Um protocolo simplificado e robusto para o isolamento e expansão a longo prazo das células epiteliais endoteliais humanas primárias

Summary

A cultura primária de células epiteliais do endométrio humano (HEECs) é tecnicamente desafiadora. Este protocolo combina digestão por enzimas mistas com inibidor de ROCK (Y-27632) para melhorar a sobrevivência e expansão celular, mantendo a identidade epitelial, fornecendo uma plataforma robusta para pesquisa endometrial e aplicações regenerativas.

Abstract

Pesquisas sobre distúrbios endometriais, incluindo hiperplasia endometrial associada ao tamoxifeno, têm sido limitadas pela falta de modelos epiteliais robustos in vitro . Métodos convencionais para isolar células epiteliais do endométrio humano (HEECs) são frequentemente ineficientes, tecnicamente exigentes e pouco escaláveis. Aqui, é descrito um protocolo simplificado, livre de alimentadores, que integra digestão com enzimas mistas, lise de eritrócitos e tratamento sustentado com inibidor de ROCK (Y-27632) para permitir o isolamento eficiente e a expansão dos HEECs primários. A inclusão de Y-27632 é fundamental para mitigar a apoptose induzida por dissociação e aumentar a adesão celular em estágio inicial. Essa abordagem suporta a passagem serial mantendo a identidade epitelial por pelo menos 3 passagens, com a morfologia preservada além de 10 passagens. A caracterização por Western blot e imunofluorescência confirma alta expressão de Citoqueratina 18 e E-cadherina, com redução progressiva dos contaminantes estromais positivos à vimentina sob condições de cultivo seletivo. Ao abordar limitações técnicas chave, esse método fornece uma fonte confiável e escalável de células epiteliais para estudos mecanicistas, modelagem de doenças, triagem de medicamentos e aplicações regenerativas em pesquisa endometrial. O fluxo de trabalho padronizado oferece uma alternativa aos sistemas complexos de cocultura, facilitando o acesso mais amplo a modelos celulares primários de alta qualidade.

Introduction

Modelos in vitro confiáveis são essenciais para avançar no estudo de distúrbios endometriais, especialmente aqueles associados ao tamoxifeno (TAM⁾¹. Embora a TAM seja amplamente utilizada como terapia endócrina para câncer de mama, sua atividade parcial de agonista do estrogênio no endométrio aumenta significativamente a incidência de hiperplasia endometrial, pólipos e, em alguns casos, transformação^{maligna 2}. O manejo clínico atual da patologia endometrial associada ao tamoxifeno depende principalmente da terapia com progesterona ou intervenção cirúrgica, ambas com limitações significativas. O tratamento com progesterona está frequentemente associado a efeitos adversos, como sangramento intermenstrual e ganho de peso, enquanto abordagens cirúrgicas podem causar lesão endometrial irreversível e comprometer a^{fertilidade 3}. Essas limitações ressaltam a necessidade de modelos epiteliais robustos que possam apoiar estudos mecanicistas e auxiliar no desenvolvimento de estratégias terapêuticas aprimoradas. No entanto, o progresso nessa área tem sido principalmente limitado por desafios técnicos na obtenção de células epiteliais endoteliais humanas (HEECs) de alta pureza e expansíveis.

Trabalhos fundamentais nesse campo foram relatados por Arnold et al. (2001), que isolaram populações celulares estromais e epiteliais por meio da digestão de colagênese e filtração sequencial em peneira, alcançando maior que 98% de pureza conforme verificado por^{imunocoloração 4}. Apesar do sucesso, o método dependia da digestão por enzima única, exigia processamento prolongado e dependia da filtração em etapas para remover contaminantes estromais e eritrócitos, tornando o fluxo de trabalho trabalhoso e difícil de^{padronizar 4}. Mais tarde, Yokomizo et al. (2002) estabeleceram um sistema primário de cultura HEEC a partir de amostras de histerectomia usando uma cocultura tridimensional com células estromais^{alimentadoras 5}. Embora o microambiente baseado em alimentadores suportasse parcialmente o crescimento epitelial, o sistema permitia apenas passagens limitadas, tipicamente não mais que cinco passagens, o que restringia sua utilidade para aplicações que exigiam expansão epitelial estável^{e em larga escala 5}.

