Artigo de método

Isolando cardiomiócitos ventriculares de um modelo camundono de cardiotoxicidade por doxorrubicina

DOI:

10.3791/70411

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27 de fevereiro de 2026

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1Advanced Institute for Medical Sciences, Dalian Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Xi'an Jiaotong University, 3East China Normal University Health Science Center

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve um método reproduzível, livre de Langendorff, para isolar cardiomiócitos ventriculares adultos de camundongos viáveis a partir de um modelo de cardiotoxicidade induzido por doxorubicina. Emprega perfusão antegrade direta do ventrículo esquerdo, seguida de digestão enzimática controlada para produzir miócitos em forma de bastonete, tolerantes ao cálcio, adequados para análises estruturais, moleculares e funcionais.

Resumo

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A doxorrubicina (DOX) é um medicamento quimioterapêutico eficaz cuja aplicação clínica é limitada por uma cardiotoxicidade progressiva e dose-dependente, que afeta predominantemente o miocárdio ventricular. Estudar mecanismos de lesão celular nesse contexto requer isolamento confiável dos cardiomiócitos adultos, um processo tecnicamente desafiador em corações doentes ou estruturalmente frágeis. Aqui, descrevemos um protocolo simplificado e reprodutível sem Langendorff para isolar cardiomiócitos ventriculares funcionais de camundongos com cardiotoxicidade induzida por DOX. Após estabelecer o modelo DOX em camundongos C57BL/6, o coração é rapidamente excisado e a aorta é clampada ex vivo. A perfusão antegrade não recirculante é realizada diretamente através do ventrículo esquerdo usando tampões livres de cálcio e contendo enzimas. A dissociação mecânica suave do tecido ventricular digerido gera cardiomiócitos individuais, seguida por reintrodução controlada de cálcio para restaurar a tolerância ao cálcio. Esse método fornece cardiomiócitos viáveis, viáveis e em forma de bastonete, compatíveis com ensaios posteriores, incluindo imunofluorescência, análise de organização de sarcômeros, detecção de apoptose e estudos de sinalização molecular. Ao eliminar a necessidade de equipamentos especializados de perfusão Langendorff, esse protocolo oferece uma solução acessível e de alto rendimento para laboratórios que investigam mecanismos de lesão cardíaca induzida por DOX.

Introdução

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A doxorrubicina (DOX) é um potente agente quimioterapêutico de antraciclina, mas sua utilidade clínica é limitada pela cardiotoxicidade acumulada que pode evoluir para cardiomiopatia dilatada e insuficiênciacardíaca 1,2. A apoptose cardiomiógica é um processo patogênico chave nessa toxicidade 3,4,5, e o estudo desses eventos celulares requer acesso confiável a cardiomiócitos funcionais adultos derivados de corações lesionados por DOX. No entanto, a exposição ao DOX torna os cardiomiócitos estruturalmente frágeis e metabolicamentecomprometidos 6, aumentando muito sua suscetibilidade ao estresse enzimático e mecânico durante o isolamento e resultando em baixa viabilidade. Na literatura mais ampla, a perfusão de Langendorff permanece como o método predominante para isolamento de cardiomiócitosem adultos 7. No entanto, apresenta limitações notáveis quando aplicado ao miocárdio danificado. O método exige equipamentos especializados, canulação aórtica precisa e considerável proficiência técnica; em corações tratados com DOX, a tensão mecânica adicional introduzida durante a perfusão de Langendorff pode agravar ainda mais a lesão celular, resultando em resultados inconsistentes e frequentementesubótimos.

Para superar esses desafios, estabelecemos um protocolo simplificado e acessível para isolar cardiomiócitos ventriculares adultos tolerantes ao cálcio a partir de um modelo murino de cardiotoxicidade aguda induzida porDOX 9. Ao eliminar a necessidade da perfusão convencional de Langendorff e, em vez disso, implementar uma perfusão antegrade ex vivo controlada diretamente pelo ventrículo esquerdo, esse método minimiza a exposição isquêmica e reduz a manipulação mecânica do miocárdio. Espera-se que essas características melhorem a consistência dos procedimentos e aumentem a sobrevivência de cardiomiócitos vulneráveis derivados de coraçõescomprometidos 7,10.

A abordagem atual se baseia em avanços emergentes no isolamento de cardiomiócitos livres de Langendorff, estendendo esses conceitos às células ventriculares adultas, que exigem preservação da arquitetura contil madura e das propriedades de manuseio do cálcio, características que não são adequadamente apoiadas por métodos de digestão simplificados desenvolvidos principalmente para coraçõesneonatais 11,12. Esse protocolo, portanto, oferece uma alternativa prática e reprodutível para laboratórios que não possuem sistemas especializados de perfusão. Os cardiomiócitos isolados mantêm sua integridade estrutural e são bem adequados para diversas aplicações a jusante, incluindo análise de sarcômeros, imagem por imunofluorescência e estudos de sinalização por apoptose, permitindo investigação mecanicista direta de lesão cardíaca induzida por DOX em um contexto fisiologicamente relevante. Coletivamente, esse protocolo atende a uma necessidade crítica não atendida de isolar cardiomiócitos viáveis de corações com lesão DOX.

