Artigo de método

Procedimento acessível de vedação de silicone chip-membrana para uma ligação flexível e confiável

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DOI:

10.3791/69980

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20 de março de 2026

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1Department of Pathology and Medical Biology, EXPIRE Lab, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 2GRIAC Research Institute, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Department of Biomaterials and Biomedical Technology, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Tissue Engineering and Cells Therapy Group (GITTC), School of Medicine, University of Antioquia, Alma Mater Hospital of Antioquia, 5Department of Pulmonary Diseases, University Medical Center Groningen, University of Groningen

Neste artigo

Resumo

Um protocolo inovador de vedação para produzir lacres à base de silicone estanques para membranas de dispositivos de chip de Polidimetilsiloxano (PDMS). Destinado a laboratórios, configuração de modelos de chips e desenvolvimento de plataformas de chips em pequena escala. Demonstramos o protocolo usando membranas plásticas e de tecido nativo. Esse procedimento requer apenas PDMS, tolueno, mofo, membrana e uma câmara de vácuo.

Resumo

Plataformas organ-on-chip são um aspecto em rápido crescimento da pesquisa biomédica. A expansão desse campo produziu uma variedade de materiais e metodologias diferentes para sua construção e aplicação. Embora o número de dispositivos diferentes – seja fornecidos comercialmente ou desenvolvidos na academia – continue crescendo, geralmente ainda há um grande passo a ser dado para novos pesquisadores que ingressam no campo de Organ-on-Chip. Uma das questões centrais tanto nas tecnologias inovadoras quanto nas atuais de chips continua sendo a produção de uma vedação segura e sem vazamentos dos dispositivos com chip. Neste artigo, apresentamos um novo caminho para o desenvolvimento de chips ao apresentar um fluxo de trabalho de vedação de chips que produz conexões confiáveis e estanques entre chips de silicone e três membranas de cultura de diferentes materiais. O procedimento apresentado é acessível para desenvolvimento de novos chips com materiais de entrada limitados e fornece uma interface ar-líquido (ALI) Organ-on-Chip. Esses chips são destinados a cultivos celulares alimentados através de uma membrana porosa e expostos apicalmente ao ar, como em um Intestino, Pele ou, como no caso apresentado aqui, Airway-on-Chip. Fornecemos dois diferentes designs 3D de moldes de chip, mostrando sua ligação a membranas plásticas comercialmente disponíveis, bem como a andaimes de matriz extracelular suína (ECM). Este Airway-on-Chip pode ser produzido internamente; os diferentes obstáculos que podem ser encontrados são apresentados aqui, além de uma demonstração do uso anterior deles como Airway-on-Chip. Esse novo procedimento de vedação envolve o vácuo de argamassa de polidimetilsiloxano (PDMS) diluída com tolueno para remover o tolueno, o que resulta em uma camada fina e resistente de silicone embutida na superfície porosa plástica ou da membrana nativa da ECM. A segunda novidade desse procedimento é a cura à temperatura ambiente da argamassa PDMS para evitar a ruptura das membranas devido à diferença de expansão térmica nos materiais que estão sendo selados. Isso leva a uma técnica amplamente aplicável para ligar os materiais testados, produzindo chips PDMS multicâmara com membranas de cultura internalizadas.

Introdução

Dispositivos organ-on-chip estão se tornando uma pedra angular da pesquisa biomédica, com uma grande variedade de modelos comerciais e de acesso aberto sendo desenvolvidos em laboratórios ao redor domundo 1. À medida que esses modelos se tornam parte fundamental da pesquisa, continuando a substituir os tradicionais modelos estáticos de plástico e animais 2,3, é cada vez mais importante que esses modelos estejam facilmente acessíveis e disponíveis para pesquisadores de diversas origens ao redor do mundo. O centro disso é a acessibilidade para alcançar desenvolvimento personalizado em pequenos lotes, independentemente dos custos de insumos efabricação 4, especialmente em modelos não comerciais ouacadêmicos 1.

Um dos maiores desafios das tecnologias On-Chip é produzir uma vedação segura dos chips sem vazamentos durante o fluxo. Uma revisão recente sobre testes de vazamento em dispositivos com chip identificou o vazamento entre as câmaras ou para o ambiente como um dos principais modos para falhas de modelos e experimentais, tanto na indústria quanto na academia 5,6. Existem várias razões para a falha em alcançar uma vedação bem-sucedida: as pequenas dimensões dos dispositivos, o fluxo e a pressão aplicados, e principalmente o fato de que esses dispositivos são compostos por diferentes materiais selados em camadas e conectados por diferentes processos6. A variedade de materiais utilizados como membranas de cultura em plataformas de chip é tão ampla quanto a gama de suas aplicações, incluindo polietileno tereftalato (PET), policarbonato (PC), PDMS e membranasECM 1. Como resultado, existem inúmeros procedimentos e tratamentos diferentes para conectar esses materiais nos dispositivos finais. Esses procedimentos incluem compressão com cola/PDMS, química de silano mediada por plasma, funcionalização química de estruturas, eletrofiação e ligação de solvente vaporizado, dependendo dos materiais envolvidos nomodelo 7. O fato de esses processos exigirem conjuntos de habilidades e ambientes de laboratório diferentes impõe algumas limitações à acessibilidade acadêmica da pesquisa On-Chip. Foi identificado que, embora os custos e limitações de atuar em sistemas comerciais limitem o acesso acadêmico, os longos processos de construção de chips e equipamentos necessários limitam seu desenvolvimento acadêmicoindependente 1,8,9. Na vanguarda desta pesquisa, uma das questões atuais está na padronização e validação de modelos quanto à suareprodutibilidade 10,11. Mas ainda existe uma lacuna para chegar a esse ponto para muitos laboratórios que tentam iniciar o desenvolvimento de chips para responder a questões específicas de pesquisa, substituir trabalhos com animais e trabalhar em modelos mais biologicamenterelevantes 12.

Neste artigo, apresentamos um fluxo de trabalho de vedação de chip que requer apenas habilidades e equipamentos disponíveis na maioria dos ambientes de pesquisa. Esse procedimento produz interfaces chip-membrana PDMS estanques para três materiais diferentes de membrana. O processo requer apenas tempo de trabalho ativo limitado, pode ser realizado em ambientes de laboratório sem chip e pode ser escalado de produção de chips de pequeno a médio lote.

