Artigo de método

Imagem Espectroscópica de Super-resolução de Moléculas de DNA usando Contraste Intrínseco

DOI:

10.3791/69917

⸱

6 de março de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern Memorial Hospital

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo fornece operações detalhadas sobre preparação de amostras, coleta de dados e análise dos espectros de fluorescência intrínseca do DNA.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imagem de superresolução revolucionou a pesquisa biológica ao revelar detalhes estruturais em escala nanométrica. A maioria dos métodos ópticos de super-resolução depende da marcação fluorescente das biomoléculas, que permite a marcação específica das espécies moleculares, mas pode prejudicar funções celulares, introduzir imprecisões das moléculas de ligação e falhar em fornecer a alta densidade de marcação consistente necessária para a imagem de cromatina na escala de moléculas individuais de DNA. Uma tecnologia que permita imagens genômicas in situ , sem rótulos, com resolução nanométrica, impactaria profundamente a biologia. Aqui, apresentamos um protocolo que aproveita a fluorescência intrínseca do DNA para realizar microscopia espectroscópica de localização de molécula única (sSMLM). O protocolo detalha a preparação da amostra, aquisição de dados e análise espectral. Resumidamente, um gel fino de DNA é criado depositando uma solução polinucleotídica sobre o vidro e deixando-a secar por horas. Após a formação do gel, a amostra é registrada na presença de um buffer de imagem usando sSMLM. O conjunto de dados registrado compreende uma imagem de ordem zero, fornecendo localizações espaciais, e uma imagem de primeira ordem, codificando o espectro de emissão de cada localização. Reconstruções espaciais são geradas a partir dos dados de ordem zero, após os quais os espectros correspondentes são extraídos do sinal de primeira ordem. Por fim, demonstramos a viabilidade dessa abordagem usando múltiplos comprimentos de onda de excitação e moléculas de DNA com comprimentos, sequências e composições variadas.

Introdução

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Técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução — incluindo microscopia de iluminação estruturada (SIM), microscopia de depleção por emissão estimulada (STED) e microscopia de localização de molécula única (SMLM), como microscopia de localização fotoativada (PALM) e microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) — levaram a resolução da microscopia óptica muito além do limitede difração 1,2,3,4.5,6,7, permitindo acesso sem precedentes à organização em nanoescala dacromatina 8,9,10,11,12. No entanto, os métodos atuais de coloração para visualizar estruturas de ácidos nucleicos dependem da marcação de proteínas associadas ao DNA em vez do próprio DNA, ou empregam corantes de pequenas moléculas que podem perturbar a configuração nativa da cromatina e comprometer a viabilidade celular13,14. Devido a essas limitações, o desenvolvimento de métodos ópticos de imagem de superresolução sem marcador sob condições nativas e não perturbadoras é altamente desejável. O protocolo apresentado aqui é destinado a nucleotídeos de DNA sintéticos purificados de fita simples ou dupla, onde a fluorescência intrínseca pode ser detectada de forma confiável; não é otimizado para imagens de moléculas de DNA nuclear em células fixas ou vivas.

Como os ácidos nucleicos foram por muito tempo considerados não fluorescentes devido ao seu rendimento quântico extremamente baixo (na ordem de 10−4 sob excitação UV) e decaimento ultrarrápido da fluorescência à temperaturaambiente 15, estudos sobre a fluorescência intrínseca do DNA (principalmente a vida útil da fluorescência) foram raros até o desenvolvimento da espectroscopia femtossegundos. Está amplamente reconhecido que os nucleotídeos fluorescem fracamente sob iluminação UV, enquanto sua absorção na faixa visível é consideravelmente mais fraca. No entanto, foi observado recentemente que a fluorescência visível excitada pela luz de ácidos nucleicos não modificados em concentrações fisiologicamente relevantes existe16. Esse fenômeno provavelmente foi negligenciado porque a maioria dos estudos fotoquímicos de nucleotídeos foi realizada em soluções diluídas (10-100 μM)17,18,19,20, enquanto em núcleos e cromossomos, as concentrações de DNA podem chegar a 0,1-1 M21,22,23. Mais importante ainda, a comutação estocástica de fluorescência sob iluminação visível foiobservada 16, lançando as bases para o uso de ácidos nucleicos não modificados como agentes de contraste endógenos para microscopia de superresolução baseada em localização.

