Artigo de método

Avaliação da atividade metabólica dos ventrículos inteiros regeneradores de peixe-zebra ex vivo usando um ensaio de fluxo extracelular

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DOI:

10.3791/70459

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17 de abril de 2026

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1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

Neste artigo

Resumo

Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para quantificar a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular dos ventrículos adultos ex vivo de peixe-zebra, a fim de caracterizar sua capacidade metabólica oxidativa e glicolítica.

Resumo

A capacidade dos peixes-zebra de regenerar seus corações ao longo da vida adulta é parcialmente atribuída a adaptações metabólicas. Embora tenha sido hipotetizado que o coração do peixe depende significativamente da glicólise, estudos recentes revelaram um perfil metabólico mais complexo no qual o metabolismo oxidativo surge como um componente essencial da rediferenciação cardiomiódica e da regeneração cardíaca bem-sucedida em estágio tardio. Em 2025, adotamos um método de alto rendimento para avaliar o perfil metabólico dos ventrículos inteiros do peixe-zebra ex vivo, utilizando o ensaio Seahorse (ensaio de fluxo extracelular). Esse método permite uma avaliação rápida e em tempo real da taxa basal e máxima de consumo de oxigênio (OCR) e da taxa de acidificação extracelular (ECAR) usando o teste de estresse XF Mito no analisador Seahorse XFe24. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para realizar análise de fluxo extracelular em ventrículos inteiros de peixe-zebra. A capacidade de quantificar o OCR e o ECAR em corações inteiros vivos ex vivo proporcionará a oportunidade de elucidar o metabolismo cardíaco em momentos críticos do desenvolvimento, progressão da doença e regeneração.

Introdução

Em contraste com os humanos, os peixes-zebra (Danio rerio) mantêm a capacidade de regenerar tecido cardíaco perdido ao longo da vidaadulta 1. Em caso de lesão cardíaca, os cardiomiócitos na zona de borda da ferida se desdiferenciam e reentram no ciclo celular 2,3 pararestaurar os números 4 dos cardiomiócitos e repovoar a ferida. Recentemente, a importância da rediferenciação cardiomiócitária no processo regenerativo tem sidoreconhecida 5. Ambos os processos são fortemente regulados por mudanças metabólicas no coração do peixe-zebra, com glicólise impulsionando aproliferação 6,7 e a fosforilação oxidativa (OXPHOS) promovendoa rediferenciação 8. Embora métodos farmacológicos e genéticos para manipular o metabolismo sejam amplamente difundidos no campo daregeneração 6,7, a validação dos efeitos metabólicos dessas perturbações continua sendo desafiadora devido ao pequeno tamanho do coração do peixe-zebra, que requer uma configuração complexa e personalizada para canulação 9,10,11 ou agrupamento de múltiplos corações para espectrometriade massa 12 ou espectroscopia RMN 8, 13.

Para contornar essas limitações, recentemente descrevemos o uso do Analisador Seahorse XFe24 para o perfil metabólico de alto rendimento de ventrículos inteiros de peixe-zebra exvivo 8. O ensaio de fluxo extracelular é projetado para medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de células, ilhéus pancreáticos e esferoides. Isso é alcançado por meio de sensores de estado sólido que detectam mudanças na concentração de oxigênio e prótons (pH) no meio resultantes da utilização da cadeia de transporte de elétrons respiratórios da produção de oxigênio e lactato dependente da glicólise, respectivamente (Figura 1A)14.

A análise de fluxo extracelular pode ser realizada em uma configuração de placas de 96 poços (XFe96 e XF Pro), miniplacas de 8 poços ou várias versões de placas de 24 poços (XFe24). Embora as placas de 96 poços forneçam maior rendimento, a distância de trabalho entre o sensor e o fundo do poço não é adequada para acomodar um ventrículo inteiro de peixe-zebra. Além disso, no formato de placa de 96 poços, não há provisão para fixar o ventrículo no fundo do poço para evitar que ele flutue no meio e interfira nos sensores. Por outro lado, a microplaca de captura de ilhotas XFe24 foi originalmente projetada para a caracterização metabólica das ilhotas pancreáticas primárias e, como resultado, permite a deposição do tecido no fundo do poço, que é então fixado por uma tela (grade). Devido ao pequeno tamanho do coração do peixe-zebra, conseguimos adaptar a microplaca de captura de ilhotas para ser usada nos ventrículos do peixe-zebra, que permanecem fixos sob a grade durante toda a duração do ensaio.

