Ensaio de Migração de Glioblastoma 3D Reproduzível com Localização Magnética de Esferoides Mediadas por Nanopartículas sob Condições Hipóxicas

Resumo

Apresentamos um modelo de migração de glioblastoma 3D usando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes geradas a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes. Esta plataforma permite visualização da dinâmica de migração específica do paciente e avaliação da eficácia terapêutica. O ensaio pode ser multiplexado após a migração para avaliar a localização e os padrões de expressão da proteína.

Resumo

Descrevemos um ensaio de migração 3D reprodutível para modelar o potencial migratório e invasivo de glioblastomas glioblastomas derivados de pacientes a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes sob condições hipóxicas clinicamente relevantes. Gliomasferas de tamanho uniforme são transferidas para uma fina camada de matriz extracelular e co-cultivadas com nanopartículas magnéticas de óxido de ferro, que possibilitam sua localização centralizada dentro dos poços de cultura por meio da colocação em um suporte de placa magnética. A inclusão de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro na semeadura facilita imagens precisas e localizadas de gliomasferas individuais derivadas de pacientes por meio de uma força magnética suave e otimiza os pipelines automatizados de processamento de imagens ao reduzir a variabilidade posicional. Este ensaio apoia o estudo detalhado do comportamento migratório de glioblastoma em um microambiente fisiologicamente relevante e permite a comparação direta do potencial invasivo e do comportamento migratório entre gliomasferas recém-diagnosticadas e derivadas de pacientes recorrentes. O método é compatível com imagens de células vivas e análise multiplexada, oferecendo uma plataforma escalável para investigação pré-clínica da migração de glioblastoma, potencial invasivo e resposta terapêutica.

Introdução

O glioblastoma continua sendo um dos desafios mais significativos na neurooncologia. Essa doença é impulsionada por extensa heterogeneidade entre pacientes e entre pacientes, robusta evasão da resposta ao padrão de cuidado, resistência à indução apoptótica e notável plasticidade em resposta às condições^ambientais. Mais recentemente, a complexidade do microambiente tumoral (TME) ganhou considerável atenção, especialmente a natureza dinâmica das células-tronco tipo glioma (GSCs), que podem mudar fenótipo e estado celular em resposta a mudanças^{microambientais 2,3}. Essa plasticidade fenotípica promove a progressão tumoral e contribui para a recorrência inevitável, apesar do tratamento agressivo padrão de atendimento de linha de frente. A resseção cirúrgica continua sendo a intervenção mais eficaz para melhorar o prognóstico do paciente, porém, devido à natureza altamente infiltrativa e microscópica invasiva do glioblastoma, a remoção completa do tumor não é possível⁴. Modelar a dinâmica invasiva de amostras de pacientes em vários estágios da doença e em condições específicas de tumores facilitará uma compreensão mais profunda da capacidade dinâmica e plástica da migração do glioblastoma e, portanto, ajudará a identificar abordagens de tratamento novas e^{eficazes 5}. Portanto, desenvolver modelos fisiologicamente relevantes que capturem dinâmicas específicas de invasão e migração de pacientes é essencial para aprimorar a pesquisa pré-clínica e avançar nesses objetivos. Além disso, tais modelos são fundamentais para avaliar a eficácia de novas terapias antitumorais, que em teoria poderiam ser desenvolvidas para uso em combinação com cirurgia para prevenir invasões microscópicas residuais e, em última análise, reduzir o risco de recidiva. A complexidade do glioblastoma justifica a necessidade de modelos pré-clínicos complexos avançados que possam recapitular características arquitetônicas tumorais chave. Modelos tridimensionais derivados de pacientes ganharam maior atenção por sua capacidade de preservar interações célula a célula, manter gradientes de nutrientes, oxigênio e agentes terapêuticos, e replicar a integridade estrutural dos tumores^{nativos 6,7}. No entanto, visualizar esses modelos 3D apresenta desafios técnicos, incluindo posicionamento dos esferoides, variabilidade de imagem e reprodutibilidade do ensaio.