As características fotoquímicas de monômeros nucleotídicos e moléculas de DNA de fita simples com sequências simples em concentrações fisiológicas sob excitação de luz visível foramexploradas 24. Também foi demonstrado que essas moléculas de DNA possuem propriedades estocásticas de comutação de fluorescência, o que se alinha bem com a teoria da depleção do estado fundamental (GSD)6,7, examinando a recuperação de fluorescência de nucleotídeos sob condições variadas de depleção. Além disso, como os nucleotídeos exibem rendimentos quânticos relativamente altos e baixas probabilidades de cruzamento interssistema, a contagem de fótons e as durações de piscar dos eventos de emissão de molécula única são comparáveis às dos corantes exógenos populares em STORM (por exemplo, Alexa Fluor 647), exibindo espectrosdistintos 25,26 e tornando o DNA um agente de contraste intrínseco ideal para imagens de alta resolução. Além disso, a implementação do algoritmo de regressão espectral descrito na seção anterior permite imagens de superresolução abaixo de dez nanômetros de polinucleotídeos e fibras lineares de DNA defita simples 27.

Para capturar todo o espectro da fluorescência intrínseca do DNA, utilizamos um prisma de cunha dupla (DWP) para detecção espectral, que permite análise espectroscópica e imagem simultânea de alta capacidade de molécula única com perda de transmissão mínima e errode frente de onda 28,29,30, além de um software de análise espectroscópica SMLM de código aberto (RainbowSTORM) para processamento automáticode dados 31,32. Aproveitando essa capacidade, desenvolvemos uma plataforma SMLM multi-laser integrada com detecção espectroscópica e um pipeline dedicado de análise espectral. O protocolo que apresentamos aqui abrange preparação de amostras, aquisição de dados e análise, fornecendo um fluxo de trabalho reproduzível para aproveitar a fluorescência intrínseca do DNA na microscopia de localização de molécula única. Além de possibilitar estudos de prova de conceito em imagem de oligonucleotídeos de fita simples e moléculas de DNA de fita dupla com contraste intrínseco, a abordagem estabeleceu uma base para aplicações mais amplas em imagem de DNA sob condições nativas e sem marcadores, como a predição de sequências baseada na fluorescência intrínseca do DNA combinada com métodos computacionais.

Protocolo

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1. Preparação de amostras de gel de DNA (Figura 1A)

  1. Dissolva a amostra de DNA (oligonucleotídeo ou DNA de fita dupla) em água desionizada livre de nuclease até uma concentração final de 100 mM e armazene a solução padrão a -4 °C.
  2. Prepare alíquotas de 5 μL para minimizar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Se usar aliquotas congeladas, descongele-as em temperatura ambiente por 5-15 minutos, dependendo do volume.
  3. Limpe suavemente uma lâmina de vidro com um lenço de laboratório. Pipete 5 μL da solução de molécula de DNA de 100 mM sobre a lâmina de vidro recém-limpa e deixe evaporar por 1 a 3 horas, formando um gel de DNA.
  4. Opere este passo em uma exaustão por segurança. Prepare o buffer de imagem conforme a Tabela de Materiais. Tanto o buffer β-mercaptoetanol quanto o buffer DABCO foram validados para suportar a troca fotocólica estocástica das moléculas de DNA.
  5. Opere este passo em uma exaustão por segurança. Adicione 5 μL de tampão de imagem ao gel de DNA e coloque um coverslip por cima imediatamente antes da imagem. Pode haver bolhas dentro da amostra coberta. Use uma pinça para remover as bolhas dentro da amostra coberta,