Para avaliar a capacidade respiratória mitocondrial, utilizamos o teste de estresse de Mito, no qual quatro inibidores da cadeia de transporte de elétrons e da sintase de adenosina trifosfato (ATP) foram usados (Figura 1A). Primeiramente, são adquiridas medições de linha base do OCR (Figura 1B, magenta). Em seguida, oligomicina, um inibidor complexo do V, é injetada. A oligomicina inibe a atividade do ATP sintase e, assim, leva a uma redução do OCR, o que é atribuível à produção de ATP (Figura 1B, verde). O consumo restante de oxigênio é resultado da respiração não acoplada e do consumo de oxigênio não mitocondrial (Figura 1B, laranja e cinza, respectivamente)15. Após a oligomicina, é injetada FCCP, que dissipa o gradiente de prótons através da membrana mitocondrial (Figura 1A). Na tentativa de restaurar o gradiente de prótons, as mitocôndrias aumentam seu consumo de oxigênio até sua capacidade máxima (Figura 1B, azul). Por fim, é usada uma mistura de rotenona e antimicina A que inibe os complexos I e III, respectivamente (Figura 1A). Essa combinação de fármacos leva ao desligamento total da atividade da cadeia de transporte respiratório de elétrons mitocondrial devido à falta de fluxo de elétrons dos complexos I e III para o complexo IV15. Isso permite medir o consumo de oxigênio não mitocondrial (Figura 1B, cinza).

No geral, usando a microplaca de captura de ilhéus com o teste de estresse de Mito, conseguimos avaliar rápida e reprodutivamente a capacidade metabólica oxidativa e glicolítica dos ventrículos inteiros do peixe-zebra ex vivo. Descrevemos o protocolo detalhado para este procedimento abaixo. Por fim, mostramos a sobrevivência de ventrículos isolados do tipo selvagem ex vivo não lesionados no analisador de fluxo extracelular, e validamos o teste de estresse Mito 14 dias após criolesão (DPCI) ventrículos transgênicosde peixe-zebra 8.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos abaixo envolvendo animais foram realizados em conformidade com a revisão da Lei de Procedimentos Científicos (Animais de 1986) no Reino Unido e da Diretiva 2010/63/UE na Europa, e foram aprovados pelo Comitê Central de Cuidados Animais e Revisão Ética da Universidade de Oxford.

NOTA: Este protocolo foi realizado usando um analisador Seahorse XFe24 e o meio DMEM Seahorse sem fenol vermelho e bicarbonato.

1. Criolesão cardíaca do peixe-zebra (opcional)

  1. Obtenha a aprovação ética adequada da instituição local e das autoridades nacionais antes de iniciar o experimento.
  2. Realize criolesão nos corações dos peixes-zebra conforme descritoanteriormente 16,17,18.

2. Hidratar o cartucho sensor

  1. Abra o kit de ensaio de fluxo extracelular e carregue a placa utilitária de 24 poços (Figura 2A) pipetando 500 μL da solução calibrante por poço.
  2. Feche a placa de utilidade usando o cartucho sensor e o hidroamplificador (Figura 2A).
  3. Incube o cartucho e a placa utilitária em uma incubadora umidificada a 37 °C durante a noite (18–72 h). Mantenha a tampa do cartucho sensor durante toda a incubação.