Aqui, descrevemos um modelo específico de migração 3D de glioblastoma realizado em condições hipóxicas, permitindo a investigação da dinâmica migratória entre amostras derivadas de vários subtipos tumorais de pacientes e estágios da doença, incluindo amostras tumorais com e recorrentes de tratamento. Esta plataforma permite a avaliação de respostas diferenciais a agentes terapêuticos e suporta análise multiplex pós-migração por segmentação de imagens, possibilitando avaliação quantitativa da dinâmica da migração, crescimento esferoide e expressão proteica. A incorporação de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro permite a centralização consistente dos esferoides dentro de cada poço aplicando uma força magnética^{suave 8}. Esferoides cultivados em placas multipoço padrão frequentemente apresentam tendência a se deslocar em direção às bordas dos poços, um comportamento que acredita-se ser influenciado pela formação de meniscos líquidos e evaporação periférica, especialmente em poços no perímetro^{das placas 9,10,11}. Esses fenômenos introduzem artefatos de imagem e ruído de fundo, especialmente durante a microscopia de luz transmitida, o que pode complicar a imagem em intervalo de tempo das dinâmicas de invasão. Ao contrário das culturas monocamada 2D, onde regiões de densidade celular uniforme podem ser selecionadas para imageamento, ensaios de invasão de esferoides únicos exigem posicionamento preciso e consistente de toda a área esferoide e migratória dentro do campo de imagem. Isso adiciona um desafio adicional, pois desvio ou posicionamento irregular dentro do poço pode comprometer a qualidade e a reprodutibilidade dos dados. Portanto, centralizar consistentemente os esferoides dentro das placas multipoço minimiza esses desafios e melhora não apenas a qualidade da imagem, mas também a consistência experimental, os pipelines de processamento de imagem e as análises pós-migração. Além disso, iniciar culturas esferoides em densidades celulares uniformes nessas placas especializadas promove a formação de esferoides reprodutíveis, reduzindo a variabilidade na morfologia, taxa de crescimento e integridade^{estrutural 10,11}. Na prática, gliomasferas típicas usadas nesses ensaios variam de 150 a 300 μm de diâmetro, formando-se reprodutivelmente sob densidades celulares padronizadas. As culturas são mantidas sob condições hipóxicas (1%–2%_O2).

A plataforma descrita aqui suporta formatos de média a alta produtividade, como placas de 96 poços, permitindo múltiplas réplicas por amostra de paciente, e é escalável para triagem de medicamentos ou ensaios multicondição¹² . Otimizar o posicionamento dos esferoides e as condições de cultura é, portanto, essencial para aumentar a robustez e a relevância clínica dos modelos pré-clínicos 3D usados para estudar o potencial invasivo de glioma e outros processos celulares dinâmicos.

Protocolo

Células de glioblastoma derivadas do paciente foram fornecidas pelo Erasmus MC, Roterdã, Holanda, e pelo Hospital for Sick Children (Toronto, Canadá). As amostras primárias de origem para esses cateteres foram obtidas como parte de ressecações rotineiras de pacientes sob seu consentimento informado (números de aprovação ética, MEC-2013-090, 0020010404).

1. Preparação de gliomasferas derivadas de pacientes magnéticos (Figura 1)

1. Pelo menos 30 minutos antes da dissociação da gliomasfera, aliquota suficiente meio enzimático de descolamento celular e meio da gliomasfera para o experimento (tipicamente 1 mL por frasco T75 confluente) e leve ambos à temperatura ambiente.
2. Em condições estéreis, colete gliomasferas do frasco de cultura por aspiração suave usando uma pipeta sorológica e um auxílio de pipeta de 10 mL e transfira-os para um tubo cônico de 15 mL. Centrifuge a 300 x g por 3 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem mexer na célula.
3. Resuspenda o pellet em 1 mL de meio enzimático de descolamento celular à temperatura ambiente e incube por 10–15 minutos, agitando suavemente a cada 2-3 minutos pipetando com uma pipeta P1000 para facilitar a dissociação em uma suspensão unicelular.
4. Adicione um volume igual de meio da gliomasfera para desativar a enzima. Centrifuge a suspensão de célula única a 300 x g por 3 minutos a 37 °C, depois ressuspenda suavemente a célula em 3–5 mL de meio completo da gliomasfera, dependendo do tamanho da pelota, observando o volume exato usado para a contagem celular subsequente.
   NOTA: O tempo de incubação do meio enzimático dependerá em grande parte do tamanho das gliomasferas em cultivo, sempre inspecione visualmente antes do uso e adote de acordo.
5. Pegue uma alíquota representativa de 10 μL da suspensão de célula única e misture suavemente com 10 μL de Trippan Blue em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Carregue 10 μL dessa mistura em um hemocitômetro ou em um contador automático de células para determinar células viáveis.
6. Semear 500 células de glioblastoma simples por poço em uma microplaca esferoide de 96 poços de fixação ultra-baixa. A densidade ideal de semeadura pode variar entre amostras de pacientes.
7. Adicione 1 μg/mL de Iodeto de Prodídio (PI) e 0,05 μL de nanopartículas de óxido de ferro por poço (por exemplo, use 1,5 μL de nanopartículas magnéticas para 20 esferoides, correspondendo a aproximadamente 10.000 células individuais). Certifique-se de que as nanopartículas de óxido de ferro sejam homogeneizadas antes da adição, pipetando para cima e para baixo com um P100 ajustado para 100 μL.
   NOTA: O volume de nanopartículas de óxido de ferro utilizado pode ser otimizado dependendo da linhagem celular utilizada, porém, neste caso, 1,5 μL por 10.000 células foi suficiente para localizar centralmente os esferoides. Essa configuração garante tamanho consistente de esferoides entre amostras de pacientes, facilitando a comparação direta das dinâmicas de invasão e crescimento durante o ensaio de invasão.
8. Incubar placas por 48 horas em uma incubadora de cultura celular umidificada a 37 °C, 5% de_CO2 e 21%_O2 para permitir a formação da gliomasfera.