2. Calibração do sistema sSMLM e aquisição de dados (Figura 1B)

  1. Prepare um arranjo de nanoburacos fabricado com diâmetro de buraco de 100 nm e espaçamento de 4 μm, disposto em 8 linhas x 5 colunas para a seguinte calibração do sistema espectroscópicoSMLM 33.
    NOTA: Alternativamente, a tabela de resolução de 1951 (R3L1S4N) da Força Aérea dos Estados Unidos (USAF) também pode ser usada para a calibraçãoespectral 33.
    1. Produzir a matriz de nanoburacos por meio de pulverização sequencial de metal e fresagem por feixe de íons focados (FIB). Primeiro, deposite um filme de alumínio com 150 nm de espessura sobre uma cobertura de vidro borosilicato de 22 x 22 mm usando sputtering DC a 75 W com fluxo de argônio padrão de 20 centímetros cúbicos por minuto (SCCM) a 3 mTorr.
    2. Modele um conjunto de nanofuros de 5 x 8 na camada de alumínio usando fresagem FIB operada a uma tensão de aceleração de 30 kV.
  2. Ligue o sistema espectroscópico SMLM (Figura 2), insira filtros de largura de banda estreita (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm e 750 nm) diretamente à frente da câmera e use uma fonte de luz branca (por exemplo, a lâmpada do microscópio) para iluminar a amostra de calibração.
  3. Colete 10 quadros com cada filtro. Ajuste o tempo de exposição para 532 nm, 580 nm, 633 nm e 680 nm para 200 ms e para 2000 ms para 750 nm devido à baixa intensidade da lâmpada e à baixa eficiência da câmera na região do infravermelho próximo (Figura 3).
  4. Carregue a amostra de gel de DNA no microscópio, certifique-se de que o lado do revestimento esteja voltado para o objetivo e abra o software da câmera para aquisição de dados.
  5. Identifique a posição z apropriada com o auxílio do sistema automático de rastreamento de foco, garantindo que o piscar estocástico claro seja visível. Essa etapa é crítica e requer paciência, pois amostras de gel de DNA carecem de sinais morfológicos óbvios, como estruturas celulares, dificultando a navegação até um sinal adequado.
  6. Certifique-se de que a objetiva não toque na borda do cobertor, pois isso pode causar vazamento de buffer para o óleo de imersão e interferir no rastreamento.
  7. Adquira entre 10.000 e 30.000 quadros com um poder de iluminação típico de 5 kW/cm² e tempo de exposição de 30 ms. Ajuste o número de quadros, a potência de iluminação e o tempo de exposição conforme necessário. Após a aquisição, o software salvará os dados no formato nd2 por padrão.
  8. Após concluir o experimento, descarte a lâmina de vidro em um recipiente aprovado para resíduos de objetos cortantes (por exemplo, caixa de descarte de vidro quebrado ou de objetos cortantes) e descarte todos os tampões restantes no recipiente de resíduos líquidos químicos designados, de acordo com as diretrizes institucionais de segurança.