3. Preparar soluções farmacêuticas e mídia

  1. Prepare soluções padrão dos medicamentos: dissolver a oligomicina em dimetil sulfóxido (DMSO) a uma concentração de 10 mM, o cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) em DMSO a uma concentração de 5 mM, a rotenona em DMSO a uma concentração de 10 mM e a antimicina A no etanol a uma concentração de 10 mM e armazenar em -20 °C se não for usado imediatamente.
    NOTA: Recomenda-se preparar soluções frescas de oligomicina, rotenona e antimicina a cada 2–3 meses, e solução FCCP a cada vez antes de realizar o ensaio.
  2. Prepare a concentração de trabalho dos medicamentos (500 μM de oligomicina, 300 μM FCCP, 450 μM de cada mistura rotenona/antimicina A) diluindo a solução padrão em meio DMEM. Certifique-se de que o volume final para as concentrações de trabalho seja de 1,5 mL para oligomicina, 1,65 mL para FCCP e 1,8 mL para rotenona/antimicina A, permitindo a carga de 30 portas (24 portas por inibidor no cartucho mais 6 portas extras por medicamento para corrigir erros de pipeteamento).
    NOTA: Alguma precipitação aparecerá na rotenona/antimicina A, mas após uma boa mistura, essa precipitação será minimizada. Note que as concentrações mencionadas no 3.2 são 10 vezes a concentração final dos medicamentos quando serão injetados nos poços.
  3. Prepare o meio DMEM (pH 7,4) para conter 10 mM de glicose, 1 mM de piruvato e 2 mM de glutamina, e armazene em -20 °C até o uso.

4. Ligar o analisador de fluxo extracelular

  1. Ligue o analisador a partir do botão lateral durante a noite antes do ensaio para permitir o equilíbrio de temperatura com o ambiente.
  2. Ligue o computador e abra o software Wave.
  3. Selecione o teste de Estresse Mito no software.
  4. Desligue o aquecedor no canto inferior esquerdo do software para que a temperatura no analisador caia abaixo de 37 °C e atinja 28–29 °C para se aproximar da temperatura padrão da criação depeixes-zebra 19.
  5. Defina a estratégia de injeção na página de definições de grupo (na aba de estratégias de injeção ) adicionando os compostos que serão depositados em cada porta a partir do catálogo de compostos. Para o teste de estresse Mito, adicione oligomicina na porta A, FCCP na porta B e rotenona/antimicina na porta C. Há capacidade para a adição de mais um medicamento no porto D, que não é utilizado neste protocolo.
  6. Exclua todas as outras estratégias pré-desenhadas que existam na aba de estratégias de injeção assim que a estratégia experimental estiver definida. Especifique os grupos experimentais (por exemplo, wild-type e mutante) no lado de Grupos da página e especifique a estratégia de injeção que eles receberão (a definida no passo 4.5). Certifique-se de que as estratégias de injeção estejam alinhadas entre os grupos e também com a estratégia de injeção projetada.
  7. Na página do mapa de placas , especifique a posição de cada amostra na placa de 24 poços clicando em cada grupo e depois nos poços que conterão as amostras.
    1. Note que quatro dos poços não são adequados para deposição de amostras (Figura 2B) e servem como espaços em branco que serão usados para correção de fundo. Certifique-se de que as amostras de cada grupo estejam distribuídas uniformemente pela placa para equilibrar possíveis viés posicionais nas medições ou nas condições ambientais.
  8. Na página do protocolo , remova a aba Controle ou Experimental se nenhum inibidor adicional além dos mencionados acima for usado, e certifique-se de que as portas de software correspondam às posições dos medicamentos no cartucho.
  9. O software define automaticamente 3 ciclos de mistura, espera e medição por condição. Modificar o número de ciclos para 10 medições de linha de base (não tratadas), 3 de oligamicina, 7 de FCCP e 9 de rotenona/antimicina A para permitir traços estáveis e para que os inibidores atuem no tecido 3D. Certifique-se de que cada ciclo tenha 3 minutos de mistura, 2 minutos de espera e 3 minutos de medição.