Figura 1: Gliomasferas de tamanho uniforme e localização co-cultivadas com nanopartículas de óxido de ferro. (A) Gliomasferas derivadas de tumores recém-diagnosticados e recorrentes de pacientes exibem fenótipos duais e associações aleatórias célula a célula. (B) Representação esquemática da formação de esferoides de tamanho uniforme dentro de 48 horas após a semeadura. (C) Imagens transmitidas de luz de gliomasferas cultivadas por 48 horas em microplacas esferoides com fundo arredondado sem (painel superior) e com nanopartículas de óxido de ferro (painel inferior). Note a aparência escura e salpicada de gliomasferas contendo nanopartículas de óxido de ferro. (D) Posicionamento da gliomasfera mostrando localização aleatória de gliomasferas cultivadas sem nanopartículas (topo) em comparação com a localização central consistente daquelas cultivadas com nanopartículas (base), resultando em redução do ruído de fundo e melhoria da qualidade da imagem. Barra de escala = 100 μm. Esquema feito usando Biorender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Preparação de placas multipoço revestidas por matriz extracelular (ECM) (1 h antes do ensaio de migração)

1. Aliquot e armazene o ECM conforme as instruções do fabricante. Descongele uma alíquota de 1 mL de ECM (diluição 1:10) lentamente sobre gelo durante a noite a 4 °C. Imediatamente antes do banhamento, prepare uma solução final de trabalho em 1:100 (v/v) realizando uma diluição adicional de 1:10 do estoque 1:10 em meio completo de neurosfera gelado. Mantenha o ECM diluído no gelo o tempo todo para evitar polimerização prematura. Sempre mantenha essa diluição no gelo, pois a ECM polimeriza rapidamente em temperatura ambiente.
2. Dispense 50 μL da solução de trabalho ECM 1:100 em cada poço de uma placa de 96 poços, transparente, de fundo plano ou μClearbottom. Incube a placa a 37 °C por pelo menos 1 hora para permitir que o ECM assente e forme uma matriz fina em cada poço.
3. Após a incubação, remova cuidadosamente 30 μL de cada poço, deixando 20 μL de ECM polimerizado (concentração final 1:100 v/v) revestindo o fundo de cada poço. A ECM deve ser mantida o mais fria possível durante esse período, pois polimeriza rapidamente à temperatura ambiente. A placa de imagem também pode ser pré-resfriada e armazenada no gelo durante esse processo.
    

3. Configuração de placas de imagem e imagem de células vivas

1. No dia do ensaio (48 h após a semeadura da gliomasfera), coloque a microplaca revestida com ECM sobre um acionamento magnético de 96 poços, como mostrado na Figura 2B,C. Esterilize a placa magnética borrifando com etanol 70% e secando, não deixe de molho.
2. Inspecione visualmente os esferoides quanto à qualidade e uniformidade. Usando uma pipeta, transfira 80 μL de meio contendo a gliomasfera única de cada poço e pipete suavemente sobre a placa com a superfície do ECM.
   NOTA: Para esferoides particularmente grandes, tome cuidado para minimizar o esforço de cisalhamento durante a transferência; isso pode ser feito cortando 1-2 mm da ponta de uma pipeta P100 com tesoura para alargar a abertura e reduzir danos mecânicos. Certifique-se de que as tesouras tenham sido esterilizadas sob UV antes do uso. O mais importante é minimizar a adição de bolhas de ar, pois isso tem grande impacto na imagem.
3. Trate esferoides de acordo com o desenho experimental. Prepare as soluções de tratamento nas concentrações desejadas em volumes de 20 μL, depois adicione esses 20 μL a cada poço contendo os esferoides para alcançar um volume final de 100 μL.
   NOTA: Tratar as gliomasferas dessa forma reduz a pipeteação e minimiza o risco de remover os esferoides do poço.
4. Transfira a placa, permanecendo no acionamento magnético, para o sistema de imagem para imagens ao vivo. Tenha cuidado ao remover a placa do suporte magnético e mantenha-se o mais reto possível para minimizar o movimento dos esferoides do centro do poço.
5. Realize imagens ao vivo usando um microscópio programável de célula invertida equipado com uma objetiva Plan-Apochromat 5x/0,35 NA, uma lente tubular 0,5x, uma câmera Axiocam 506 (binning = 2) e usando o software Zen 3.1 (Blue Edition). A calibração de pixel para micrômetro está embutida no sistema de imagem e é gerenciada automaticamente pelo software, portanto, não é necessária calibração manual. Nesse caso, realize a imagem com uma ampliação de 2,5x (objetivo 5x com lente tubular de 0,5x), com a câmera agrupada para 2 x 2, resultando em uma calibração de 1 pixel = 3,645 μm.
6. Ajuste os controles ambientais para que haja 1% de oxigênio e 5% de CO₂ , com uma taxa de fluxo de ar muito lenta do misturador de gás. Isso ajuda a evitar a evaporação indesejada quando o ar que entra é passado por uma garrafa umidificante.
7. Para evitar o deslocamento da gliomasfera durante o período inicial de imagem, reduza a aceleração e a velocidade do estágio do microscópio para 10%, minimizando o movimento pela superfície da ECM antes da adesão esferoide.
8. Carregue suavemente a placa multipoço sem acionamento magnético no microscópio. Se aplicável, certifique-se de que o material da placa seja selecionado no software para garantir que a ótica esteja ajustada para corresponder.
9. Use uma ampliação adequada que abrange todo o campo de visão invasivo. Por exemplo, no Cell Discoverer 7, a objetiva 5x e a lente de tubo 0,5x foram selecionadas para obter uma ampliação de 2,5x.
10. Localize cada gliomasfera, foque e atribua uma posição que inclua as coordenadas x-y-z. O autofoco por hardware, se disponível, deve ser usado para garantir imagens consistentes do mesmo plano focal durante todo o experimento.
11. Verifique tanto o contraste do gradiente de fase (luz transmitida) quanto os canais de fluorescência e ajuste o tempo de exposição e a intensidade da luz para garantir que não haja superexposição. Excite iodeto de propidium (coloração de células mortas) usando um LED de 590 nm. Colete a emissão usando um filtro passa-banda quádrupla, capturando a faixa de comprimento de onda de 618–756 nm. Isso pode variar em outros microscópios, dependendo dos filtros e da fonte de luz presente.
12. Configure para tirar imagens a cada hora durante o número desejado de dias.