O procedimento de vedação apresentado pode ser realizado com membranas plásticas porosas ou ECM; Os chips de exemplo fornecidos são construídos com esse procedimento para aplicação como dispositivo de via aérea no chip com exposição ao ar. Esse procedimento pode ser usado para outros dispositivos comparáveis, desde que as membranas contenham poros, que são essenciais para o procedimento. A principal aplicação dos chips fornecidos é para cultura ALI e células epiteliais das vias aéreas, mas pode ser usado para outras aplicações e modelos de co-cultura com células mesenquimais ou intestinais, por exemplo 8,13. O primeiro chip fornecido é uma via aérea padrão com uma área de cultivo em grande escala (92mm 2) e duas câmaras de cultura, incluindo uma câmara apical para exposição ao ar, separada por uma membrana porosa da câmara basal que contém meio e, opcionalmente, outro tipo de célula cultivada submersa (por exemplo, fibroblastos, células endoteliais). Para aplicações de ALI, é essencial que as células com semeadura apicalizada sejam capazes de manter uma barreira apertada para evitar o vazamento de meio para o canal superior. O segundo chip tem o mesmo design do primeiro, com duas câmaras adicionais em cada lado da membrana, aqui com o uso de ECM suína, para facilitar o alongamento da membrana de cultura por meio da aplicação de pressão negativa, imitando o alongamento de uma via aérea nativa.

Nosso processo de vedação reúne vários elementos do campo do desenvolvimento de chips PDMS com a adição de novas condições, que são duplas. Primeiramente, a aplicação rápida de vácuo na argamassa PDMS diluída com tolueno, que previne o ataque químico do tolueno nas membranas, promove a intrusão de silicone nos poros ou superfícies da membrana e resulta em uma superfície fina e resistente ao deslocamento. O tolueno produz inchaço e deformação em superfícies sólidas de PDMS, mas em altas concentrações atua como solvente, daí seu uso para diluir PDMS líquido nesse procedimento. Para plásticos como as membranas PC e PET usadas aqui, o tolueno pode causar distorção e rachaduras por estresse se não for removido rapidamente. É essencial que se tenha cuidado, ao aplicar manualmente a argamassa, para aplicar apenas sobre a parede do semi-chip pré-construído e nunca entrar na área de cultivo, pois isso bloqueará os poros das membranas da cultura e produzirá áreas de PDMS que causarão perturbação e variação na capacidade de cultura celular. Em segundo lugar, a cura da argamassa PDMS à temperatura ambiente (RT) durante 72 horas evita o deslocamento da membrana tanto da metade do chip quanto da argamassa, o que pode acontecer à medida que os materiais encolhem em diferentes graus após a expansão térmica.

Fornecemos dois designs de moldes de cavacos que podem ser feitos com impressora 3D ou micro-fresadora (conforme descrito no Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2), além do método para criar uma argamassa fina a partir de PDMS e tolueno14. O uso desse método permite a vedação de membranas plásticas comerciais (PET, PC) dentro de um dispositivo. Além disso, testamos a amplitude de aplicabilidade desse processo criando o mesmo chip com uma membrana ECM nativa suína para produzir um chip biológico com capacidade de estiramento cíclico. Como os Organ-on-Chips têm a intenção de replicar as propriedades fisiológicas do ambiente in vivo , Air-on-Chips que têm a capacidade de produzir as forças mecânicas experimentadas no corpo durante a respiração, como as tensões de cisalhamento do ar em fluxo e a paisagem mecânica das vias aéreas em constrangimento, são altamente relevantesbiologicamente 16. A membrana utilizada consiste na membrana basal, lâmina própria, além de colágeno, laminina e outras proteínas da matriz ao redor. Até onde sabemos, este é o primeiro chip nativo baseado em membrana no embasamento, e o primeiro com possibilidade de esticar, facilitando assim a imitação do estresse mecânico, por exemplo, da respiração, em uma membranaECM 15 sem silicone. Esta aplicação inovadora destaca a função do nosso procedimento de vedação com plástico e ECM. Por fim, apresentamos a aplicação desse procedimento de selagem de chip e membrana como uma via aérea no chip que pode ser usada para cultura celularALI 8.

Protocolo

Este estudo foi isento da aprovação do conselho de ética sob a Lei de Experimentos em Animais, pois os materiais foram obtidos post-mortem e nenhum animal foi sacrificado para fins científicos (Wet op de dierproeven). O protocolo de isolamento das células epiteliais primárias das vias aéreas humanas foi de acordo com o código de pesquisa do Centro Médico Universitário de Groningen (https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg acessado em 14 de janeiro de 2025) e as diretrizes nacionais e éticas profissionais sobre o uso de material corporal humano (https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf acessado em 14 de janeiro de 2025). Este estudo foi isento da exigência de aprovação do conselho de ética, pois o tecido traqueobrônquico era remanescente de transplantes e completamente anonimizado, em conformidade com o Código Civil Holandês e o Wet op de orgaandonatie (lei do doador).