5. Calibração do analisador

  1. Remova o cartucho e a placa utilitária da incubadora umidificada (veja os passos 2.1–2.3).
  2. Remova o hidroamplificador e a tampa (Figura 2A) do cartucho e coloque o cartucho do sensor sobre a placa de utilidade que contém o calibrante.
  3. Pipetee suavemente os inibidores em seus respectivos portos enquanto toca a parede lateral do porto com a ponta da pipeta, garantindo um fluxo suave do líquido: 50 μL de oligomicina no porto A, 55 μL de FCCP no porto B e 60 μL de rotenona/antimicina A no porto C (Figura 2C).
    1. Note que o líquido é mantido no lugar apenas pela tensão superficial no orifício da porta, então evite pipetear ou prender o cartucho abruptamente a partir desse passo. Certifique-se de que nenhum líquido entre na porta do sensor (Figura 2C), pois isso danificaria o analisador.
  4. Clique em iniciar execução no software, nomeie a execução e salve no computador. Nesse ponto, a bandeja do analisador será aberta para posicionar o cartucho e a placa utilitária.
  5. Coloque o cartucho carregado com os medicamentos e a placa utilitária contendo o calibrante na bandeja do analisador, de acordo com o mapa da placa na bandeja (poço A1 no canto superior esquerdo) e certifique-se de que o encaixe correto. Remova o reforço do hidrante e a tampa (Figura 2A) da placa antes de colocá-la na bandeja. A falha em fazer isso danificará o analisador.
  6. Quando estiver pronto, instrua o software a iniciar o ensaio pressionando executar ensaio. Nesse ponto, o analisador recebe a bandeja carregada e inicia a calibração.
  7. Comece o isolamento cardíaco (veja os passos 6.1–6.12). A calibração dura aproximadamente 40 minutos, mas a placa pode ser mantida no analisador pelo tempo necessário para isolar os corações e colocá-los na microplaca de captura do ilhéu (Figura 2B,D).

6. Isolar os corações de peixe e carregá-los na placa de ilhéu de 24 poços

  1. Abra a microplaca de captura do ilhéu e carregue a placa de 24 poços com 500 μL de DMEM (10 mM de glicose, 1 mM de piruvanato, 2 mM de glutamina) em temperatura ambiente.
  2. Coloque todas as grades em uma placa de Petri de 35 mm contendo mídia DMEM em temperatura ambiente, garantindo que estejam totalmente imersas e livres de grandes bolhas.
  3. Prepare uma placa de Petri adicional de 35 mm contendo DMEM (10 mM de glicose, 1 mM de piruvato, 2 mM de glutamina) em temperatura ambiente. Isso serve para enxaguar os corações na coleta e dissecar o ventrículo dos átrios e do bulbo arterioso.
  4. Elimine um peixe em 5 g/L de MS-222 e verifique a ausência de reflexos.
  5. Coloque o peixe sobre uma esponja presa em uma placa de Petri de 92 mm, abra sua cavidade cardíaca e dissece o coração conforme descritoanteriormente 16,20.
  6. Enxágue os corações na placa de Petri de 35 mm contendo DMEM (10 mM de glicose, 1 mM de piruvanato, 2 mM de glutamina) em temperatura ambiente.
  7. Remova o átrio e o bulbo arterioso usando as pinças na placa de Petri de 35 mm.
  8. Sacode e esprema suavemente o ventrículo para que o sangue escoe do lúmen. Não danifice a parede ventricular ao lavar o coração.
  9. Transfira o coração para seu poço designado na microplaca de captura da ilhota e permita que ele afunde até o centro do poço apropriado, de acordo com o mapa de placas. Mantenha a placa em temperatura ambiente. Inclua todos os ventrículos no ensaio, mesmo que parem de bater visivelmente.
  10. Repita o processo para todos os peixes disponíveis. Ao comparar a atividade metabólica de diferentes grupos experimentais, sugerimos que você isole um coração por grupo em vez de todos os corações de um grupo antes de avançar para o próximo. Embora os corações possam sobreviver por pelo menos 180 minutos no analisador (Figura 3A), propomos que o isolamento ocorra um coração por grupo por vez como boa prática para garantir a distribuição igual do tempo no meio entre os grupos.
  11. Uma vez que todos os corações tenham sido isolados (aproximadamente 60 minutos para uma placa de 20 corações), coloque-os no fundo dos poços de microplacas de captura do ilhéu (Figura 2B) e posicione-os no centro do poço usando pinças finas (Figura 2D,E).
  12. Use uma pinça para cobri-las com a grade (aproximadamente 20 min) (Figura 2D). Certifique-se de que a grade esteja na orientação correta (malha voltada para baixo em direção ao coração) e não contenha grandes bolhas, pois isso pode interferir nas medições (Figura 2E).
    1. Uma vez que a grade esteja posicionada, use a pinça para empurrá-la pelas bordas até que um leve clique seja ouvido. Certifique-se de não fazer o coração colidir com a pinça através da grade.