Figura 2: Descrição do sistema de placas de imagem. (A) Diagrama esquemático representando o protocolo descrito. (B) Imagem da placa multipoço adjacente ao acionamento da placa magnética e montagem simples da placa multipoço sobre a acionamento magnético, com cada ímã individual localizado no centro de cada poço, facilitando a localização da gliomasfera. Esquema feito usando Biorender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Fixação de esferoides após ensaio de invasão para análise de proteínas multiplexadas (Figura 3)

1. Após a conclusão do ensaio de invasão, lave cada poço com 100 μL de PBS. Isso elevará o volume para 200 μL/poço. Repita essa etapa removendo posteriormente 100 μL de PBS e substituindo por mais 100 μL de PBS.
2. Remova cuidadosamente 200 μL de meio, depois adicione 100 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% em cada poço e incube por 10 minutos em temperatura ambiente sob uma exaustora de fumaça.
   ATENÇÃO: O paraformaldeído é um produto químico tóxico, e deve haver cautela para minimizar riscos ou exposições.
3. Após a fixação, remova o PFA de cada poço e lave 3 vezes com PBS, removendo o PFA e adicionando 100 mL de PBS a cada vez.
4. Adicione manchas imunes conforme as instruções do fabricante. Alternativamente, para armazenamento a longo prazo, adicione azida de sódio (0,02%) ao PBS para manter a esterilidade e sele a placa com um filme transparente. Armazene a 4 °C até ser necessário.

Figura 3: Análise representativa de proteínas após o ensaio de migração de gliomasferas localizadas no centro versus na borda do poço. Microscopia confocal de varredura a laser de gliomasferas recorrentes imunocoloradas com um anticorpo direcionado ao marcador de células-tronco CD44 do glioblastoma após o ensaio de migração. CD44-FITC (verde) e Hoechst (núcleos, azul). Barra de escala = 100 μm. Pontas de flecha indicam a borda do poço. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

5. Pipeline de processamento de imagens da dinâmica de migração derivada do paciente

NOTA: Pela experiência com nosso conjunto de dados, recomendamos que o computador processador tenha um processador multicore com alta frequência base de núcleo e uma quantidade substancial de memória, pois o processamento WEKA se adequa muito bem a um alto número de núcleos e fará uso da memória disponível dependendo do tamanho do conjunto de dados.  Especificação usada e recomendada conforme listado abaixo.  Note que o processamento por GPU não é utilizado por esse fluxo de trabalho.
CPU: >= 6 núcleos | >= 2 GHz (recomendado); 32 núcleos | 2,1 GHz (usado)
Memória: > 32 GB (recomendado); 192 GB (usado)