1. Preparação de metade de chip e membrana

  1. Produção de Chips
    1. Baixe. Arquivos de design STL para as metades superior e inferior do chip dos Arquivos Suplementares 1 e Suplementar 2 deste artigo. O molde superior produz uma metade lascada de 5 mm de profundidade, o molde inferior uma metade lascada de 3 mm de profundidade; Ambas as metades do chip possuem câmaras de cultivo de 1 mm de profundidade. Alternativamente, produza um projeto de chip usando um software CAD apropriado.
    2. Prepare um arquivo de corte para impressão 3D ou um caminho de fresagem para micro-fresagem dos moldes de cavacos. Moldes micro-fresados estarão prontos para uso; Moldes impressos em resina exigem duas lavagens de 24 horas com etanol 99,9% antes da reticulação UV para prepará-los adequadamente para uso como molde PDMS.
  2. Produção de metade do chip PDMS (Figura 1)
    1. Misture cuidadosamente a base líquida de PDMS com o agente de cura em uma proporção de 10:1 e desgasifice em uma câmara a vácuo até que todas as bolhas de ar sejam removidas.
    2. Encha os moldes com uma seringa de bico largo, desgase por ~10 minutos em uma câmara a vácuo até que todas as bolhas sejam removidas. Coloque os mofos em um forno seco até curar por 2 h a 65 °C.
    3. Remova as metades sólidas dos moldes com um bisturi e corte a chapa das bordas. Adicione quatro entradas de ar na metade superior em cada extremidade da câmara e os dois anéis adjacentes que indicam a localização das entradas da câmara inferior com um punção de biópsia.
      NOTA: Para os resultados apresentados, foi usado um punção de biópsia de 2 mm e um tubo de silicone de 2 mm foi inserido para o meio e o fluxo de ar durante a cultura. Entradas de 1 mm e 2 mm facilitam a semeadura das células com uma pipeta, correspondendo ao tamanho das pontas de 200 e 1000 μm, respectivamente. Outros tamanhos de punção podem ser usados para diferentes tubos ou sistemas de bombas.
  3. Preparação da membrana (Figura 2)
    1. Baixe. Arquivos de design STL para o estêncil de membrana do Arquivo Suplementar 3 neste artigo. Prepare o estêncil por impressão 3D ou um método de fabricação equivalente para garantir uma forma consistente da membrana.
    2. Coloque o estêncil sobre a membrana PET ou PC, segurando-a firmemente enquanto a membrana é cortada com um bisturi.
      NOTA: Neste ponto, as membranas podem ser revestidas com proteínas matriciais para cultivo celular em uma placa de Petri sem interromper a ligação das membranas. Isso garantirá que apenas a membrana seja funcionalizada para o crescimento celular, deixando as paredes do PDMS livres de células, como descrito anteriormente8.

2. Ligação de membrana

  1. Preparação de Morteiros PDMS
    1. Misture PDMS líquido (passo 1.2.1) com tolueno em uma proporção 7:5 e misture cuidadosamente com seringa para cima e para baixo com uma seringa de bico largo, como descritoanteriormente 14. São necessárias apenas 8 gotas para cada chip; 1,4 mL de PDMS com 1 mL de tolueno é recomendado por lote de argamassa e suficiente para 8 chips dessa escala. A mistura consistente da argamassa é importante para uma ligação de membrana confiável.
      ATENÇÃO: O tolueno é volátil e altamente inflamável. A exposição pode causar danos aos sistemas nervoso e respiratório. Use exclusivamente em uma exaustor, longe de qualquer fonte de ignição, e controle derramamentos com material absorvente e ventilação. Durante o manuseio, use óculos protetores para evitar respingos e luvas impermeáveis (nitril). Deixe todos os materiais de laboratório (pontas de pipeta, recipientes, etc.) por 24 horas na exaustor, após o que o tolueno terá evaporado, e todos os materiais poderão ser descartados em recipientes aprovados e rotulados por meio de serviços especializados em resíduos. Nunca descarte tolueno em uma pia. Consulte a Ficha de Dados de Segurança (SDS) para mais informações.
      NOTA: Prepare a argamassa no ponto de uso para evitar evaporação prematura do tolueno e contaminação plástica, em um recipiente não de vidro, preferencialmente descartável, e descarte diretamente após o uso. O PDMS cura a superfície do vidro e é parcialmente irremovível; O tolueno dissolve e danifica a maioria dos plásticos comumente usados em laboratório.
  2. Fixação de membrana PET/PC (Figura 2)
    1. Aplique rapidamente a argamassa na superfície da metade do chip PDMS onde a membrana será colocada com a ponta de uma pipeta.
      NOTA: Toda a área sob a membrana deve ser molhada com argamassa. Uma fixação firme deve ser aplicada com a ponta para produzir a camada mais fina possível. A microscopia indica camadas entre 3 e 5 μm.
    2. Segure a membrana preparada (passo 1.3) em uma extremidade com um par limpo de pinças, coloque a ponta sobre a argamassa úmida na posição correta para o chip e deixe a membrana cair no lugar.
      NOTA: Não permita que a membrana se desloque após esse ponto; PDMS úmidos entrando na câmara produzirão paredes irregulares e inutilizáveis na membrana. Se ocorrer deslocamento, o silicone cobrirá a área da cultura, o que interromperá o potencial de cultura celular em ambos os lados da membrana, descartará a membrana e repetirá a etapa anterior.
    3. Segure suavemente a membrana no lugar com a pinça e reaplique argamassa PDMS sobre a membrana, afastando-se suavemente da câmara a cada movimento para remover as bolhas e fixar a membrana sem movê-la da posição original.
      NOTA: Cuidado para não aplicar PDMS na área de cultura interna da membrana; Isso é essencial, pois o silicone impede a adesão celular e perturba a superfície natural da membrana da cultura.
    4. Coloque metades de chip com membranas imediatamente após a fixação da argamassa úmida em uma câmara de vácuo e cure-as em temperatura ambiente, abaixo de 25 mBar de vácuo, por 72 horas.
      NOTA: Metades de fragmentos com membranas acopladas devem ser curadas em temperatura ambiente. PET/PC e PDMS apresentam diferentes graus de expansão térmica, e a cura térmica fará com que o silicone se expanda e depois encolha ao esfriar, produzindo uma membrana distendida (Figura 3).
  3. Construção Completa do Chip
    1. Metades do chip com membrana agora podem ser acopladas à segunda metade do chip. Para resultados mais consistentes, exponha ambas as metades ao tratamento com plasmaO2 (320 mBar, 30 s) e pressione-as rapidamente sob leve pressão manualmente.
      ATENÇÃO: Fornos de plasma de oxigênio produzem ambientes saturados de oxigênio, óxidos perigosos como ozônio e radiação UV intensa. Os fornos devem ser instalados em uma área bem ventilada ou com exaustão. A janela do forno deve bloquear toda a radiação UV, mas o uso de óculos de proteção é recomendado. Materiais e metais combustíveis devem ser mantidos fora da área do plasma de oxigênio para evitar combustão acelerada ou liberação de fumaça tóxica. Consultar o documento SDS de plasma de oxigênio é essencial para uso com qualquer material que não seja o mencionado neste protocolo.
      NOTA: Se não houver forno de plasma disponível, uma ligação semelhante pode ser alcançada com uma varinha de plasma ou aplicando argamassa PDMS na segunda metade e curando as metades juntas em temperatura ambiente sob leve compressão por 72 h13. Embora menos eficazes em comparação com um forno de plasma totalmenteO2 , essas opções podem ser usadas quando fornos não estão disponíveis.