7. Carregar as amostras no analisador e adquirir medições

  1. Uma vez que os corações estejam encerrados na microplaca de captura do ilhéu, verifique no software se todos os poços foram calibrados com sucesso, conforme indicado pelas marcas verdes na tela do computador. Agora ejete a placa utilitária pressionando a bandeja aberta.
    NOTA: O cartucho não será ejetado neste momento, e apenas a placa utilitária contendo o calibrante aparecerá.
  2. Troque a placa utilitária pela microplaca do ilhéu contendo as amostras na bandeja do analisador. Certifique-se de que a microplaca do ilhota esteja posicionada corretamente (A1 no canto superior esquerdo) e que a tampa tenha sido removida. A falha em remover a tampa danificará o analisador.
  3. Uma vez posicionada a placa do ilhéu, instrua o software a iniciar o experimento pressionando a placa da célula de carga. Durante aproximadamente os primeiros 10 minutos, os sensores realizam uma etapa de equilíbrio, e então as medições começam.
  4. Após a conclusão do experimento (aproximadamente 4 horas), pressione o cartucho de ejeção para que a bandeja abra e a microplaca e o cartucho do ilhéu sejam ejetados.
  5. Remova a microplaca e o cartucho do ilhéu, e pressione até fechar para a bandeja fechar. Neste ponto, pressione ver resultados para ver os dados coletados.
  6. Salve as medições, exporte-as do computador analisador e faça o upload na interface de análise para análise e processamento adicionais. Isso acionará a excisão da placa e do cartucho do ilhéu do analisador.
  7. Remova a placa e o cartucho do ilhéu do analisador e feche o cartucho usando a tampa.
  8. Congele a placa do ilhéu em gelo seco ou remova os corações dos poços (veja passo 8.2) e armazene a -20 °C caso o isolamento proteico para normalização (passo 8) não seja realizado imediatamente.
  9. Depois que os dados forem salvos, desligue o software, o analisador e o computador.
  10. Faça upload dos dados na interface de análise e visualize-os selecionando o gráfico OCR na opção de visualizações padrão . Na interface, veja os dados como nível ou taxa de OCR e ECAR, corrija o fundo com base nos poços vazios e selecione os poços para visualizar clicando no mapa de placas para fazê-los aparecer ou desaparecer.