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Protocolo

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Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Jiaotong de Xi'an (Aprovação nº XJTUAE2022-1441). Os consumíveis, reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Estabelecimento do modelo de cardiotoxicidade aguda induzida por DOX em camundongos C57BL/6

  1. Preparação animal: Use machos C57BL/6 camundongos de 8-12 semanas (24-28 g). Animais domésticos em condições padrão, com ciclo de 12 horas de luz/escuro e acesso ad libitum a comida e água. Atribuir aleatoriamente os camundongos aos grupos de controle tratados com DOX ou com soro fisiológico (n = 3 por grupo).
  2. Administração DOX
    1. Prepare uma solução DOX nova de 1,5 mg/mL em soro fisiológico estéril. Proteja a solução da luz envolvendo o recipiente com papel alumínio.
    2. Pese cada camundongo e calcule o volume de injeção para uma única dose intraperitoneal (i.p.) de 15 mg/kg 13,14.
    3. Imobilize o rato suavemente e administre a solução DOX por injeção intraperitoneal. Devolva o rato à gaiola e proceda conforme o cronograma experimental.
      ATENÇÃO: DOX é um agente citotóxico. Use equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, luvas, proteção ocular) e manuseie o reagente em uma área designada para segurança química.
  3. Cronograma e monitoramento: Monitore os camundongos diariamente para saúde geral e comportamento. Registre o peso corporal dia sim, dia não. Realize o isolamento do cardiomiócito 7 dias após a injeção de DOX.

2. Preparação de soluções e ferramentas cirúrgicas para isolamento de cardiomiócitos

  1. Preparação do tampão: Veja a Tabela Suplementar 1 para métodos detalhados de preparação dessas soluções.
    1. Prepare o buffer de perfusão e o buffer EDTA. Ajuste o pH de todas as soluções para 7,4 usando NaOH.
    2. Prepare solução digestiva enzimática contendo colanase tipo II, colagenase tipo IV e protease XIV com tampão de perfusão.
    3. Prepare o tampão de parada suplementando o tampão de perfusão com soro fetal bovino (FBS) a 5%.
    4. Prepare um meio de cultivo completo adicionando 0,1% de albumina sérica bovina (BSA), insulina-transferrina-selênio (ITS), 10 mM 2,3-Butanedione monoxima (BDM), concentrado lipídico e penicilina/estreptomicina (P/S) ao meio M199.
    5. Prepare os tampões de reintrodução de cálcio adicionando meio de cultura completo ao tampão de perfusão nas concentrações finais de cálcio de 0,34 mM, 0,68 mM e 1,02 mM, respectivamente.
      NOTA: Prepare todas as soluções em condições estéreis usando filtração a 0,22 μm. Armazene as soluções a 4 °C, protegidas da luz, por até duas semanas. Para o isolamento de um coração de camundongo, prepare 50 mL de tampão EDTA, 100 mL de tampão de perfusão (60 mL para solução de colagênase, 10 mL para tampão de parada, restante para perfusão e sedimentação gravitacional), 60 mL de tampão de colagênase e tampão de parada de 10 mL.
  2. Preparação da ferramenta cirúrgica: Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos por autoclavagem antes do procedimento. Organize as seguintes ferramentas sequencialmente na área cirúrgica: tesoura fina, tesoura curva, pinças, pinças hemostáticas curvas (Figura 1A) e bomba de seringa (Figura 1B).

3. Isolamento de cardiomiócitos de corações tratados com DOX

NOTA: Uma visão geral esquemática do procedimento de isolamento de cardiomiócitos é mostrada na Figura 2. Após confirmar que todos os instrumentos, equipamentos e soluções cirúrgicas estão prontos, inicie o isolamento.