Para superar essas limitações, foi desenvolvido um protocolo simplificado e altamente reproduzível para isolamento de HEEC e cultura de longo prazo. Guiados por trabalhos anteriores que demonstraram que o inibidor de ROCK Y-27632 melhora significativamente a eficiência da cultura primária para queratinócitos humanos, células epiteliais gengivais e células epiteliais mamárias, o mesmo princípio foi aplicado ao tecido^{endometrial 6,7,8}. Essa abordagem incorpora três características principais: digestão por enzimas mistas para promover a dissociação eficiente dos tecidos, uma etapa essencial de lise de eritrócitos para reduzir a contaminação precoce e facilitar a fixação epitelial, e suplementação contínua com Y-27632 para suprimir a apoptose, apoiar a adesão e aumentar a capacidade proliferativa. Usando essa estratégia, os HEECs podem ser expandidos por múltiplas passagens mantendo a morfologia epitelial e alta expressão de CK18 e E-cadherina ^9,10. Notavelmente, a passagem serial por pelo menos 3 gerações não resultou em deriva fenotípica detectável, demonstrando a estabilidade e escalabilidade do sistema de cultura.

Este método aborda diretamente desafios técnicos antigos na cultura HEEC primária, incluindo altos requisitos de entrada de tecido, fluxos de trabalho complexos, baixa reprodutibilidade e potencial de expansão limitado. Ao preservar a identidade epitelial e as características funcionais durante todo o passe, o protocolo oferece uma plataforma confiável para pesquisas sobre regeneração endometrial, fisiopatologia, triagem de fármacos de alto rendimento e interações célula–biomaterial. Ao integrar o processamento de tecidos com a expansão em série, esse fluxo de trabalho padronizado aborda um gargalo antigo na biologia reprodutiva e apoia aplicações futuras em engenharia de tecidos, medicina regenerativa e terapia personalizada.

Esse protocolo exige amostras de tecido frescas, preferencialmente processadas dentro de 24 horas após a coleta. O rendimento celular e as características de crescimento podem variar dependendo da fonte do tecido, como pólipos endometriais versus endométrio normal. Fontes comuns de falha incluem digestão incompleta de tecidos, contaminação excessiva por eritrócitos ou suplementação insuficiente com Y-27632. Embora o sistema suporte a expansão por múltiplas passagens de canal, otimizações adicionais podem ser necessárias para manter a estabilidade fenotípica durante a cultura estendida.

Protocol

Amostras frescas de tecido endometrial foram obtidas a partir de amostras de pólipos uterinos ressecadas cirurgicamente de pacientes do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Ética Médica do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (Protocolo nº 2025-KLS-569-01; aprovado em 14 de setembro de 2025). O manuseio das amostras humanas primárias foi realizado em um armário de segurança biológica Classe II, utilizando equipamentos de proteção individual adequados, incluindo jalecos, luvas e proteção ocular. Todos os reagentes enzimáticos foram manuseados de acordo com as regulamentações institucionais de segurança e as diretrizes das Fichas de Dados de Segurança de Materiais (MSDS).

1. Aquisição de tecido

1. Colete tecido endometrial fresco de amostras cirúrgicas obtidas de mulheres adultas. Transfira o tecido para tubos estéreis contendo 10 mL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) suplementado com 3% de penicilina/estreptomicina (P/S).
   NOTA: Todo o tecido deve ser processado dentro de 24 horas após a coleta cirúrgica.

2. Pré-tratamento do tecido

1. Agite o tecido na solução de lavagem (Tabela 1) por duas lavagens consecutivas de 2 minutos cada para remover muco e coágulos sanguíneos.
2. Enxágue brevemente o tecido com 5 mL de etanol 75% por 5 segundos para desinfetar a superfície.
3. Transfira imediatamente o tecido para 20 mL de solução de lavagem e lave por duas lavagens, de 5 minutos cada, para remover o etanol residual.
   NOTA: Como o etanol é inflamável, realize essa etapa para evitar chamas abertas e descarte resíduos contendo etanol conforme as diretrizes institucionais de segurança química.

