Zeta das nanopartículas usando espalhamento dinâmico de luz com um analisador de tamanho de partículas a laser. Observe a morfologia das nanopartículas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, ampliação de 150.000x) e microscopia eletrônica de varredura (SEM, ampliação de 80.000x).
  11. Determinação do conteúdo de carga de fármacos por cromatografia líquida de ultraperformance (UPLC)
  12. Defina as condições cromatográficas da seguinte forma: coluna C18 (2,1 mm x 50 mm, 1,7 μm); Fase móvel: 0,1% de solução aquosa de ácido fórmico - acetonitrilo (75:25, V/V); comprimento de onda de detecção: 258 nm; vazão: 0,2 mL/min; temperatura na coluna: 23 °C; volume de injeção: 5 μL; Duração: 10 min.
  13. Reconstitua a suspensão CHI-SQ-PEG-FA NP e centrifuge-a a 7.500 x g por 30 minutos. Colete o sobrenadante e filtre através de uma membrana microporosa de 0,22 μm. Use o filtrado resultante como solução de teste. Injetar e analisar a solução de teste sob as condições cromatográficas especificadas. Calcule o conteúdo de carga de fármacos das nanopartículas com base na concentração medida de CHI no filtrado.

3. Estudo de liberação de medicamentos in vitro

  1. Pipete com precisão uma aliquota de 2 mL de uma solução de CHI recém-preparada ou da suspensão de nanopartículas CHI-SQ-PEG-FA em um saco de diálise com corte molecular de 3 kDa.
  2. Imerga a bolsa de diálise no meio liberador contendo diferentes concentrações de pancreatina (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). Em intervalos de tempo predeterminados (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), retire 1 mL de amostras do meio liberador e imediatamente substitua-as por um volume igual de meio fresco pré-aquecido para manter as condições de afundamento.
  3. Determine a concentração de CHI em todas as amostras usando o método UPLC (condições cromatográficas conforme especificado na seção 3) e calcule a liberação cumulativa do medicamento.
  4. Use um buffer de acetato de amônio (pH 4,5) como meio liberador. Pipetee com precisão 2 mL da suspensão de nanopartículas em uma bolsa de diálise (3 kDa). Adicione diferentes unidades de atividade (0, 0,7, 1,4, 2,8 U) de catepsina B diretamente na bolsa de diálise. Imerga o saco em 40 mL de meio liberador e incube-o em um shaker de temperatura constante a 37 ± 0,5 °C e 75 rpm. Nos pontos de tempo predeterminados (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), retire 1 mL de amostras e imediatamente as substitua por um volume igual de meio fresco, pré-aquecido, no mesmo pH para manter o equilíbrio do sistema.
  5. Filtre as amostras coletadas através de uma membrana microporosa de 0,22 μm. Analise os filtrados por UPLC para determinar a concentração do medicamento. Calcule a porcentagem cumulativa de liberação de CHI e plote os perfis de liberação de medicamentos.
  6. Pipete com precisão uma aliquota de 2 mL da solução CHI ou da suspensão CHI-SQ-PEG-FA NP em um saco de diálise (MWCO de 3 kDa). Imerga a bolsa de diálise no meio liberador contendo diferentes concentrações de pancreatina (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). Nos pontos de tempo predeterminados (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), retire 1 mL de amostras e imediatamente substitua-as por um volume igual de meio de liberação fresco pré-aquecido para manter as condições de afundamento.
  7. Quantifique a concentração de medicamentos nas amostras por meio de UPLC. Calcule a liberação acumulada do medicamento e gere as curvas de liberação.
  8. Avaliação da estabilidade de nanopartículas em PBS
  9. Misture os NPs chi-sq-peg-fa com PBS (pH 7,4) na proporção de 1:20 (v/v). Incube a mistura em um shaker de temperatura constante a 37 ± 0,5 °C e 100 rpm. Colete amostras em 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72, 96 horas para medir o diâmetro hidrodinâmico e o potencial Zeta.
  10. Ensaio de proliferação celular pelo método MTS
  11. As células de câncer de pâncreas PSN-1 foram cultivadas em meio RPMI-1640 completo. Células na fase de crescimento logarítmico foram colhidas por digestão com 0,25% de tripsina a 37 °C e ressuspensas para uma densidade de 4-6 x10 4 células/mL em meio completo. A suspensão foi semeada em placas de 96 poços a 100 μL por poço, e pré-cultivada por 2 horas emum incubador de 37 °C e 5% de CO 2 para permitir a adesão completa da célula.
  12. Aspire o meio de cultura original. Estabeleça um grupo controle (meio de cultura em branco) e múltiplos gradientes de concentração de grupos quídamidas (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM), com três poços replicados por grupo. Adicione 100 μL de meio em branco ou contendo fármacos em cada poço, depois transfira a placa celular para a incubadora para a cultura contínua. Trate os grupos experimentais com 100 μL de meio fresco contendo concentrações variadas (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM) de SQ-PEG, CHI LIVRE, CHI-SQ-PEG NPs ou CHI-SQ-PEG-FA NPs, enquanto o grupo controle recebe um volume igual de meio em branco. Após uma incubação adicional por 96 horas, retire o meio contendo medicamento de cada poço.
  13. Adicione 20 μL de solução de trabalho MTS a cada poço, seguido de incubação por 4 horas. Agite a placa de 96 poços por 15 s para garantir homogeneidade e imediatamente meça a absorvância (valor A) de cada poço em um comprimento de onda de 490 nm usando um leitor de microplaca. Calcule a taxa de proliferação celular subtraindo o valor OD do grupo em branco do valor OD do grupo tratado com medicamentos, dividindo o resultado pela diferença entre o valor OD do grupo em branco e o valor OD do grupo em branco, e então multiplicando por 100.
  14. Estabelecimento de um modelo de esferoide tumoral co-cultivado in vitro
  15. Misture células PSN-1 na fase de crescimento logarítmico com células HPSC em proporção 2:7 e seme-as em placas de 96 poços de fixação ultra-baixa com densidade de 5.000 células por poço. Após a formação dos esferoides tumorais, trate os esferoides com diferentes nano-formulações (NPs marcados com CHI-SQ-PEG/C6 e CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs) ou DMSO (como controle) e co-incube-os por 48, 96 e 144 horas para avaliar a eficácia do medicamento.
  16. Após a incubação, adicione um volume igual de reagente de ensaio de viabilidade celular a cada poço. Coloque a placa sobre um agitador orbital e agite por 15 minutos para garantir a lise completa, seguida de incubação em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.
  17. Transfira o lisado celular para uma placa preta de 96 poços. Meça o sinal de quimioluminescência em um comprimento de onda de 562 nm usando um leitor multifuncional de microplacas para quantificar a viabilidade celular.
  18. Investigação da absorção celular de nanopartículas
  19. Prepare nanopartículas direcionadas (CHI-SQ-PEG-FA/CN6 NPs) e nanopartículas não alvo (CHI-SQ-PEG/C6 NPs) incorporando cumarina-6 (C6) como uma sonda fluorescente. Cultive rotineiramente células PSN-1 na fase de crescimento logarítmico por 24 horas para formar uma monocamada. Dissolva a cumarina 6 em etanol para preparar uma solução de estoque de 200 μg/mL. Misture 10 μL da solução com SQ-CHI e SQ-PEG-FA (ou SQ-PEG) na proporção de 1:0,7, depois injete gota a gota em água desionizada sob meximento. Mexa por 5 minutos, remova o etanol por evaporação e sonice por 30 minutos. Por fim, purifique via ultrafiltração (3 kDa, 12.000 rpm, 20 min) para obter os itens.
  20. Trate as células da seguinte forma: os grupos experimentais recebem meio sem soro contendo C6 livre, CHI-SQ-PEG/N6 ou CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs (com concentração final de CHI de 5 μmol/L e concentração de C6 de 2,6 μmol/L), enquanto o grupo controle recebe volume igual de meio em branco.
  21. Após a incubação por 4, 12 h e 24 h, aspire o meio que contém o medicamento. Núcleos de células de staining usando 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)19.
  22. Realizar observações sob microscópio de fluorescência (40x, comprimento de onda de excitação Ex=360 nm, comprimento de onda de emissão Em=477 nm). Avalie a absorção celular de nanopartículas medindo a intensidade de fluorescência da cumarina-6.