3. Análise de dados de calibração e espectroscopia (Figura 1C)

  1. Carregue a pilha de imagens brutas adquiridas da amostra de DNA no FIJI (Windows 64-bit), usando o Bio-Formats Plugin.
  2. Subtraia a projeção mínima da pilha para obter um conjunto de dados subtraído de fundo e salve-o para análise espectral. Para a pilha de imagens raw carregada, selecione Image > Stacks > Z Project e escolha Intensidade Mínima no tipo Projeção. Depois, selecione Processar > Calculadora de Imagem para subtrair a projeção mínima da pilha de imagens brutas e salvá-la como um TIFF.
  3. Realize a identificação de localização na pilha de imagens brutas de ordem zero usando o plugin ThunderSTORM (versão 1.3). Use parâmetros apropriados (por exemplo, limiar = 1,2 x std (Onda.F1), sigma = 1,5, raio de ajuste = 3) para reconstruir a imagem de ordem zero e extrair as coordenadas do evento de emissão (unidades: nm). Para a pilha de imagens brutas de ordem zero cortadas, selecione Plugin > ThunderSTORM > Run analysis.
  4. Use o FIJI e o software de código aberto RainbowSTORM (link do GitHub no32, com versão MATLAB mais recente que 2020b) para processar os dados de calibração e obter a relação entre os deslocamentos horizontais e verticais e os comprimentosde onda 31,32.
    1. Realize a identificação de localização nas imagens de calibração dos 5 comprimentos de onda usando o plugin ThunderSTORM. Use parâmetros apropriados (por exemplo, limiar = 5 x std (Onda.F1), sigma = 1,5, raio de ajuste = 3) para reconstruir as localizações dos nanoburacos na ordem zero e suas localizações espectrais correspondentes na primeira ordem.
    2. Ajuste o limite (por exemplo, em uma faixa de 5-10 x std (Wave.F1)) até que haja 80 localizações para cada imagem de calibração.
    3. Execute o RainbowSTORM e clique em Calibração Espectral > Navegue e carregue os arquivos CSV para cada comprimento de onda de calibração (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm, 750 nm) da etapa anterior. Clique em Salvar Arquivo de Calibração.
  5. Converta as coordenadas baseadas em nanômetros em coordenadas de pixel e mapee-as para a janela espectral correspondente com base nos deslocamentos horizontais e verticais da ordem zero para a primeira ordem, determinados na calibração (Figura 4), para medir todo o espectro da fluorescência intrínseca do DNA.
    1. Use scripts Pythonpersonalizados 34 (versão 3.11.7) para extrair os dados do espectro completo com os seguintes passos.
    2. Defina os caminhos corretos dos arquivos para a pilha de imagens subtraídas em fundo (.tiff) a partir da etapa 3.2, o arquivo CSV de localização (.csv) produzido a partir da etapa 3.3 e o arquivo de calibração da etapa 3.4 (.mat).
    3. Use 900-950 pixels como deslocamento horizontal para os dados de 488 nm adquiridos com o DWP 3D, correspondendo a uma janela espectral de 484-588 nm, um pouco mais ampla que a faixa do filtro de 500-550 nm para garantir cobertura.
    4. Use 925-984 pixels como deslocamento horizontal para os dados de 532 nm adquiridos com o DWP 3D, correspondendo a uma janela espectral de 525-750 nm, novamente escolhida para ser mais ampla que a faixa do filtro de 590-650 nm.
    5. Use 23 pixels como deslocamento vertical tanto para os dados de 488 nm quanto para 532 nm com o DWP 3D.
      Os valores acima foram derivados da curva de calibração espectral obtida usando o RainbowSTORM. Os scripts em Python para a medição do espectro completo podem ser encontrados em34.
  6. Linearize o espectro não linear para análises subsequentes (comparação, classificação, etc.) usando um ajuste polinomialde ordem 3 (Figura 3).

Resultados

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O processo completo — desde a preparação da amostra até a aquisição e análise dos dados — para uma pilha de imagens de uma amostra de DNA leva aproximadamente 120 minutos, assumindo que a formação do gel de DNA leva 1 hora (Figura 1). O tempo combinado para descongelamento, formação de gel e calibração espectral é fixado em cerca de 90 minutos, independentemente do número de imagens ou amostras no experimento. Para maximizar a eficiência, recomendamos coletar múltiplas pilhas de imagens em várias amostras em uma única sessão.

Imagens representativas em tempo real obtidas após a DWP são mostradas na Figura 1B e na Figura 3A, onde os sinais de fluorescência são divididos em ordem zero (esquerda, contendo informações espaciais) e primeira ordem (direita, contendo informações espectrais). Na Figura 1B, as imagens foram adquiridas usando a configuração DWP 2D, na qual a separação entre imagens de ordem zero e primeira é relativamente pequena. Em contraste, a Figura 3A mostra dados coletados usando o DWP 3D, onde as duas ordens de difração estão mais amplamente separadas devido à diferença de caminho óptico projetada necessária para a imagem 3D biplana. Todos os dados apresentados nas Figuras 1C, Figura 3 e Figura 4 foram coletados usando a configuração 3D DWP. A escolha entre imagem 2D e 3D depende do objetivo experimental: para medições espectrais de fluorescência intrínseca de amostras de DNA sintetizadas, a DWP 2D é geralmente preferida porque essas amostras não possuem características estruturais tridimensionais relevantes, embora a configuração DWP 3D também possa ser usada quando se deseja informação axial.