3. Digestão de tecidos e colheita celular

1. Corte de tecidos
   1. Corte o tecido endometrial com duas lâminas estéreis até que fragmentos (~2^{mm 3}) possam ser aspirados por uma ponta de pipeta de 1 mL (cerca de 10 min).
   2. Transfira o tecido picado para um tubo centrífugo de 50 mL.
2. Digestão enzimática
   1. Adicione 10 mL de solução digestiva (Tabela 1) ao tubo contendo os fragmentos de tecido.
   2. Incube o tubo em banho-maria a 37 °C por 30 minutos. Agite suavemente o tubo a cada 15 minutos para facilitar a digestão.
   3. Continue a incubação até que os fragmentos de tecido estejam visivelmente dissociados e a solução pareça turva devido às células liberadas.
3. Término da digestão
   1. Adicione 10 mL de solução neutralizante para interromper a digestão enzimática.
   2. Misture bem pipetando para cima e para baixo aproximadamente 15 vezes usando uma pipeta P1000 ajustada a 800 μL.
4. Filtração e centrifugação
   1. Filtre a suspensão digerida através de um filtro de malha de 100 μm.
   2. Centrifuge a 156 × g por 5 min a 25 °C.
5. Lise de glóbulos vermelhos (RBC)
   1. Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem mexer na bola.
   2. Resuspenda o pellet celular em 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos pré-resfriado.
   3. Incube no gelo (aproximadamente 4 °C) por 3–5 minutos com agitação suave.
6. Término da lise
   1. Adicione ≥10 mL de PBS ou meio completo para interromper a reação de lise.
   2. Centrifuge a 156 × g por 5 minutos a 25 °C.

4. Iniciação da cultura primária

1. Lavagem e centrifugação
   1. Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem mexer na bola.
   2. Ressuspenda o pellet em 20 mL de solução neutralizante.
   3. Misture pipetando aproximadamente 15 vezes.
   4. Centrifuge a 156 × g por 5 min a 25 °C.
2. Resuspensão e plantagem
   1. Aspire o sobrenadante.
   2. Ressuspenda suavemente o pellet celular em 10 mL de meio de cultivo inicial contendo 10 μM Y-27632, pipetando lentamente para cima e para baixo 8 a 10 vezes usando uma pipeta de 1 mL.
   3. Placar a suspensão da célula em uma placa de cultivo de 100 mm.
      NOTA: Para a densidade inicial de semeadura ideal, selecione o vaso de cultura de acordo com o rendimento estimado da célula. Se o rendimento esperado for >1 × 10⁶ células, use um prato de 100 mm e, para rendimentos menores, use um prato de 60 mm. Ajuste o volume médio de acordo (por exemplo, 10 mL para uma antena de 100 mm; 4 mL para uma antena de 60 mm).
3. Condições culturais
   1. Incube o prato a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂.
   2. Substitua o meio por meio novo para cultura epitelial sem Y-27632 a cada 3 dias.
      NOTA: Monitore a ligação e morfologia celular; Atualize o meio a cada 2 dias quando as células começam a proliferar.

5. Passagem celular

1. Preparação para a tripsinização
   1. Quando as culturas atingirem 80%–90% de confluência, remova o prato de 100 mm da incubadora.
   2. Descarte o meio gasto.
   3. Enxágue as células duas vezes com 2 mL de PBS.
   4. Aspire cuidadosamente e remova qualquer PBS restante.
2. Tripsinização
   1. Adicione 2 mL de tripsina 0,05% ao prato.
   2. Gire suavemente para garantir uma cobertura uniforme da camada celular.
   3. Incube a 37 °C por 7 minutos.
   4. Examine as células ao microscópio (objetivo 40x) para confirmar o descolamento.
3. Neutralização e coleta
   1. Adicione 8 mL de solução neutralizante para interromper a digestão da tripsina.
   2. Transfira a suspensão da célula para um tubo centrífugo de 15 mL.
   3. Pipete aproximadamente 15 vezes para obter uma suspensão de célula única.
   4. Centrifuge a 156 × g por 5 minutos a 25 °C.
4. Resuspensão e resemeadura
   1. Aspire o sobrenadante sem mexer na bola.
   2. Resuspenda suavemente a pelota celular em 10 mL de meio celular epitelial pipetando para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes usando uma pipeta de 1 mL.
   3. Seme 1 × 10⁶ células em 10 mL de meio celular epitelial em um novo prato de 100 mm.
   4. Ajuste a densidade de semeadura para promover células isoladas e bem distribuídas ou pequenos aglomerados no dia seguinte, evitando superlotação.
5. Manutenção pós-passagem
   1. Incubar sob condições padrão de cultura (37 °C, 5% CO₂).
   2. Observe a cultura regularmente e substitua o meio celular epitelial a cada 2 dias.
      NOTA: As células normalmente estão prontas para aplicações a jusante após a primeira ou segunda passagem, uma vez que uma monocamada saudável e aderente com ≥80% de confluência é obtida.
      ATENÇÃO: Todos os materiais que entraram em contato com células humanas primárias foram tratados como potenciais riscos biológicos. Antes do descarte ou processamento adicional, esses materiais foram desinfetados usando água sanitária a 10%, em conformidade com as diretrizes institucionais de biossegurança.