1. Open^{Fiji 13} [atualmente, o executável ImageJ-win64.exe incluído é usado para análise]. Abrir imagem navegando para – Arquivo > Abrir Selecionar arquivo de imagem multicanal e multi-cena em time-lapse (.czi) aberto na Interface Fiji (se estiver usando o script, este é o Arquivo Suplementar 1).
2. Selecione as imagens necessárias na interface gráfica. Funciona melhor se as gliomasferas mais invasivas do experimento treinarem inicialmente o classificador (ou seja, poço de controle – DMSO), pois essa imagem fornecerá detalhes sobre cada segmento da imagem, ou seja, a aparência das células invasoras/migratoras versus esferoide versus fundo.
3. Depois, navegue até Imagem > Cor > Canais Divididos – isso separa a imagem em dois canais – um, neste caso, com coloração de Iodeto de Prodídio e outro com luz transmitida.
4. Selecione o canal para segmentação – neste caso, o canal de luz transmitida, que representa a dinâmica de migração. Navegue até Plugins > Segmentação > Segmentação WEKA Treinável¹⁴.
5. Renomear as duas classes padrão para: Classe 1: Gliomasfera; Classe 2: Invasão/Migração. Adicione uma terceira classe chamada Background (opcional, mas recomendada) navegando até Configurações > Nova classe > Background.
6. Usando a ferramenta Freeline, anote regiões de treinamento dentro de cada pilha e classe de imagens desenhando nas regiões representativas, ou seja, desenhe um redemoinho no esferoide e clique em Adicionar ao Esferoide , repita isso para a área de invasão e o fundo até que todas as regiões estejam representadas em cada classe. Treine o classificador clicando em Train Classifier. Imagens adicionais podem ser anotadas para treinar ainda mais o classificador e melhorar a precisão, se necessário.
7. Quando satisfeito, salve o modelo treinado do classificador usando um nome de arquivo como CellLine_Treatment_Classifier.model. Feche a janela de segmentação quando estiver concluída.
8. Para novas imagens usando esse classificador salvo, acesse Plugins > Segmentation > Trainable WEKA Segmentation >Load Classifier> Open Saved Classifier CellLine_Treatment_Classifier (isso salva um arquivo .model . É um dos requisitos para o Arquivo Suplementar 2 ter isso preparado antes da execução do script. Quando o script é iniciado, o arquivo de exemplo apropriado deve ser selecionado).
9. Navegar para obter probabilidade na interface de segmentação Trainable WEKA - Isso produz mapas de probabilidade para cada classe selecionada, ou seja, Gliomasfera, Invasão/Migração, Background, indicando a probabilidade de que cada valor de pixel atribuído à imagem pertença à classe ou região específica da imagem. Isso gerará um arquivo com 3 imagens separadas de mapas de probabilidade (Gliomasphere, Invasion, Background) com faixa dinâmica de 32 bits para cada imagem.
10. Selecione o mapa de probabilidade correspondente a Invasão/Migração. Navegue até Imagem, > Hyperstacks > reduzir a dimensionalidade. Selecione Manter Fonte.
11. Desmarque os Canais , mas mantenha os Quadros – isso reduz o mapa para um único canal ao longo do tempo – neste caso, o mapa de probabilidade de Invasão. Selecione o mapa de probabilidade correspondente à Gliomasfera.
12. Repita os passos 5.10-5.11. Agora haverá dois mapas de probabilidade correspondentes à imagem original transmitida de luz em time lapse para uma cena da área de migração e da área esferoide. Salve ambos com a seguinte convenção de nomes de arquivo: ImageName_Scene_Gliomasphere_ProbabilityMap e ImageName_Scene_Invasion_Probability Map em uma pasta correspondente ao experimento selecionado, ou seja, CellLine_Treatment.
13. Defina o limite para criar uma máscara binária: Vá em Imagem > Ajuste > Limite. Escolha um método de limiar (por exemplo, Yen, Otsu). Mantenha o método selecionado igual em todas as imagens processadas.
14. Navegue para analisar > definir medidas. Selecione as medidas desejadas; Área do carrapache, Densidade Integrada e Média, então pressione Ok. Navegue para Analisar > Analisar Partículas. Para Invasão/Migração, tamanho do conjunto: 0 – infinito; circularidade: 0,00 – 1,00. Para gliomasferas, tamanho definido: tipicamente, 1500 – Infinito (ajuste conforme necessário com base no tamanho do esferoide na linhagem/tratamento celular – as esferas de controle naturalmente crescem maiores); circularidade: 0,05 – 1,00. Selecione unidades de pixels para todos.
15. Navegar para Analisar>Analisar Pixels> Mostrar: Selecionar máscaras. Após a geração das máscaras, verifique a área segmentada de interesse em toda a pilha de timelapse para garantir um rastreamento preciso. Aplicar operações binárias via Processo > Binário > ... (por exemplo, selecionando Preencher Buracos ao refinar a máscara esferoide), seguido de navegar para Analisar > Analisar Partículas > Mostrar > Selecionar Nada e selecionar Resumir. Isso fornecerá uma janela resumida das medidas selecionadas.
16. Salve os resultados clicando em Arquivo > Salvar Como > Resultados. Salve como um arquivo .csv. Abra em planilha ou outro software de análise.
17. Repita o limiar e a análise de partículas para todas as classes segmentadas (por exemplo, gliomasferas, invasão) para extrair as respectivas medições ao longo do tempo.  A .csv de saída fornece área (em pixels ou micrômetros dependendo da calibração) ao longo do tempo.
18. Selecione o canal de fluorescência que representa a coloração PI (por exemplo, canal 2).  Aplique limiar e análise de partículas como acima para identificar células mortas. Use o plugin Calculator Plus para multiplicar máscaras de células PI-positivas pela máscara da gliomasfera e separadamente pelas máscaras de invasão para quantificar células mortas nas regiões específicas.
19. Exporte máscaras, mapas de probabilidade e tabelas resumidas como arquivos TIFF e CSV com nomes claros e descritivos para documentação e análise posterior. Ao usar o script fornecido no suplemento, pode-se encontrar a seguinte convenção de nomenclatura: por exemplo, FileName_Scene#_(PI-)Invasion_Summary.csv (dados de objetos ao longo do tempo), FileName_Scene#_(PI-)Invasion.zip (regiões definidas com analisar partículas).
    NOTA: O Arquivo Suplementar 1 gerará arquivos tif únicos com imagens em timelapse para cada cena. O Arquivo Suplementar 2 executará a classificação de pixels WEKA baseada em um arquivo de modelo de classificação pré-definido em todas as cenas e imagens de cada time lapse, fornecendo mapas de probabilidade para a Gliomasfera e também para as células invasoras. O Arquivo Suplementar 3 segmentará todas as imagens em Gliomasferas e células invasoras, quantificando as áreas cobertas, bem como a partição das áreas cobertas por células mortas (PI-positivas). O Arquivo Suplementar 4 para executar assume um método de limiar específico e também uma região específica a ser analisada, enquanto o Arquivo Suplementar 3 permite ao usuário definir o limite e ajustar a região para cada cena. O limiar não deve ser alterado para métodos diferentes para cada cena, mas pode ser definido para métodos diferentes para cada objeto.