4. Análise estatística

  1. Realize todos os experimentos com no mínimo 3 réplicas para obter os dados apresentados neste estudo. Analise estatísticas usando o software GraphPad Prism. Apresente os dados experimentais como média ± erro padrão da média (SD) e compare entre grupos usando o teste t de Student, ANOVA unidirecional ou teste de Wilcoxon, quando apropriado. Defina o limiar para significância estatística em P < 0,05.

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Results

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Este estudo projetou e avaliou sistematicamente com sucesso um novo sistema direcionado de entrega de nanofármacos — Nanopartículas Auto-Montadas à Base de Prodrugação por Esqualenilação de Chidamida (CHI-SQ-PEG-FA NPs; Figura 1). Sintetizamos NPs CHI-SQ-PEG-FA (Figura 2) e avaliamos sistematicamente os efeitos de vários parâmetros, incluindo a razão óleo-fase água (Figura 3A), duração da agitação (...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo fornece um guia prático passo a passo para implementar um sistema de cintura baixa baseado na auto-montagem de nanopartículas. As nanopartículas auto-montadas obtidas neste estudo apresentaram formato esférico regular, boa dispersão, tamanho de partículas uniforme, alta eficiência de carga e encapsulamento de fármacos, e demonstraram estabilidadesatisfatória 21. Um modelo 3D de cocultura de esferoides tumorais (PSN-1/HPSC) foi empregado para avaliar a ...