Results

O estabelecimento bem-sucedido do sistema primário de cultura HEEC foi confirmado por meio de avaliações morfológicas, proliferativas e moleculares, conforme descrito na Figura 1. Ao combinar digestão com enzimas mistas, lise de eritrócitos e um inibidor de ROCK, esse protocolo permitiu o isolamento eficiente e a expansão estável das células epiteliais a partir do tecido endometrial humano.

Observações morfológicas demonstraram o ...

Discussion

Estabelecer um modelo in vitro confiável das células epiteliais endometriais humanas (HEECs) é essencial para investigar a biologia e patologia^{endometrial 11}. Embora vários métodos tenham sido desenvolvidos para isolamento HEEC, a maioria permanece limitada pela complexidade técnica, baixa eficiência e potencial de expansão^{restrito 4,5}. Muitos protocolos também dependem de camadas alimentadoras, q...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Solarbio	CAS: 42613-33-2	Para o isolamento do HEECs
Colagenase Tipo I	Merck	SKU:SCR103	Para o isolamento do HEECs
100 & micro; Filtro de malha M	Solarbio	431752	Para filtração HEECs
coelho anti CK18	Abcam	ab133263	Para coloração por imunofluorescência para verificar o marcador de diferenciação dos HEECs
coelho anti-CDH1	Abcam	ab40772	Para coloração por imunofluorescência para verificar o marcador de diferenciação dos HEECs
coelho anti VIM	Abcam	ab16700	Para coloração por imunofluorescência para verificar o marcador de diferenciação dos HEECs
4% de paraformaldeído	solarbio	P0099	Para coloração por imunofluorescência para verificar o marcador de diferenciação dos HEECs
Incubadora de CO2	Termo Científica	42820906	Para incubação celular
Centrífuga	Eppendorf	5404HN133048	Centrífuga de célula
Prato de Cultura Celular de 100mm	Corning	430167	Para cultura celular
Tubo de centrífuga de 50 ml	Corning	430829	Para centrifugação de células
Tubos microcentrífugas de 1,5 ml	NEST	081722CK01	Para digestão celular
Filtro de Células	Solarbio	431752	Filtração celular
Solução tamponada com fosfato	Tecono	20201033	Solução de lavagem
DMEM	Gibco	8122622	Componente do meio de neutralização
Penicilina/Estreptomicina	Termo Científica	15140-122	Antibióticos
Soro Fetal Bovino	Gibco	2556132P	Componente do meio de neutralização
0,05% Tripsina	Basalmedia	K431010	Para HEECs e nbsp; Dissociação
Y-27632	Solarbio	IY0040	Inibidor de ROCHAS
Buffer de Lise de Hemácias	Solarbio	R1010	Lise de glóbulos vermelhos
1% Triton X-100	Termo Científica	HFH10	Permeabilização por membrana
Iog anti-Coelho do Burro	Termo Científica	A32790TR	Anticorpo secundário
DAPI	Termo Científica	62248	Coloração por DNA
1 x PBST	Solarbio	P1031	Amortecedor de lavagem
Meio Dedicado para HEECs Primários	iCell	iCell-f004-002h	Para a cultura do HEEC
Microscópio Confocal Invertido	Zeiss	LSM880	Usado para adquirir imagens de imunofluorescência; equipado com 40x
Linha celular MRC-5	iCell	iCell-h146	linha celular de adenocarcinoma endometrial humano; STR perfilado.
Linha celular de Ishikawa	iCell	iCell-h113	linha celular de adenocarcinoma endometrial humano; STR perfilado.