8. Isolamento e quantificação de proteínas para normalização

  1. Prepare o tamponador de radioimunoprecipitação contendo inibidor de protease (RIPA) dissolvendo uma pastilha inibidora de protease em 10 mL de tampão RIPA e misturando bem.
  2. Se ainda não foi feito (passo 7.8), usando a ferramenta de inserção de tela de captura de ilhotas (Figura 2F), remova as grades da placa do ilhéu para liberar os corações. Remova os corações com cuidado, pois eles podem ficar presos na grade. Se for esse o caso, use a pinça para liberá-los. Se a grade não puder ser removida usando a ferramenta de inserção de tela, mova a placa sob o estereoscópio e, usando tesouras de microdissecação, corte cuidadosamente a grade para liberar o coração.
  3. Coloque cada ventrículo em um tubo de 1,5 mL contendo 200 μL de tampão RIPA enriquecido com inibidor de protease sobre gelo.
  4. Homogeneize o coração usando um homogeneizador com pilões descartáveis sobre gelo.
  5. Prepare os padrões diluindo a albumina sérica bovina (BSA) fornecida no tampão RIPA nas seguintes concentrações: 2000 μg/mL, 1500 μg/mL, 1000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 25 μg/mL, 0 μg/mL.
  6. Prepare a solução funcional Pierce BCA (50:1, reagente A: reagente B, conforme as instruções do fabricante). Calcule o volume do reagente de trabalho necessário usando a seguinte fórmula:
    (número de padrões + número de amostras) × 2 × 200 μL
    NOTA: Este volume permite o uso de 200 μL de solução de trabalho por amostra e padrão, e possibilita a obtenção de medições duplicadas por amostra e padrão.
  7. Em uma placa de 96 poços, adicione 25 μL de cada padrão e de cada amostra por poço em duplicados.
  8. Adicione 200 μL da solução de trabalho por poço.
  9. Incube a placa a 37 °C por 30 minutos.
  10. Deixe a placa esfriar até a temperatura ambiente por 10 minutos e fele usando um selante de placa. Certifique-se de que não haja bolhas nos poços, pois isso pode obstruir o leitor de placa. Se um número limitado de bolhas se formar, use uma ponta ou a pinça fina para estourá-las.
  11. Meça a absorvância a 562 nm usando um leitor de placa.
  12. Gerar uma curva padrão baseada na absorção dos padrões e calcular a concentração de proteínas das amostras.
  13. Registre a concentração de proteína na aba de normalização (Figura 2G) da interface analítica de cada poço.

9. Análise de dados

  1. Após normalizar em relação ao conteúdo proteico, exporte os dados da interface de análise como arquivos Excel ou Prism para análise adicional usando o botão cloud no canto superior direito do gráfico.
  2. Usando os dados normalizados, calcule o OCR e o ECAR de base como a média das medições de base, excluindo as três primeiras aquisições, pois o sinal pode ser instável nas primeiras medições.
  3. Usando os dados normalizados, para especificar o OCR e ECAR máximos, calcule as medições médias das três principais aquisições do tratamento FCCP.

Resultados

Esse protocolo permite a quantificação do OCR e do ECAR de ventrículos inteiros de peixe-zebra. Validamos a sobrevivência dos ventrículos em ambiente ex vivo , incubando ventrículos selvagens do tipo KCL não lesionados no analisador, na ausência de qualquer tratamento medicamentoso (Figura 3A). Os dados indicam que os ventrículos apresentam um OCR e ECAR estáveis, que estão significativamente elevados em relação às medições iniciais dos poços vazios por pelo menos 180 minutos (Figura 3A). Esses dados sugerem que os ventrículos apresentam função respiratória normal e sobrevivência nesse contexto ex vivo .

Realizamos várias medições de OCR usando diferentes concentrações de medicamentos e formulações de meios para identificar a dosagem ideal para os ventrículos (Figura 3B). Observamos um leve aumento na variação da dobra do OCR (FCCP/basal) ao utilizar as combinações [oligomicina] 10 μM, [FCCP] 8 μM e [rotenona/antimicina] 25 μM, e um aumento ligeiramente maior em [oligomicina] 50 μM, [FCCP] 30 μM e [rotenona/antimicina] 45 μM (Figura 3B). Como resultado, seguimos com as últimas concentrações para nossos experimentos. Como o ventrículo é uma estrutura 3D, é possível que os medicamentos atuem fortemente nas células externas do tecido, sem alcançar as células do lado luminal do ventrículo. Para resolver isso, realizamos uma etapa de permeabilização, onde tratamos os corações com saponina 0,5% por 30 minutos antes da incubação em DMEM (10 mM de galactose, 1 mM de piruvato, 4 mM de glutamina). Isso resultou em uma redução sustentada do OCR e ausência do aumento esperado do OCR após a injeção FCCP (Figura 3C), sugerindo que os corações estavam metabolicamente falhidos. Consequentemente, não permeabilizamos os ventrículos para nossos experimentos.