Figura 4: Desafio no processamento de imagens reprodutíveis devido à má segmentação da gliomasfera. Pipeline de processamento de imagem usando o plugin de segmentação WEKA treinável em Fiji mostrando (A) gliomasfera centralizada com maior segmentação da área de migração em relação ao fundo versus (B) gliomasfera localizada na borda, resulta em segmentação de imagem ruim e replicação inutilizável. Ao garantir consistência na localização da gliomasfera, o processamento de imagens entre réplicas biológicas aparece como mostrado em (A), melhorando muito a reprodutibilidade e automação do ensaio. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

Utilizando o ensaio de migração 3D descrito em condições hipóxicas, gliomasferas de tumores recorrentes foram tratadas com veículo ou com o Medicamento X, e a dinâmica de invasão foi monitorada a cada h por 72 horas. A Figura 5 descreve a análise de segmentação WEKA da dinâmica de invasão, revelando que o Medicamento X reduz significativamente o potencial invasivo das gliomasferas recorrentes em comparação com controles veiculares sob condições hipóxicas clinicamente relevantes.

Para avaliar ainda mais o impacto do Fármaco X nas características das células-tronco após a migração, gliomasferas foram fixadas e imunoscudadas para a expressão e localização do marcador de células-tronco do glioblastoma CD44, conforme mostrado na Figura 6. Essa análise multiplexada facilita a visualização da dinâmica de migração e da expressão de marcadores de células-tronco, fornecendo insights sobre como o Fármaco X modula tanto o potencial invasivo quanto as propriedades semelhantes ao estalo de modelos recorrentes de glioblastoma sob condições hipóxicas clinicamente relevantes.

Figura 5: O ensaio de migração otimizado destaca a eficácia do novo Medicamento X na prevenção da migração recorrente da gliomasfera. O paciente derivou gliomasferas recorrentes tratadas com veículo ou Medicamento X por 72 horas em condições hipóxicas. Dinâmicas de invasão foram capturadas a cada h por 72 horas. (A) Imagens representativas transmitidas da dinâmica da invasão em 0 h e 72 h no painel superior - Veículo tratado e painel inferior - Droga X tratada. (B) Mapas de probabilidade representativos da área de invasão usados na análise de segmentação. (C) Gliomasferas recorrentes tratadas com o Medicamento X apresentaram potencial invasivo significativamente menor do que gliomasferas tratadas por veículos. A quantificação da área invasiva às 72 horas revelou diminuição significativa da invasão em gliomasferas tratadas com o Fármaco X, representadas como área total coberta no momento da fixação. Os dados representam a área de invasão ao longo do tempo a partir de n=3 réplicas independentes. A significância estatística foi avaliada usando um teste t sem pareamento; p < 0,005 é indicado por **. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Migração e expressão de marcadores de células-tronco após o tratamento. As gliomasferas descritas na Figura 5 foram fixadas após a migração e imunocoloradas usando um anticorpo direcionado ao marcador de células-tronco do glioblastoma CD44 após tratamento com veículo ou com o Fármaco X. Esta figura demonstra o tipo de análise multiplexada pós-migração que pode ser realizada usando técnicas padrão de imunocoloração. Imagens mostram CD44-FITC (verde) e Hoechst (núcleos, azul). Barra da escala = 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Resalvando arquivos CZI multiscene do microscópio como uma única cena como arquivos TIF.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Gerando mapas de probabilidade usando um modelo Weka.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Análise de segmentação sem limiar. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Análise de segmentação com limiar. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Modelar a dinâmica invasiva de tumores altamente agressivos, como o glioblastoma, é fundamental para melhorar nossa compreensão dos processos da doença e identificar estratégias de tratamento mais eficazes. A natureza complexa, adaptativa e plástica da migração celular do glioblastoma exige modelos pré-clínicos que possam capturar com precisão os comportamentos dinâmicos das células individuais do glioma enquanto migram da massa tumoral central. Importante destacar que modelar esses processos em amostras derivadas de pacientes de diferentes estágios da doença permite que os pesquisadores enfrentem melhor o desafio da heterogeneidade tumoral e identifiquem quaisquer mudanças específicas de estágio na dinâmica da invasão.