Resultados

Teste de Integridade do Selo de Membrana
Para testar a integridade do aparo selado, a câmara superior de cultivo é preenchida com demi-água com corante azul, e a parte inferior com demi-água pura. Lascas são deixadas durante a noite para avaliar possível vazamento de corante azul da câmara superior ao redor da membrana para a câmara inferior.

Chips de silicone totalmente construídos preparados com nosso método podem ser deformados longitudinalmente até 35° sem prejudicar a integridade da membrana, agora revestidos e presos à metade superior com argamassa flexível PDMS em ambos os lados. A deformação dos chips PDMS é uma parte normal do uso, por exemplo, quando as metades ou chips grudam em uma placa de Petri.

Chips foram conectados a um sistema bidirecional de bomba de seringa para testar seu desempenho com pressão induzida pelo fluxo. Chips com membranas PET e PC podem ser operados sem vazamento entre câmaras ou ruptura dos chips até e incluindo 30 kPa (a pressão máxima fornecida pelas bombas). Em estudos anteriores, os chips são normalmente operados a 150 μL/h, o que exerce 0,7 Pa de pressão sobre as câmaras de cadadispositivo 8.

Visualização da ligação de membranas
Para visualizar a intrusão da argamassa líquida de PDMS nos poros de 0,4 μm da membrana sob o microscópio como resultado da vedação a vácuo RT, a argamassa PDMS foi tingida com Vermelho do Nilo. O Nile Red foi escolhido por ser um corante hidrofóbico e que combina bem com PDMS em sua forma líquida. A coloração foi preparada misturando cuidadosamente 1% de Vermelho do Nilo em PDMS líquido para produzir uma cor vermelha sob microscopia óptica. O procedimento de cura RT foi repetido conforme descrito acima. Membranas com argamassa tingida foram embutidas em parafina e seccionadas usando um micrôntomo. Fatias de membrana foram montadas em lâminas de vidro e fotografadas usando um microscópio óptico (Figura 4). Para validar a necessidade tanto de afinar o PDMS em argamassa com tolueno quanto de aplicar um vácuo para a intrusão do PDMS nos poros da membrana, uma comparação das membranas com e sem esses métodos pode ser vista na Figura Suplementar 3.

Teste de Viabilidade Celular
Em um estudo anterior, a potencial toxicidade química pelo uso de tolueno na construção dos dispositivos foi testada. Os chips foram preparados com e sem tolueno em um argamassa PDMS, células epiteliais de Calu-3 do adenocarcinoma pulmonar humano foram cultivadas até confluência ao longo de 2 dias e cultivadas por 1 dia nos chips, conforme descrito anteriormente, 8. A morte celular foi avaliada por coloração azul com Trypan, removendo todas as células do dispositivo e contando células mortas (azuis) contra células viáveis não coradas. A proliferação foi avaliada incubando os reagentes no meio de chip antes de realizar um ensaio AlamarBlue, lendo a absorção fluorescente via leitor de placa, que reflete a proliferação (Figura 5)8.

Fixação de membrana no embasamento ECM
Para mostrar a aplicabilidade geral desse procedimento na produção de ligação forte e flexível com uma variedade de membranas, o protocolo foi repetido com uma membrana totalmente baseada em matriz extracelular (ECM) (Figura 6). Membrana basal contendo andaimes ECM foi preparada a partir de bexigas urinárias suínas conforme descritoanteriormente. Brevemente, bexigas urinárias suínas de fêmeas entre 4 e 8 meses de idade foram obtidas em um matadouro local (Kroon Vlees b.v., Groningen, Holanda) e processadas em até 3 horas após a coleta. O tecido conjuntivo e a gordura foram removidos da bexiga, a bexiga foi virada do avesso para fora, e a camada epitelial foi dissecada e romba, mantendo o tecido no PBS em temperatura ambiente. Os andaimes da ECM foram desidratados para o procedimento de fixação demembranas 17. Andaimes preparados eram cortados e ligados às metades do chip PDMS conforme descrito no protocolo acima. Um novo molde foi produzido com câmaras extras para alongamento da membrana dentro do dispositivo, mostrando que as ligações de silicone a vácuo também suportam tensão mecânica horizontal (Arquivo Suplementar 2).

Teste de Integridade de Membrana ECM
O teste de integridade da vedação de membrana foi realizado conforme acima. Em seguida, o chip de estiramento era acoplado a bombas de seringa, que puxavam um vácuo nas câmaras laterais do dispositivo para produzir 1 mm de estiramento horizontal na membrana da ECM durante a noite (Figura 7).

Diferenciação de células epiteliais e co-cultura de fibroblastos na via aérea padrão com membrana PET
Para validar o desempenho do chip fornecido como via aérea em chip para células ALI, células epiteliais de Calu-3 do adenocarcinoma pulmonar humano (ATCC, Manassas, VA, EUA) foram cultivadas até confluência e expostas ao ar no dispositivo, em um estudoanterior 8. Após 10 dias de exposição ao ar apical, as células epiteliais de Calu-3 podem ser vistas se diferenciando em células produtoras de muco, demonstrado pela produção de muco, medida pela coloração azul alciana (Figura 8)8.

Para validar nosso procedimento para fluxo prolongado sem vazamentos e cocultura, um exemplo pode ser visto em uma publicação anterior; Para a metodologia completa de cultura celular, veja este artigo8. Células epiteliais das vias aéreas humanas foram cultivadas na câmara de cultura apical do chip sob fluxo de ar constante por 21 dias, com fibroblastos primários das vias aéreas cultivados de cabeça para baixo no lado oposto da membrana. Em resumo, células epiteliais primárias das vias aéreas foram isoladas por tratamento com protease (0,2 mg/mL em HBSS, 2 horas, 37 °C), raspagem celular e criopreservação de células removidas do tecido traqueobrônquico remanescente de 3 doadores saudáveis de pulmão, dos quais não havia mais informações disponíveis. Fibroblastos das vias aéreas (FAs) humanos foram isolados da mesma forma a partir do tecido brônquico transplantado de tecido pulmonar de DPOC de um único doador.