Além disso, apresentamos aqui os traços normalizados do nosso experimentooriginal 8. Aproveitando a variação natural no potencial regenerativo de sete cepas selvagens de peixe-zebra, identificamos o mdh1ab, a desidrogenase malato citosólica 1Ab, como tendo um efeito benéfico na regeneração por meio da rediferenciação de cardiomiócitos. Para validar essa descoberta, produzimos peixes-zebra transgênicos que superexpressam mdh1ab de maneira específica para cardiomiócitos (mdh1ab cOE) e peixes controlem que superexpressam proteína fluorescente verde (GFP c OE). Criolesionamos seus ventrículos, coletamos a 14 dpci e investigamos seu metabolismo usando o teste de esforço Mito (Figura 3D). O tratamento com oligomicina não alterou significativamente a TOC, embora tenha sido observado um leve aumento na REC. A injeção de FCCP no meio resultou no aumento esperado do OCR e ECAR, com as amostras de mdh1ab c OE mantendo a maior capacidade respiratória máxima (Figura 3D). Por fim, rotenona/antimicina levou ao desuso completo do metabolismo em ambos os grupos. No geral, esse método nos permitiu identificar diferenças significativas na capacidade metabólica dos ventrículos que sobreexpressam mdh1ab e entre sete diferentes cepas de peixe-zebraselvagens 8.