  1. Clampagem aórtica e excisão cardíaca
    1. Anestesie o camundongo com isoflurano a 3% e confirme a anestesia verificando a falta de resposta ao beliscão do dedodo pé 15.
    2. Prenda o rato em posição supina na tábua de dissecação.
    3. Faça uma incisão na linha média pela pele e parede torácica para expor o coração, e corte a aorta descendente.
    4. Perfunda 7 mL de tampão EDTA em uma taxa controlada e constante na base do ventrículo direito durante aproximadamente 1 minuto para remover sangue rapidamente dos ventrículos, minimizando a exposição isquêmica e preservando a integridade estrutural cardíaca, especialmente em corações frágeis com lesões por DOX (Figura 2A).
    5. Clampe rapidamente a aorta ascendente (Figura 2B), excise o coração e transfira-o imediatamente para um prato de 100 mm contendo um tampão EDTA gelado.
      NOTA: O tempo total desde a toracotomia até a transferência cardíaca é idealmente mantido abaixo de 2 minutos para minimizar a isquemia.
  2. Configuração de perfusão
    1. Corte cuidadosamente o tecido ao redor.
    2. Coloque o coração em um prato de dissecação contendo um tampão de perfusão gelado.
    3. Perfunda 10 mL de tampão EDTA de forma constante através do ápice do ventrículo esquerdo usando uma agulha permanente por 6 minutos para desestabilizar conexões extracelulares.
    4. Transfira o coração para outro prato de 100 mm e remova o EDTA residual das câmaras cardíacas perfundindo 3 mL de tampão de perfusão pelo mesmo cateter durante 2 minutos.
      NOTA: Observe o inchaço cardíaco durante a perfusão e fixe a aorta com pinças hemostáticas curvas para estabelecer um sistema de perfusão fechado. Controle cuidadosamente a taxa de perfusão e a pressão para evitar força hidrostática excessiva e minimizar o risco de ruptura da atrial esquerda.
  3. Digestão enzimática
    1. Transfira o coração excisado para uma placa de 100 mm contendo 5 mL de solução digestiva enzimática.
    2. Conecte a agulha que permanece a uma seringa de 20 mL preenchida com a solução digestiva enzimática e fixe a agulha com segurança na superfície do armário de biossegurança usando fita indicadora de esterilização.
    3. Coloque a seringa em uma bomba de microinjeção e inicie a perfusão a uma taxa controlada de 3 min/mL (Figura 2C).
    4. Perfunda o coração através do ventrículo esquerdo com a solução enzimática por 60-90 minutos até que a digestão seja completa, indicada por perda total de elasticidade tecidual e coloração pálida da superfície ventricular (Figura 2D). Se a digestão incompleta for observada após a perfusão inicial, administre mais 15-20 mL de solução enzimática para a continuidade da digestão.
      NOTA: Evite o deslocamento da agulha durante a troca da seringa; se deslocado, reinserir-se no sítio original do ventrículo esquerdo para preservar o caminho de perfusão.
  4. Dissociação de tecidos
    1. Transfira o coração digerido para um prato de 60 mm contendo 5 mL de tampão de parada.
    2. Rasgue o tecido ventricular em pequenos pedaços usando pinças finas (Figura 2E).
    3. Triture suavemente a suspensão do tecido ventricular com uma pipeta de 5 mL para dissociar os cardiomiócitos individuais (Figura 2F).
    4. Filtre a suspensão celular através de um peneiro de 100 μm para remover grandes fragmentos de tecido.
    5. Enxágue o coador com 5 mL adicionais de tampão de parada para maximizar o rendimento da célula.
      NOTA: Realize todos os passos de trituração com cuidado e limite a pipetear a no máximo 50 repetições para evitar danos mecânicos aos cardiomiócitos.
  5. Reintrodução do cálcio
    NOTA: Permita que os cardiomiócitos passem por períodos sequenciais de sedimentação gravitacional de 15 minutos em tubos centrífugos de 15 mL (Figura 2G). Após cada sedimentação, remova cuidadosamente 80% do sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mL do tampão de reintrodução de cálcio subsequente. Aumente progressivamente a concentração de cálcio usando as soluções de gradiente preparadas a cadapasso 16.
  6. Contagem e placagem celular
    1. Quantifique a densidade celular usando um hemocitômetro e calcule a proporção de cardiomiócitos em forma de bastonete versusarredondados 1,9 (Figura 2H).
    2. Placa 1-5 × 105 células em meio de chapa em placas de 6 poços pré-revestidas com laminina (10 μg/mL) por 1 hora a 37 °C e lavada com soro salino tamponado com fosfato (PBS). Prepare os pratos com um dia de antecedência e armazene a 4 °C, se necessário. Mude o substrato para um substrato de cultura fresco, pré-aquecido, após 1 hora e a cada 48 horas depois disso.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado após a etapa 3.6. As células podem ser mantidas em cultura de curto prazo por até 6 horas para experimentos imediatos.