Na Figura 9, é possível ver um gráfico do chip e de como as células mencionadas aparecem tanto através quanto ao longo das câmaras do dispositivo.

Cultura de Células Epiteliais em co-cultura com Fibroblastos na membrana ECM
O andaime que contém membrana basal facilita a cultura celular epitelial e mesenquimatosa. Ceratinócitos humanos imortalizados (células HaCaT) foram semeados com uma densidade de 60 x 103 células/cm2 no lado epitelial (interno) da membrana, e a viabilidade foi de 95% após 24h, em comparação com 91% em um frasco plástico de cultura celular (Figura 10A). Em seguida, fibroblastos normais de MRC-5 pulmonares humanos foram semeados a uma densidade de60 x 10 3 células/cm2 no lado estromal (externo) e cultivados em cocultura com as células HaCat por 14 dias para avaliar a viabilidade epitelial-mesenquimatosa a longo prazo para co-cultura na membrana nativa de MEC (Figura 10D). As células epiteliais formaram uma monocamada confluente no lado interno da membrana, enquanto os fibroblastos se distribuíram menos densamente pela superfície externa da membrana da MEC, mas mantiveram sua morfologia característica semelhante a um fuso (Figura 10C). O vídeo de reconstrução 3D pode ser visto no Arquivo Suplementar 417.

O estudo atual apresentou um procedimento aprimorado de vedação de membrana que produz uma forte conexão PDMS-membrana, capaz de resistir a interrupções causadas pelo manuseio manual do chip, permitindo a cultura de longo prazo sob fluxo usando pressões de até 0,7 Pa. Mostramos que essas membranas são ligadas por silicone que penetrou as membranas da cultura através de seus poros, facilitando ligações covalentes de silano entre as duas metades do chip e a argamassa PDMS a vácuo. Além disso, o procedimento apresentado não induz citotoxicidade, desde que a argamassa seja aplicada corretamente. Além disso, os chips produzidos facilitaram coculturas epiteliais mono- e epitelial-mesenquimatosas de longo prazo. Embora esse procedimento seja aplicável apenas a membranas porosas, ele continua sendo um procedimento de baixa entrada para a produção de chips ALI confiáveis e prontos para cultivo celular.