Juntos, esses resultados representativos demonstram a capacidade central da plataforma de imagem baseada em DWP para resolver simultaneamente espectros de localização espacial e emissão de moléculas individuais de DNA em tempo real. O desempenho adequado do sistema é indicado pela separação clara e estável entre a imagem espacial de ordem zero e a imagem espectralmente dispersa de primeira ordem, com cada localização de molécula única na ordem zero correspondendo a um traço espectral distinto na primeira ordem. A análise espectral quantitativa é realizada identificando eventos isolados de molécula única na imagem de ordem zero, medindo o deslocamento relativo do pixel do sinal de primeira ordem associado e convertendo esse deslocamento em comprimento de onda usando uma função de mapeamento calibrada. Como a relação entre deslocamento de pixel e comprimento de onda de emissão é não linear, um ajuste polinomial de terceira ordem é aplicado para reconstruir com precisão espectros de emissão lineares a partir de dadosbrutos 28. Os espectros resultantes de molécula única podem ser ainda mais integrados a pipelines de análise computacional, incluindo modelos de aprendizado de máquina ou deep learning, para permitir a classificação espectral e a inferência da composição da sequência de DNA ou da estrutura molecular com base em assinaturas de fluorescência intrínsecas sob diferentes condições de iluminação e estados fotofísicos.

Todos os dados apresentados neste protocolo foram coletados usando o buffer de imagem35 à base de β-mercaptoetanol. Em princípio, qualquer buffer de imagem que aprimore o comportamento de comutação fotográfica do fluoróforo deve ser compatível com essa abordagem, por exemplo, buffer de imagem36 baseado em DABCO. As moléculas de DNA testadas incluem A, G, C, T de fita simples de 20 bases; Corrente alternada simples de 40 bases (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20); Guanine de 5, 8, 12 e 16 bases de cadeia simples; GC e AT de 20 pares de bases (veja a Tabela de Materiais para informações detalhadas). A seleção dos construtos de DNA de 20 e 40 bases baseia-se na observação de que uma cadeia de DNA de 40 bases adota uma conformação compacta com tamanho efetivo inferior a 40 x 3,4 = 13,6 nm, colocando-a abaixo do limite de resolução da imagem SMLM reconstruída. Os comprimentos de onda da excitação (488 nm e 532 nm) não foram otimizados de forma única para sequências específicas, mas sim selecionados para demonstrar que a fluorescência intrínseca do DNA pode ser detectada de forma robusta em diferentes composições de bases e estados conformacionais usando qualquer um dos comprimentos de onda. Testamos o buffer de imagem, conforme mostrado na Figura Suplementar 1 , e constatamos que quase nenhum sinal estocástico de piscar foi detectado, excluindo componentes do buffer e tratamentos de superfície de vidro. Apenas o gel de DNA + o tampão de imagem apresentaram um número significativo de piscadas. As lâminas e coberturas de vidro foram limpas e cuidadosamente manuseadas, enquanto o gel da amostra foi formado em um ambiente fechado. Portanto, é improvável que os sinais detectados provenham de impurezas ou autofluorescência do substrato. Também medimos o sinal do gel de secagem e da solução de DNA, ambos, e não encontramos diferença significativa, então artefatos fotoquímicos durante a secagem não são a principal fonte dos sinais. Produtos de fotodegradação geralmente exibem espectros amplos e não possuem propriedades de piscação, que nunca foram observadas em nosso estudo. Os limites quantitativos de detecção, refletidos pela contagem mínima de fótons das localizações, são de 30 a 50 [contagem de fótons]. Esse valor permanece o mesmo para amostras de DNA e sistemas marcados, como H3K9me3 marcado com AF647 em células fixas. A precisão média de localização da fluorescência intrínseca do DNA é de cerca de 15 a 25 nm, enquanto a AF647 é de cerca de 10 a 15 nm.