4. Avaliação da integridade estrutural dos cardiomiócitos por imunocoloração

  1. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 15 minutos em temperatura ambiente.
  2. Lave as células três vezes com PBS, 5 min cada.
  3. Permeabilize as células com 0,1% de Triton X-100 em PBS por 10 minutos e lave três vezes com PBS, 5 minutos cada.
  4. Bloqueie a ligação inespecífica com 1% de BSA em PBS por 1 hora.
  5. Incubar células com anticorpo primário contra sarcomérico α-actinina durante a noite a 4 °C.
  6. Lave suavemente três vezes com PBS e depois incube com o anticorpo secundário fluorescente apropriado por 1 hora em temperatura ambiente.
  7. Lave suavemente três vezes com PBS, depois contra-tinga os núcleos com DAPI por 5 minutos.
  8. Monte lâminas de cobertura em slides de vidro usando um meio de montagem antifade.
  9. Adquira imagens usando um microscópio de fluorescência para visualizar os padrões de coloração.

5. Análise da sinalização apoptótica em cardiomiócitos isolados

  1. Extração e quantificação de proteínas
    1. Lisar cardiomiócitos em tampão à base de RIPA suplementado com protease e inibidores de fosfatase.
    2. Centrifuge o homogeneado a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C. Colete o sobrenadante para análise posterior.
    3. Determine a concentração de proteína usando um ensaio colorimétrico de ácido bicincônico.
  2. Análise do Western blot
    1. Separe 30 μg de proteína em géis de SDS-poliacrilamida e transfira as proteínas resolvidas para as membranas do PVDF.
    2. Bloqueie as membranas com 5% de leite desnatado em TBS contendo 1% Tween-20, depois incube-as durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra Bax, Bcl-2 e caspase-3 clivada, marcadores proteicos principais comumente avaliados em estudos de cardiotoxicidadeDOX 17.
    3. Incubar com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte apropriados. Detectar sinais usando reagente de quimioluminescência aprimorado e adquirir imagens com um sistema de imagemdigital 18.
  3. Análise de dados
    1. Apresente dados quantitativos como média ± SEM de três réplicas biológicas independentes.
    2. Realize análises estatísticas usando o GraphPad Prism, aplicando ANOVA bidirecional para comparações entre múltiplos grupos e pontos de tempo, ou um teste t bidirecional sem pareamento para comparações entre dois grupos. Um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

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Avaliação do rendimento e viabilidade celular

Os camundongos que receberam DOX apresentaram uma queda significativa no peso corporal em relação ao grupo tratado com soro fisiológico (Figura Suplementar 1A). O estabelecimento bem-sucedido do modelo de cardiotoxicidade induzida por DOX aguda foi ainda confirmado por aumentos marcadores marcadores de lesão cardíaca sérica, incluindo cTnT e CK (Figura Suplementar 1B,C

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Discussão

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O isolamento bem-sucedido de cardiomiócitos adultos de alta qualidade e tolerantes ao cálcio é essencial para estudos celulares da fisiopatologia cardíaca. Esse protocolo fornece de forma confiável cardiomiócitos funcionais tanto de corações saudáveis quanto patológicos de camundongos, sendo dois passos particularmente cruciais para preservar a viabilidade celular. Primeiro, otimize e monitore cuidadosamente a duração da perfusão enzimática. Digestão insuficiente produz dissociação dos t...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Esse trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da China (bolsa 82230012 e 81830015 a N. Wang, bolsa 82570478 a L. Xiao).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pratos de cluture de célula de 100 mmBio-Filtração a Jato TCD000100
100 & mu; Filtro de células MCorning431752
Tubos centrífugas de 15 mLBio-Filtração a Jato CFT011150
Tubos centrífugos de 50 mLBio-Filtração a Jato CFT011500
Pratos de cultura celular de 60 mmBio-Filtração a Jato TCD100060
Albumina Sérica Bovina (BSA)Sigma-AldrichA1470 
Colanase IISigma-AldrichC6885
Colagenase IVSigma-AldrichC5138
Pinças hemostáticas curvasCiências da Vida RWDF22003-10
Tesouras de ponta curvaCiências da Vida RWDS12001-09
Tesoura finaCiências da Vida RWDS12000-09
PinçasCiências da Vida RWDF13014-12
Cânula habitada (26G)Becton, Dickinson e Companhia381312
Insulina-Transferrina-Selênio (ITS)MedChemExpressHY-150287
Isoflurane   Ciências da Vida RWDR510-22-10
Laminina (murina)Termo Científica23017015
Concentrado de Lipídios (Quimicamente Definido)MedChemExpressHY-K3019
M199 MédioSigma-AldrichM4530
Penicilina-EstreptomicinaMedChemExpress  HY-K1006
Protease XIVSigma-AldrichP5147
Fita Indicadora de EsterilizaçãoMineração e Manufatura de Minnesota (3M)CT060934701
Bomba de Seringa (ISPLab01)Bomba de Precisão Baoding ShenchenSC-49464A

Referências

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