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Disclosures

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Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgements

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Esse trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (LZ23H290001 LY19H280001); subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82474338 e 82274364); Programa de Colaboradores em Ciência e Tecnologia Agrícola da Província de Zhejiang (2025SNJF075); bem como o Projeto de Pesquisa em Bem-Estar Público do Huzhou Science and Technology Grand (2021GZ261); bem como o Projeto Geral de Pesquisa Científica do Departamento de Educação da Província de Zhejiang (Y202456442, 2025YKJ10).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% tripsina-EDTAGibco (EUA)25200072
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodimimida cloridrato (EDCI)Sigma-Aldrich (EUA)E6383
Frascos criogênicos de 2 mLCorning (EUA)430488
Placas de cultura celular de 96 poçosCorning (EUA)3598
Etanol absolutoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)100092680
AcetonaChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)32201-2.5L
acetonitrilaTedia (EUA)A998-4Grau HPLC
Acetato de amônioChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10002861
sulfato de sódio anidroSigma-Aldrich (EUA)31481
Gabinete de segurança biológicaThermo Fisher Scientific, EUA1380, 1332, 1356
Frascos de cultura celularCorning (EUA)CLS430372
incubadora de cultura celularThermo Fisher Scientific, EUAHERA51901126
Chidamida (CHI)Shenzhen Microcore Biotech Co., Ltd. (China)pureza >95%
Leitor de microplacas multimodo Cytation 5BioTek, EUACYT5MV
Agitador termostatístico de aquecimento magnético DF-101SZhengzhou Kechuang Instrument Co., Ltd., China
diclorometanoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)80047318
Dimetil sulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich (EUA)D2650
dioxaneAladdin (China)D116156-5ml
Meio DMEMGibco (EUA)12100046
Soro salino tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS)Gibco (EUA)14040141
Acetato de etilaChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10009460
Éter etílicoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
FA2004B balanço eletrônicoShanghai Tianmei Balance Instrument Co., Ltd., ChinaFA2004B
Soro bovino fetal (FBS)Gibco (EUA)10099141C
folato-poli(etilenoglicol)-amina (FA-PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (China)PS2-NFA-2000
Ácido fórmicoAladdin (China)F112034Grau HPLC
LiofilizadorThermo Fisher Scientific, EUA
Catepsina humana BSigma-Aldrich (EUA)SRP0289
Linhagens celulares de câncer de pâncreas humano (PSN-1, CFPAC-1)a Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC)CRL-3211, CRL-1918
células estreladas pancreáticas humanas (HPaStec, HPSC)a Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC)
Tripsina humanaSigma-Aldrich (EUA)
Ácido clorídricoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)CFSR-10011008
Microscópio invertidoOlympus, JapãoIX83
Médium Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM)Gibco (EUA)12440053
IX 1000 misturador de vórtices  Hangzhou Ruicheng Instrument Co., Ltd., ChinaIX 1000
MetanolChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)M433287-10L
metanol Tedia (EUA)MS1922-001Grau HPLC
Tubos microcentrífugas (1,5/2,0 mL)Axygen (EUA)MCT-150-C
micropipetas (20, 100 e 1000 & mu; L)Thermo Fisher Scientific, EUA4642050, 4642070, 4642090
Sistema de purificação de água Mill-Q  Millipore, EUAZR0Q00800
  Kit de ensaio MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium)Promega (EUA)G3582
N,N-Dimetilformamida (DMF)Aladdin (China)
N-bromosuccinimida (NBS)Sigma-Aldrich (EUA)B81255
N-Hidroxisuccinimida (NHS)Sigma-Aldrich (EUA)56480
Optima Max ultracentrífuga Beckman, EUA393490
Solução de penicilina/estreptomicinaGibco (EUA)15140-122
Ácido periódicoSigma-Aldrich (EUA)P7875
Éter de petróleoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
Metossulfato de fenazina (SPM)Sigma-Aldrich (EUA)3180806
Soro salino tamponado com fosfato (PBS)Gibco (EUA)70011069
Poli(etilenoglicol)-amina (PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (China)PG2-AM-20k
RPMI-1640 médioGibco (EUA)31800022
Pó de gel de sílicaSigma-Aldrich (EUA)53698300 mesh
Bicarbonato de sódioSigma-Aldrich (EUA)401676
cloreto de sódioChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10019318
Dicromato de sódio diidratoSigma-Aldrich (EUA)1.93689
EsqualenaSigma-Aldrich (EUA)Y0002131
tubos centrífugas estéreis (15 e 50 mL)Corning (EUA)430791, 430828
Ácido sulfúricoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10021618
TetrahidrofuranoChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)34865-4X4LGrau analítico
tubos centrífugos de ultrafiltração (corte de peso molecular: 3,5 kDa)Beckman, EUA344088

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