No cenário 2D, a imagem SMLM reconstruída tem um tamanho de pixel de 22 nm. A precisão das localizações das emissões estocásticas tem uma média de ~20 nm, o que descreve o intervalo de confiança de onde a molécula individual se localiza. No entanto, as amostras testadas para fluorescência intrínseca não possuem estruturas biológicas, portanto a resolução das estruturas não pode ser interpretada. A microscopia de espalhamento Raman coerente tem uma resolução de 250 a 300nm 37, e a UV de dois fótons tem resolução de 300nm 38. A relação sinal-ruído da imagem coerente por espalhamento Raman está na magnitude de 10 - 10039, enquanto é de 2 a 20 (frequentemente expressa como sinal para ambos o desvio padrão, SSDR) para microscopia UV de 2 fótons 40,41. O SNR para fluorescência intrínseca do DNA usando sSMLM é cerca de 5 devido à baixa contagem de fótons e às limitações impostas pelo ruído de detecção da câmera.

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Figura 1: Fluxo de trabalho com durações estimadas. (A) A preparação da amostra envolve descongelar o estoque, preparar o gel de DNA e adicionar um tampão de imagem. O tempo total varia de 1 a 3 horas, dependendo da amostra e do ambiente. (B) Cada aquisição requer um processo de calibração com uma amostra especialmente projetada por array de nanoburacos. O tempo total de calibração será de cerca de 20 minutos, e o tempo de aquisição de dados para uma pilha de imagens será de cerca de 10 minutos, incluindo busca por amostra (10.000 quadros e tempo de exposição de 50 ms). (C) O pipeline de análise envolve pré-processamento FIJI e análise espectral em Python. O pré-processamento nas FIJI leva cerca de 10 minutos, enquanto a análise espectral é rápida com os códigos estabelecidos. Os espectros apresentados foram coletados a partir de guanina de 16 bases. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Esquema óptico. As quatro linhas de laser (405 nm, 488 nm, 532 nm, 647 nm) são direcionadas ao microscópio invertido por meio de alinhamento a laser, tornando o sistema estável e fácil de operar. O DWP é colocado logo antes da câmera sCMOS, permitindo a detecção espectroscópica de molécula única. Ao calibrar para o DWP, uma roda de filtro será inserida entre a câmera e o DWP. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Calibração espectral. Os comprimentos de onda de calibração usados são 532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm e 750 nm. Ao posicionar sequencialmente filtros de largura de banda estreita com esses comprimentos de onda centrais após o DWP e diante da câmera, os correspondentes deslocamentos horizontais e verticais de diferentes comprimentos de onda podem ser medidos, permitindo o mapeamento de uma curva de calibração entre posição do pixel e comprimento de onda. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Espectros de moléculas selecionadas de DNA de fita dupla e simples fita sob excitação de 532 nm e 488 nm, respectivamente. (A - B) Os espectros não linear e linear de GC_alter, que se referem a um tipo de molécula de DNA de fita dupla, com ambas as fitas como 20-bases 5'-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-3'. O espectro verde destacado mostra a curva média. (C - D) Os espectros não lineares e lineares de A10C10, que se referem a um tipo de molécula de DNA de fita simples, com comprimento de 40 bases e repetidas 10 adeninas e 10 citosina (5' - AAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3'). O espectro azul destacado mostra a curva média. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Experimentos de controle para fluorescência intrínseca do DNA. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos, pela primeira vez, um protocolo para capturar todo o espectro da fluorescência intrínseca do DNA, tanto de moléculas de fita simples quanto de fita dupla, abrangendo o fluxo de trabalho desde a preparação da amostra até a aquisição de dados e análise computacional. Esse protocolo permite a imagem de superresolução sem marcador de moléculas de DNA ao explorar a fluorescência intrínseca em vez de sondas exógenas. Em princípio, essa abordagem poderia ser estendida para células fixas e potencialmente para imagens de células vivas, pois evita marcação química e amplificação baseada em anticorpos. A cromatina dentro do núcleo envolve DNA, RNA e diferentes tipos de proteínas, que é um sistema muito mais complexo do que o gel de DNA. Atualmente, devido à baixa contagem de fótons proveniente das moléculas de DNA, as emissões estocásticas dentro do núcleo em células fixas/vivas são desafiadoras. Mas para os cromossomos isolados, ou núcleo, o sinal de fluorescência intrínseca do DNA foirelatado 16,24,27. No entanto, em sua forma atual, o protocolo é limitado a ambientes in vitro usando amostras de DNA sintetizadas. Em comparação, a marcação de DNA nuclear ou cromatina usando imunocoloração normalmente envolve procedimentos longos em múltiplas etapas — incluindo têmpera, bloqueio e incubações primária e secundária de anticorpos — que podem levar a ordem de várias horas (frequentemente ~5 h por alvo)12,42, introduzindo tanto complexidade experimental quanto potenciais perturbações na estrutura nativa da cromatina. Ao eliminar marcadores exógenos, a imagem baseada em fluorescência intrínseca não só reduz substancialmente o tempo de preparação da amostra, mas também evita perturbações estruturais e erros de ligação associados a sondas fluorescentes volumosas e anticorpos, permitindo assim uma localização mais fiel em escala nanométrica do DNA.