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Figura 1. Gráficos da produção de metade do chip PDMS e preparação de membrana. Para a produção de metade do chip PDMS (etapa 1.2), os moldes de cavacos são preenchidos com PDMS líquido com uma seringa de bico largo, 4,4 mL no molde superior e 2,4 mL no molde inferior. As metades do PDMS são curadas por 2 horas a 65 °C, após o que 4 entradas na metade superior do chip são perfuradas nas extremidades da câmara e nos pontos indicados no molde. Para a preparação da membrana (passo 1.3), o estêncil impresso de membrana é firmemente fixado na superfície da membrana. Usando uma nova lâmina, se corta ao redor do estêncil e se remove a membrana do fragmento do material ao redor. As membranas podem ser revestidas para cultura celular ou usadas diretamente na etapa 2. Criado no BioRender. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2. Procedimento de ligação de membrana. A argamassa PDMS é misturada conforme descrito acima imediatamente antes do uso. A argamassa é pingada nos quatro cantos ao redor da câmara de cultura e espalhada suavemente ao redor do local de ligação da membrana com a extremidade inclinada de uma pipeta. Uma extremidade da membrana é colocada sobre a argamassa e, uma vez alinhada com a câmara de cultura, é deixada suavemente para se encaixar. A argamassa é reaplicada em sentido gotejante e pintada sobre as bordas da membrana, com muito cuidado para que nenhum silicone toque a superfície da membrana dentro da área de cultivo. Membranas ligadas à metade do chip são imediatamente colocadas em uma câmara de vácuo para remover microbolhas, garantir a invasão de silicone na superfície e nos poros, e remover o tolueno para minimizar o ataque químico à membrana. Criado no BioRender. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3. Exemplos de colocação de membranas. (A) Colocação bem-sucedida da membrana, cura na RT. (B) Ligação da membrana curada em forno (65 °C em vez de RT), a membrana pode ser vista como se distendendo para dentro da câmara à medida que o silicone contraía após o aquecimento. (C) Chips completos com posicionamento correto das membranas PET e PC. (D) A colocação incorreta da membrana fará com que o volume de cada lado do chip mude com o movimento da membrana, causando fluxo variável, aplicando tensão às células dentro do chip, bem como às bombas conectadas ao chip. Criado no BioRender. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4. Imagens de microscópio óptico de membranas PET e PC cortadas e montadas. Mostrando a invasão de silicone nos poros da membrana como resultado do nosso procedimento de cura RT a vácuo. (A) Imagens da mesma membrana sem PDMS aplicado à membrana, poros claros podem ser vistos, assim como uma superfície limpa na imagem polarizada. (B) A argamassa PDMS foi tingida com Vermelho do Nilo, e o silicone pode ser visto em magenta invadindo com sucesso os poros e revestindo finamente a superfície sob vácuo. Destacado em formas brancas/magenta. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 5. A viabilidade das células nos dispositivos de chip não foi alterada pela construção com ou sem tolueno como agente diluente na argamassa PDMS. Células de Calu-3 foram semeadas a 6,5 × 104 células por chip e, ao atingir a confluência, foram incubadas durante a noite antes de um ensaio AlamarBlue ser realizado no sobrenadante e TrypanBlue nas células. As diferenças entre os grupos (n=4) preparados com e sem tolueno foram testadas pelo teste t de Student desparelado, p > 0,05 = ns (não significativo)8. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 6. Chips de membrana no porão. (A) A integridade da membrana falhou, pois a argamassa PDMS/tolueno não foi aspirada rápido o suficiente; Isso danificou as proteínas da matriz e prejudicou a vedação do chip. (B) A vedação de membrana e chip teve sucesso, mas a membrana foi selada em estado solto. (C) Vedação bem-sucedida de membrana e chip, o chip é funcional para fluxo e estiramento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 7. Duas imagens do chip ECM esticado. (A) Lascar em repouso. (B) Lascar abaixo de 1,2 mm de extensão horizontal. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 8. Azul alciano (núcleos em magenta, muco em azul) coloração das células epiteliais Calu-3 pulmonares humanas crescidas nos chips após exposição ao ar no dispositivo. Células de Calu-3 foram cultivadas até a confluência e cultivadas por 10 dias sob uma vazão contínua de 150 μL/h no compartimento basal e expostas ao meio ou ao ar pelo lado apical. O fluxo foi produzido com uma bomba peristáltica dentro de uma incubadora a 37 °C e 5% deCO2. Ao final do cultivo, as membranas foram removidas e tingidas. Vista transversal da coloração Alcian Blue de células de Calu-3 cultivadas por 10 dias submersas (A) e expostas ao ar (B)8. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 9. Visualização das células epiteliais humanas primárias e fibroblastos em cocultura estendida dentro do dispositivo. Fibroblastos das vias aéreas foram semeados no dispositivo e deixados se fixar durante a noite antes de inverter o aparelho e semear células epiteliais do outro lado da membrana. As células foram cultivadas até confluência, expostas ao ar e cultivadas por 21 dias sob uma vazão contínua de 150 μL/h produzida com uma bomba peristáltica dentro de uma incubadora a 37 °C e 5% deCO2. As membranas foram removidas após a cultura, fixadas, embutidas e montadas em lâminas antes da coloração. Células epiteliais foram coloridas para Mucin 5AC (MUC5AC)18, um componente do muco, e para a proteína da caixa de cabeça de garfo J1 (FOXJ1)19, um fator de transcrição envolvido na sinalização para a produção de cílios. Fibroblastos foram corados com aglutinina germinativa de trigo (WGA) para visualizar as bicamadas celulares de fosfolipídios. As células foram incubadas com 5 μg/mL em HBSS por 15 minutos e lavadas três vezes com PBS antes da imagem. Todos os núcleos celulares foram visualizados com DAPI. (A) Vista em seção transversal: produzida a partir de uma projeção em Z-stack de imagens de (B) e (C). (B) Coloração epitelial MUC5AC/FOXJ1/DAPI em uma membrana de chip. (C) Estrutura externa completa da camada de fibroblastos na câmarabasal 8. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-10
Figura 10. Viabilidade celular e cocultura no andaime da membrana basal. (A) viabilidade viva/morta das células HaCaT semeadas no lado epitelial, 3 amostras independentes foram testadas, 3 campos aleatórios foram capturados de cada amostra (n = 3). Foi realizado um teste ANOVA unidirecional comum com correção de Tukey. O gráfico mostra a média com o desvio padrão. Cocultura de (B) células HaCaT no lado epitelial e (C) fibroblastos pulmonares MRC-5 no lado estromalical do andaime contendo membrana basal cercados por fibras de colágeno, barras de escamas de 50 μm. (D) Vista 3D da cocultura de vistas isométricas superiores e inferiores, barras de escala de 100 μm, visualização animada pode ser encontrada na Figura Suplementar 4. (E) Espessura do andaime da membrana basal antes e após a descelularização, 14 mucosas foram medidas e, dessas, 6 (representadas por triângulos) foram retiradas para descelularização. Em cada uma das amostras, três campos aleatórios foram escaneados e pelo menos 10 pontos por campo foram medidosna medida 17. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1. Designs de moldes de chip para as metades superior e inferior do chip padrão PET/PC. (A) Imagem do molde inferior do chip que pode ser produzido a partir do . STL no Arquivo Suplementar 1. (B) Imagem do molde superior do chip que pode ser produzido a partir do . STL no Arquivo Suplementar 2. (C) Imagem do estêncil de membrana para cortar membranas para o chip que pode ser produzido a partir do . STL no Arquivo Suplementar 3. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2. Designs de moldes de lascas para as metades superior e inferior do chip de membrana ECM estretch. (A) Imagem do molde inferior do chip que pode ser produzido a partir do . STL no Arquivo Suplementar 4. (B) Imagem do molde superior do chip que pode ser produzido a partir do . STL no Arquivo Suplementar 5. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3. Validação do procedimento de vedação: comparação da intrusão de PDMS nos poros sem tolueno para reduzir a viscosidade da argamassa e curada em RT sem vácuo. Todas as condições são com membranas PET (poros de 0,4 μm); após o tratamento com PDMS (Vermelho do Nilo 1%), as membranas foram incorporadas na parafina antes da montagem e da imagem ao microscópio óptico. (A) PDMS não diluído aspirado sobre uma membrana PET. Uma camada espessa de PDMS pode ser vista na superfície da membrana, enquanto nenhum PDMS pode ser observado tendo entrado nos poros (destacada com caixas brancas). (B) Armamga PDMS diluída aspirada sobre uma membrana PET. Uma camada de PDMS pode ser vista na superfície da membrana, enquanto nenhum PDMS pode ser observado tendo entrado nos poros (destacada com caixas brancas). (C) Argamassa PDMS diluída aspirada sobre uma membrana PET. Uma fina camada de PDMS pode ser vista na superfície da membrana, assim como a intrusão nos poros ao longo da membrana (destacada com caixas brancas). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4. 3D visualização de células de cocultura HaCat (epiteliais) e MRC-5 (estromalas) no andaime ECM porcina. Uma vista 3D animada da cocultura a partir das vistas isométricas superiores e inferiores, cujas imagens podem ser vistas na Figura 10D, as barras de escala são 100 μm. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 1. 3D . Arquivo STL do molde inferior. O molde pode ser usado para produzir a metade inferior do chip padrão por impressão 3D ou por um método de fabricação equivalente. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2. 3D . Arquivo STL do molde superior. O molde pode ser usado para produzir a metade superior do chip padrão por impressão 3D ou por um método de fabricação equivalente. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 3. 3D . Arquivo STL do estêncil de membrana. O estêncil pode ser usado para produzir membranas do tamanho correto para o chip fornecido e pode ser produzido por impressão 3D ou por um método de fabricação equivalente. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 4. 3D . Arquivo STL do molde inferior do chip stretch. O molde pode ser usado para produzir a metade inferior do fragmento de estiramento por meio de impressão 3D ou de um método de fabricação equivalente. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 5. 3D . Arquivo STL do molde superior do chip elástico. O molde pode ser usado para produzir a metade superior do fragmento de estiramento por impressão 3D ou por um método de fabricação equivalente. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O protocolo de vedação de chips que fornecemos aqui representa uma nova forma de produzir vedações de chip de membrana PDMS à prova d'água, viáveis para cultivo a longo prazo em fluxo, que podem ser produzidas com equipamentos limitados e não exigem habilidades especializadas para serem abordadas. Mostramos o procedimento para produzir pastilhas de chip com membranas (PET, PC, ECM) ligadas à superfície com argamassa de silicone, e mostramos que a aplicação rápida de vácuo facilita a intrusão do PDMS nos poros e através da superfície das membranas plásticas. Também mostramos que os chips resultantes são bem selados e capazes de uma ampla variedade de aplicações em cultura.