Dada essa complexidade, é razoável supor que modelos pré-clínicos devem possuir um nível equivalente de sofisticação. Aqui, descrevemos um método refinado para gerar gliomasferas derivadas de pacientes de tamanho uniforme, co-cultivadas com nanopartículas de óxido de ferro. Essa abordagem permite a localização controlada das gliomasferas no centro de cada poço, possibilitando a imagem automatizada de células vivas da dinâmica de invasão. Vários estudos destacaram variabilidade significativa no tamanho, formato e cinética de crescimento dos esferoides ao usar métodos convencionais de cultura 3D. Sayde e colegas demonstraram que os esferoides podem apresentar amplas distribuições de diâmetro entre aqueles derivados de populações de células-tronco cancerígenas não classificadas e separadas, refletindo a variabilidade inerente na formação dos^{esferoides 15,16}. Essa heterogeneidade também foi identificada como uma fonte importante de problemas de reprodutibilidade em ensaios de triagem de drogas baseados em esferoides, enfatizando ainda mais a importância de gerar populações esferoides^{homogêneas 12}. Esses achados ressaltam a necessidade de padronizar as condições de formação de esferoides antes de realizar análises funcionais, desafios que esse método aborda diretamente. Ao padronizar tanto o tamanho quanto a posição dos esferoides, esse método melhora significativamente a reprodutibilidade e minimiza a variabilidade tipicamente associada a sistemas de cultura celular 3D, onde a formação desigual de esferoides pode afetar a análise a jusante.

Durante o desenvolvimento inicial deste ensaio, observamos uma variabilidade substancial na localização dos esferoides entre réplicas, exigindo o uso de um grande número de poços por experimento, mas também de muitas réplicas biológicas para obter resultados estatisticamente significativos. Isso não só aumentou substancialmente a carga de trabalho, mas também gerou uma quantidade significativa de dados inutilizáveis, reduzindo a eficiência e a reprodutibilidade do ensaio. A variabilidade resultante, portanto, refletia a perda de dados quantificáveis, e não diferenças no comportamento de invasão. Ao centralizar gliomasferas dentro de cada poço, a localização magnética garante que imagens de todas as réplicas possam ser segmentadas e analisadas de forma consistente, mesmo onde diferenças biológicas na dinâmica de invasão são observadas entre as amostras.

A incorporação de nanopartículas de óxido de ferro introduz uma força magnética suave que centraliza consistentemente as gliomasferas em todos os poços, melhorando significativamente o desempenho do pipeline de processamento de imagens, do processamento de dados e das análises pós-migração, sem afetar a biologia ou a viabilidade da^{gliomasfera 8}. Uma vantagem chave desse sistema é sua compatibilidade com a análise multiplexada pós-migração; por exemplo, a Figura 6 representa a análise da visualização do marcador de células-tronco do glioblastoma CD44, o que permite a avaliação da expressão de células-tronco após migração e tratamento entre amostras de pacientes. Essa capacidade destaca o potencial da plataforma para estudos integrativos que relacionem fenótipos invasivos a características moleculares, uma consideração importante dada a plasticidade fenotípica das células-tronco semelhantes ao glioblastoma em resposta a sinais microambientais e sua capacidade de evitar o tratamento, promovendo a inevitável recorrência tumoral.

Embora este ensaio melhore muito a reprodutibilidade da visualização da dinâmica de invasão de esferoides únicos, permanecem algumas limitações críticas que devem ser consideradas para otimização futura do ensaio. Matrigel é um modelo amplamente utilizado de membrana basal, porém é um substituto complexo e indefinido da matriz extracelular (MEC) derivado de sarcomas murinos, que não recapitula totalmente o microambiente cerebral^{humano 17}. A otimização futura do ensaio poderia incorporar modelos específicos de ECM para cérebro para melhor imitar o microambiente do tumor cerebral, o que acreditamos ser um passo imperativo de otimização dos modelos de invasão cerebral in^{vitro 18,19}. Embora o Matrigel continue sendo um modelo amplamente adotado de MECE, ele representa uma matriz extracelular não específica do cérebro derivada de sarcoma murino. Assim, não recapitula totalmente as propriedades bioquímicas e mecânicas do microambiente cerebral humano. Importante destacar que a estratégia de localização magnética descrita aqui é independente da matriz e pode ser facilmente adaptada a sistemas de ECM específicos do cérebro em estudos futuros para aumentar ainda mais a relevância fisiológica.