Apesar de sua natureza sem rótulos e simplicidade conceitual, a implementação bem-sucedida desse protocolo exige atenção cuidadosa a vários detalhes experimentais críticos. Por exemplo, durante a preparação da amostra, tempo insuficiente para a formação de gel de DNA reduz o número de localizações individuais detectáveis em comparação com géis totalmente formados. Normalmente, leva cerca de 1,5 h para o gel se formar. Se a solução não estiver totalmente seca, espere um pouco mais. Para um coverslip de 22 x 22 mm, 5 μL de buffer de imagem são suficientes, enquanto um volume maior de buffer pode causar vazamento, o que pode interromper a interface de imersão em óleo do objetivo e afetar negativamente o desempenho da imagem. Se ocorrer vazamento, ele pode ser removido cuidadosamente com um lenço de laboratório. Enquanto focar, eleve gradualmente o objetivo a partir da posição z mais baixa. Após o objetivo engatar o óleo de imersão, utilize-se o modo de ajuste fino para identificar o plano focal com eventos frequentes de emissão estocástica de molécula única. Se grandes aglomerados de gel produzem sinais agregados com espectros de primeira ordem sobrepostos, selecione uma área de imagem alternativa.

Apesar de suas vantagens, esse protocolo possui várias limitações importantes que devem ser consideradas ao avaliar sua aplicabilidade e desempenho. Primeiro, a extração espectral precisa depende de separação espacial suficiente entre eventos individuais de molécula única; Altas densidades de localização, como aquelas que surgem de grandes aglomerados de gel de DNA ou conjuntos macromoleculares densamente compactados, podem levar a traços espectrais de primeira ordem sobrepostos que complicam ou impedem a reconstrução confiável do espectro. Segundo, o método é sensível ao alinhamento óptico e à estabilidade do foco, pois pequenos desalinhamentos do prisma de cunha dupla ou desvios do plano focal ideal podem introduzir erros sistemáticos na calibração do comprimento de onda e reduzir a relação sinal-ruído. Terceiro, o protocolo atualmente não implementa a demixagem espectral, limitando seu uso em amostras com alta densidade molecular ou múltiplas espécies espectralmente sobrepostas. Coletivamente, esses fatores definem o regime operacional prático do método e devem ser cuidadosamente considerados ao estender o protocolo para sistemas biológicos mais complexos ou lotados.