Existem várias formas diferentes de abordar a ligação PDMS-plástico, uma estratégia comum devido às propriedades benéficas para a cultura celular de PDMS, como permeabilidade ou padronização a gás, e membranas plásticas para sua viabilidadeem cultura celular 7. Essas incluem ativação superficial com plasma deO2, Corona ou tratamento com ozônio, que facilita a formação de ligações covalentes entre silicone ouvidro 20. Caso contrário, técnicas de colagem química usando organosilanos como APTES ((3-Aminopropil)trietoxisilano) ou MPTMS ((3-mercaptopropil)trimetoxisilano) permitem funcionalizar a superfície dos dois materiais adicionando gruposreativos 21. Alternativamente, PDMS e substratos plásticos podem ser colados com um método adesivo envolvendo epóxi ou outrosadesivos 22. Apresentamos um híbrido entre ativação superficial e colagem química, com o uso de membranas porosas e vácuo para produzir uma conexão física através da membrana, que pode ser ligada apenas pela ativação superficial do plasmaO2. Ao afinar o PDMS com tolueno, permitimos a invasão do PDMS através dos poros de uma membrana sob vácuo, o que permite que diferentes membranas sejam ligadas covalentemente por ligações PDMS-PDMS entre as metades do chip e a membrana embutida na argamassa. Ao produzir uma rede física de silicone através desses poros, evitamos a necessidade de tratamento químico superficial ou calor e pressão fornecidos por uma máquina de relevo quente, o que frequentemente auxilia nessastécnicas.

No estudo atual, é fornecido um chip de grande escala com duas câmaras (Arquivo Suplementar 1) que pode ter uma variedade de funções. Em segundo lugar, um chip capaz de alongamento horizontal cíclico (Arquivo Suplementar 2). Esses dispositivos funcionam como uma via aérea no chip, enquanto o modelo também pode ser usado como um gut-on-chip, como mostradoanteriormente no número 13. Principalmente, um guia passo a passo é fornecido com diversas opções para produção de moldes, preparação de membranas e construção de chips, que podem ser aplicadas a plataformas de chips inovadoras adicionais, de acordo com a aplicação desejada pelos pesquisadores. Recomenda-se usar um forno plasmaO2 para a vedação final. No entanto, um dispositivo de plasma portátil ou compressão manual com argamassa PDMS também tem sido bem-sucedido para essa etapa24. Neste protocolo para este procedimento de vedação, os principais obstáculos e especificações foram destacados em cada ponto. Essas incluem a opção de pré-aplicar as membranas, a importância do uso imediato da argamassa PDMS/tolueno, a importância de que a argamassa não entre na área de cultivo e a importância de que a membrana não se mova após a conexão com a argamassa.

A reprodução desse procedimento de vedação foi repetidamente realizada por investigadores com um protocolo escrito; apenas as seguintes clarificações foram necessárias para o sucesso do selamento em uma segunda tentativa. Após ocorrerem vazamentos durante testes de estresse ou cultivos celulares prolongados, algumas opções podem ser exploradas. Primeiro, o pesquisador deve garantir que a argamassa seja feita fresca a partir de líquido de PDMS que ainda não começou a curar e que esteja bem misturada com tolueno. A baixa viscosidade da argamassa é o que permite uma camada fina e lisa que pode fluir para os poros da membrana à medida que o ar é aspirado. Em segundo lugar, é preciso aplicar argamassa suficiente para cobrir toda a parte inferior e superior da membrana; embora excesso faça com que ela flua para a área de cultivo sob compressão, muito pouca deixará espaços que criam uma rota para vazamentos entre as câmaras. Em terceiro lugar, as membranas devem ser planas antes e durante a fixação. Por fim, apesar do esforço manual envolvido, os aparos devem permanecer em grande parte livres de sujeira para garantir uma ligação final total, portanto, trabalhar rápido e limpo é essencial.

Embora tenhamos demonstrado a fixação de três tipos diferentes de membranas porosas neste artigo, a função desse método para outras membranas não pode ser prevista. Isso ocorre porque diferentes resistências químicas ao tolueno, assim como outras densidades e tamanhos de poros, afetam o resultado desse procedimento de vedação. No entanto, mostramos a primeira ligação de membrana totalmente baseada em ECM, que pode ser estretchada e totalmente baseada em ECM, o que sugere alta versatilidade do protocolo. No entanto, a consistência do desempenho da estiração não foi verificada de forma confiável, pois diferentes regiões das membranas do basamento, órgãos e fontes podem produzir diferenças mecânicas. Além disso, a viabilidade das membranas de ECM para cultivo celular também tende a mudar ao longo do tempo, tanto em cultura quanto em armazenamento19. Embora esse procedimento funcione para diferentes membranas e configurações de lascas, exige que a pintura manual da argamassa seja eficaz, o que leva relativamente pouco tempo, mas será mais eficaz com modelos em escala maior, como os que fornecemos. Por fim, enquanto o processo de ligação de membrana exija apenas PDMS, tolueno, uma membrana e uma câmara de vácuo, a vedação final do chip depende da aplicação de plasmaO2 , que não está disponível universalmente.