Outras considerações do ensaio são os potenciais requisitos para treinar um novo modelo de segmentação WEKA para cada linhagem celular devido à heterogeneidade da amostra e variabilidade na morfologia da invasão. Além disso, tanto a densidade de semeadura quanto a concentração de nanopartículas devem ser otimizadas para cada linhagem celular e tipo de esferoide, a fim de manter uniformidade e viabilidade antes da realização de ensaios de migração de alta produtividade. Apesar dessas limitações, essa plataforma oferece uma estrutura escalável e adaptável para estudar a invasão específica de glioblastoma e a resposta ao tratamento. Sua compatibilidade com imagens de células vivas, pipelines automatizados de segmentação e análise pós-ensaio multiplexada abre oportunidades para uma triagem de alto conteúdo de terapêuticas inovadoras, terapias combinadas e estudos mecanicistas de invasão a partir de amostras altamente heterogêneas de tumores de pacientes. Além disso, estender esse ensaio para sistemas de cocultura, como células cerebrais residentes como astrócitos, neurônios e microglia ou modelos de interações entre barreiras hematoencefálicas e modelos de interações entre barreiras hematoencefálicas fornecem insights adicionais sobre as interações estromas tumorais que impulsionam a progressão e recorrência do glioblastoma.

Várias etapas técnicas foram identificadas durante o desenvolvimento do ensaio como determinantes críticos da reprodutibilidade e do desempenho geral do ensaio. Padronizar a densidade de semeadura das linhagens celulares antes do ensaio garante que o tamanho inicial da gliomasfera seja consistente, o que permite que a dinâmica do crescimento dos esferoides seja comparável entre linhas celulares, tratamentos e condições. Sem essa etapa de padronização, os tamanhos iniciais dos esferoides adicionarão um nível significativo de variabilidade, que pode refletir respostas variáveis das gliomasferas às condições experimentais. A localização central precisa das gliomasferas dentro de cada poço é um requisito fundamental para aquisição automatizada de imagens e segmentação a jusante com precisão. Esferoides descentrados resultavam em ruído de imagem substancial e impedem o uso da segmentação WEKA como meio de segmentar as imagens em regiões claramente definidas. Ao garantir que todas as gliomasferas estejam localizadas no centro, o mesmo classificador WEKA pode ser usado várias vezes, à medida que o ruído é substancialmente reduzido e a qualidade da imagem melhora drasticamente. Uma representação disso é mostrada na Figura 1. A incorporação de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro é, portanto, um método para garantir a localização central das gliomasferas, minimizando a variabilidade posicional e melhorando substancialmente o processamento e a comparabilidade da imagem entre réplicas. Por fim, o treinamento do modelo de segmentação dentro do pipeline WEKA representa uma etapa crítica adicional de padronização. Devido à heterogeneidade entre pacientes e às diferenças na morfologia da invasão, um único modelo de segmentação pode não generalizar para todas as amostras. Retreinar ou refinar parâmetros de classificação para cada linhagem celular garante mapas de probabilidade precisos de áreas invasoras e previne erros de quantificação.

No geral, este ensaio fornece uma plataforma reprodutível e escalável para estudar os comportamentos invasivos dinâmicos de amostras de glioma derivadas do paciente em tempo real. Sua compatibilidade com imagens multiplexadas e análises moleculares posteriores a torna uma ferramenta poderosa e versátil tanto para pesquisas básicas quanto translacionales sobre glioma, o que aumentará significativamente a relevância translacional dos modelos pré-clínicos de glioblastoma.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
KIT DE BIOIMPRESSÃO DE 96 POÇOS, TRANSPARENTE	Greiner	655840
Accutase	Invitrogen	00-4555-56	N/A
Suplemento B-27 (50X), soro  livre sem vitamina A	Gibco	12587010	10%
Fator de Crescimento Básico de Fibroblastos, Humano & nbsp; (bFGF)	PeproTech	100-18B	20  ng/ml
Celldiscoverer  7	Zeiss	-
Microplacas Esferoides de Corning	Corning	CLS4515
Matriz Matrigel de Corning	Corning	354234	diluição final 1:100
Contador Automático de Células Countess	Invitrogen	-
DMEM-F12  (500ml)	Termofischer	11320-074	N/A
Fator de Crescimento Epidérmico Humano (EGF)	PeproTech	AF-100-15	20  ng/ml
FITC Mouse Anti-Human CD44	BD Pharmingen	555478	1:100
Microplacas de cultura celular de poliestireno Greiner CELLSTAR 96 Poço com fundo F/Poço de chaminé, e micro; Transparente, preto, TC, estéril, com tampa	Greiner	655090
Heparine	Termofischer	A16198	5µ G/ml
Hoechst 33258	Sigma Aldrich (Merck)	861405	1µ G/ml
NanoShuttle-PL	Greiner	657841	1,5  & micro; 1/10.000 células
Penicilina - Estreptomicina	Merck	P4333	1%