Neste protocolo, o RainbowSTORM é usado apenas para calibração espectral, embora o software também forneça ferramentas poderosas para calibração 2D/3D, análise de dados sSMLM e reconstrução de imagens. Tais ferramentas de análise são bem adequadas para ligar informações de localização espacial com leituras espectrais em imagens espectroscópicas de superresolução e podem ser ainda mais aproveitadas em futuras extensões desse protocolo. Por fim, esse protocolo é potencialmente viável para outros tipos de macromoléculas biológicas 43,44,45, como RNA, tubulina, etc. O espectro detectado pode ser ainda alimentado em modelos computacionais, como os modelos de aprendizadoprofundo 46, para realizar classificação, prevendo assim sequências ou estrutura molecular a partir de espectros intrínsecos sob diferentes iluminações, bem como propriedades fotofísicas. Esse estudo também abre caminho para a imagem de cromatina específica molecular, sem marcador, que evita a marcação externa ou a desnaturalização de estruturas nativas.

Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Agradecimentos

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Essa pesquisa foi apoiada por bolsas R02CA225002, U54CA261694, R01CA289294 e U54CA268084 dos National Institutes of Health e pela bolsa CBET-2430743 da National Science Foundation. Agradecemos ao laboratório do Prof. Hao F. Zhang na Northwestern University pelo dispositivo prisma de cunha dupla como parte fundamental do sistema espectroscópico SMLM.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtro de emissão de 488 nm para imagemChroma Technology Corp.ET525/50M
Filtro passa-banda de 532 nm para calibraçãoThorlabsFL532-3
Filtro de emissão de 532 nm para imagemChroma Technology Corp.ET620/60M
Filtro passa-banda de 580 nm para calibraçãoThorlabsFB580-10
Filtro passa-banda de 633 nm para calibraçãoThorlabsFL632.8-3
Filtro passa-banda de 680 nm para calibraçãoThorlabsFB680-10
Filtro passa-banda de 750 nm para calibraçãoThorlabsFB750-10
Beta-mercaptoetanol & nbsp;SigmaM6250
Buffer de imagem BMENANA7 & mu; L GLOX, 7 e mu; L Beta-mercaptoetanol e 690 & mu; Buffer de glicose L
Catalase do fígado bovinoSigmaC100
DABCO (1,4-di-azobiciclo-(2.2.2.)-octane)SigmaD27802
Buffer de imagem DABCONANA65 mM DABCO+30 mM Sulfito de sódio + 30 mM DTT 1 M  no DNAse, água deionizada livre de RNAse. O sulfito de sódio deve ser dissolvido em PBS 10 vezes; até 1 M antes de criar o buffer de imagem.
Deplex de DNA para SMLM espectroscópicoIDTNA20 pares de bases com fita dupla GC_alter, GC_conti, AT_alter e AT_conti.
Por exemplo, GC_alter tem ambos os fios com 5' - GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC - 3'; GC_conti tem um fio de 5' - GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG - 3' e o outro como 5' - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3'
Todas as amostras estão no padrão HPLC.
DNA oligonucleótido/DNA de fita duplaIDTNA
Oligos de DNA para SMLM espectroscópicoIDTNA20-base A, G, C, T; corrente alternada de 40 bases de fio simples (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20);   Guanina monocatenária de 5, 8, 12, 16 base.
Por exemplo, A10C10 é
5'- AAAAAAAAAACCCC
CCCCCAAAAAAAAAA
AACCCCCCCCCCCC - 3'
Todas as amostras estão no padrão HPLC.
Água Destilada Livre de DNase/RNaseInvitrogen10977015
DTT (DL-Ditiotreitol)Sigma43816
GLOXNANA14 mg de glicose oxidase, 50 e mu; L catalase (17 mg/ml) + 200 e mu; Tampão L A, que é 10 mM Tris (pH 8,0) e 50 mM NaCl. 
Buffer de glicoseNANA50 mM Tris (pH 8,0), 50 mM de NaCl e 10% de glicose.
Glucose oxidasesigmaG7141
Glicose, póThermo Fisher15023021
PBS (10X)Thermo FisherJ62036. K3
PBS (1X)Gibco10010023
Cloreto de sódioThermo Fisher424290010
Sulfito de sódio  SigmaS0505
Tris (1M) pH 8,0InvitrogenAM9856

Referências

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