Apesar das limitações, o protocolo fornecido é inovador e não requer habilidade especializada para ser abordado. Até onde sabemos, a produção de redes de silicone através dos poros da membrana, por meio do vácuo da argamassa PDMS de baixa viscosidade, é a primeira do tipo. Ao contrário de outras pontes funcionais químicas ou mecânicas entre os diferentes materiais subjacentes a um chip funcional, essa solução é possível na maioria dos ambientes laboratoriais.

Divulgações

Os autores não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo consórcio Precision Medicine for More Oxygen (P 4O 2), além de financiamento do Stichting Proefdiervrij. Minha mais profunda gratidão a Isadora Kraguljac pela ideia de usar o tinte Nile Red, pois ele se misturaria com o PDMS para visualização das redes de silicone, e a Marjan Reinders-Luinge por seu talento em cortar e montar as membranas. Os autores expressam seus mais profundos agradecimentos ao departamento de Análise Farmacêutica e à Sabeth Verpoorte por fornecerem acesso ao seu Forno de Plasma de Oxigênio; o processo não teria sido possível sem ele.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de 2mL de nariz largoBD Emereld307727
Punção de Biópsia de 2mmMedicina da KAIBP-20F
Linha celular Calu-3ATCCHTB-55RRID:  CVCL_0609
HBSS (Solução Salina Balanceada de Hanks)Gibco14170112
O2 Forno de plasmaHarrick PlasmaPDC-002
Membranas de Cultura Celular Gravada com Trilha PCipCELLCULTURE1000M25/620N403/47
Membranas de cultura celular gravadas com trilha PETipCELLCULTURE2000M23/610N403/47
Base e agente de cura de Polidimetilsiloxano/Sylgard 184 Elastômero de siliconeDow CorningDOWC25100445
Polimetacrilato de polimetil (8mm)ColltecN/A
Resina Fotopolimérica Padrão (Cinza)(1kg)ElegooN/A
TolueneMerck 1,08,325
Câmara de vácuoFisherScientific12080253

Referências

  1. Ugodnikov, A., Persson, H., Simmons, C. A. Bridging barriers: advances and challenges in modeling biological barriers and measuring barrier integrity in organ-on-chip systems. Lab Chip. 24 (13), 3199-3225 (2024).
  2. Singer, M., Akhtar, A. With What Should We Replace Nonhuman Animals in Biomedical Research Protocols. AMA J Ethics. 26 (9), E701-E708 (2024).
  3. Reardon, S. Beyond lab animals. Science. 389 (6761), 676-679 (2025).
  4. Qiu, J., Li, J., Guo, Z., Zhang, Y., Nie, B., Qi, G., et al. 3D Printing of Individualized Microfluidic Chips with DLP-Based Printer. Materials (Basel). 16 (21), 6984(2023).
  5. Survey on reliability of microfluidics-based devices and components. , The Microfluidics Association. https://microfluidics-association.org (2025).
  6. Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. , (2022).
  7. Nahak, B. K., Mishra, A., Preetam, S., Tiwari, A. Advances in organ-on-a-chip materials and devices. ACS applied bio materials. 5 (8), 3576-3607 (2008).
  8. Rae, B., Vasse, G. F., Mosayebi, J., van den Berge, M., Pouwels, S. D., Heijink, I. H. Development of a Widely Accessible, Advanced Large-Scale Microfluidic Airway-on-Chip. Bioengineering (Basel). 12 (2), 182(2025).
  9. Nizamoglu, M., Joglekar, M. M., Almeida, C. R., Larsson Callerfelt, A. K., Dupin, I., et al. Innovative three-dimensional models for understanding mechanisms underlying lung diseases: powerful tools for translational research. Eur Respir Rev. 32 (169), 230042(2023).
  10. Piergiovanni, M., Leite, S. B., Corvi, R., Whelan, M. Standardisation needs for organ on chip devices. Lab Chip. 21 (15), 2857-2868 (2021).
  11. Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. 10, 958582(2022).
  12. Cameron, T. C., Randhawa, A., Grist, S. M., Bennet, T., Hua, J., Alde, L. G., et al. PDMS Organ-On-Chip Design and Fabrication: Strategies for Improving Fluidic Integration and Chip Robustness of Rapidly Prototyped Microfluidic In Vitro Models. Micromachines (Basel). 13 (10), 1573(2022).
  13. Rae, B., Bood, V., Dijk, H. J., Vasse, G. F., Melgert, B. N., Nagelkerke, A., et al. Interorgan Communication Between Lung and Colorectal Epithelial Cells Studied Using a Novel Multi-Organ-On-Chip System. Compr Physiol. 15 (5), e70051(2025).
  14. van der Helm, M. W., Odijk, M., Frimat, J. P., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C. T., van den Berg, A., et al. Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance. J Vis Exp. (127), e56334(2017).
  15. Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Mater Today Bio. , (2022).
  16. Nawroth, J. C., et al. Breathing on chip: Dynamic flow and stretch accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. Materials Today Bio. 21, 100713(2023).
  17. Ramirez, J. A., Estrada, S., Harmsen, M. C., Sharma, P. K. Development of an in vitro platform for epithelial-stromal interactions: A basement membrane-containing scaffold from decellularized porcine bladders. Matrix Biol Plus. 26, (2025).
  18. Bonser, L. R., Erle, D. J. Airway mucus and asthma: the role of MUC5AC and MUC5B. Journal of clinical medicine. 6 (12), 112(2017).
  19. Yu, X., et al. Foxj1 transcription factors are master regulators of the motile ciliogenic program. Nature genetics. 40 (12), 1445-1453 (2008).
  20. Lu, C. Surface modification of polyimide fibers for high-performance composite by using oxygen plasma and silane coupling agent treatment. Textile Research Journal. 92 (23-24), 4899-4911 (2022).
  21. Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. F. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
  22. Borók, A., Kristóf, L., Attila, B. PDMS bonding technologies for microfluidic applications: A review. Biosensors. 11 (8), 292(2021).
  23. Tang, L., Nae, Y. L. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab on a Chip. 10, 1274-1280 (2010).
  24. Young, A. T., et al. Simple design for membrane-free microphysiological systems to model the blood-tissue barriers. Organs-on-a-Chip. 5, 100032(2023).

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