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Figura 1: Metabolismo da glicose durante um teste de esforço de Mito. (A) Representação esquemática do metabolismo da glicose. A glicose entra na célula pelos transportadores GLUT e é convertida em piruvato por glicólise. A lactato desidrogenase (LDH) converte piruvato em lactato, e os prótons resultantes são secretados pela célula. O piruvato é convertido em acetil-CoA e entra no ciclo das mitocôndrias e do TCA para alimentar a cadeia de transporte de elétrons respiratórios na membrana mitocondrial interna. Os inibidores dos complexos I, III e V, assim como o desacoplador FCCP, são indicados em vermelho. Elétrons transferidos através da cadeia respiratória de transporte de elétrons são indicados por setas azuis, que eventualmente levam à conversão de oxigênio e prótons em água. (B) Esquema dos resultados do teste de estresse Mito. A respiração basal é observada em magenta. Após a injeção de oligomicina, o OCR diminui, permitindo o cálculo da respiração ligada ao ATP (verde) e do vazamento de prótons (laranja). A FCCP aumenta o OCR até a capacidade respiratória máxima das células (azul). A injeção de rotenona e antimicina A leva ao desligamento da respiração mitocondrial e só permite que a respiração não mitocondrial ocorra (cinza). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Layout de microplacas de captura de cartuchos e ilhotas de sensor. (A) Imagem do complexo cartucho sensor de tampa, reforçador hidroelétrico e placa utilitária (em cima) e do cartucho sensor invertido (em baixo). Barra de escala: 1cm. (B) Imagem de uma microplaca de captura de ilhéu carregada com ventrículos de peixe-zebra. Os círculos vermelhos indicam os poços vazios que não contêm ventrículos e servirão como correção de fundo durante a análise. Barra de escala: 1cm. (C) Representação esquemática do layout das portas no cartucho sensor XFe24. A porta A contém oligomicina, B contém FCCP e C contém a mistura rotenona/antimicina. O porto D pode ser deixado vazio, ou um medicamento extra pode ser adicionado. S indica a porta do sensor, que não deve conter nenhum líquido para não danificar o analisador. (D) Imagem representativa de um ventrículo de peixe-zebra no fundo do poço, cercado pela grade (esquerda) e sem grade (direita). Barra de escala: 5mm. (E) Seção transversal esquemática da microplaca de captura do ilhéu contendo um ventrículo, a grade (amarela) e o cartucho sensor (verde). P indica as portas e S o sensor. A linha ondulada representa o meio. (F) A ferramenta de inserção de tela de captura de ilhéu. Barra de escala: 1 cm (G) Ícone da aba de normalização na interface de análise. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Medições representativas de OCR e ECAR dos ventrículos do peixe-zebra. (A) Traços representativos de OCR e ECAR de ventrículos selvagens de peixe-zebra não lesionados (cepa KCL) que não foram tratados com os inibidores usados no ensaio (n = 2, linha vermelha). Os traços resultantes de poços vazios que não contêm material biológico são apresentados em cinza (n = 4); OCR, medidas repetidas bidirecionais ANOVA, fator de tempo P = 0,0200, tempo × interação do poço P = 0,0196, fator do poço P < 0,0001, fator de grupo P < 0,0001; ECAR medidas repetidas bidirecionais ANOVA, fator de tempo P = 0,1323, tempo × interação do poço P = 0,0216, fator de poço P = 0,0009, fator de grupo P<0,0001; dados apresentados como média ± MEB. (B) variação da dobra do OCR com várias concentrações de medicamentos e meios usados. ANOVA unidirecional (P = 0,0032) com o teste de comparações múltiplas de Tukey. [O] 5 μM, [F] 4 μM, [RA] 2 μM, n = 6; [O] 10 μM, [F] 8 μM, [RA] 25 μM, n = 8; [O] 25 μM, [F] 16 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 50 μM, [F] 30 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 100 μM, [F] 60 μM, [RA] 90 μM, n = 8. O, oligomicina; F, FCCP; AR, rotenona/antimicina. (C) Traço de ventrículos permeabilizados com saponina (vermelho, n = 4) em comparação com ventrículos não tratados (cinza, n = 4); medidas repetidas bidirecionais ANOVA, fator de tempo P < 0,0001, tempo × interação amostral P < 0,0001, fator de tratamento P < 0,0001, fator amostral P = 0,824; dados apresentados como média ± MEB.TOC máximo de ventrículos tratados com saponina em comparação com ventrículos não tratados; teste t do aluno não pareado (P = 0,0850). (D) Traços representativos de OCR e ECAR dos ventrículos 14dpci de mdh1ab cOE (vermelho, n = 8) e GFP cOE (cinza, n = 8). OCR, medidas repetidas bidirecionais ANOVA, fator de tempo P < 0,0001, tempo × interação amostral P < 0,0001, fator genótipo P < 0,0001, fator amostral P = 0,1098; ECAR, medidas repetidas bidirecionais ANOVA fator de tempo P < 0,0001, tempo × interação da amostra P = 0,7507, fator amostral P = 0,2154, fator genótipo P < 0,0001. Dados adaptados de Lekkos et al., 20258 e apresentados como média ± SEM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, descrevemos em detalhes o protocolo para analisar o OCR e o ECAR dos ventrículos de peixe-zebra ex vivo usando o analisador Seahorse XFe24 e o teste de estresse Mito. O metabolismo dos cardiomiócitos desempenha um papel essencial na regeneração cardíaca 21,22,23,24. No entanto, a validação do fenótipo metabólico do coração do peixe-zebra regenerativo tem sido desafiadora e frequentemente falta nas publicações 6,7. Devido ao pequeno tamanho do coração do peixe-zebra, técnicas como espectroscopia de RMN ou espectrometria de massa exigem o agrupamento de vários ventrículos para adquirir sinaladequado 8,12,13. Em contraste, o método que descrevemos aqui permite a obtenção de medições de OCR e ECAR de múltiplos ventrículos individuais, aumentando assim o poder estatístico.

Métodos clássicos de perfil metabólico, como a metabolômica, fornecem um retrato do perfil metabólico do tecido no momento em que foi coletado. Por meio do teste de estresse de Mito, conseguimos coletar dados em tempo real e ao vivo sobre como os ventrículos estão se adaptando a vários desafios metabólicos, incluindo sua capacidade máxima respiratória, o que não é evidente ao usar outras metodologias. Para alcançar a fenotipagem viva dos ventrículos do peixe-zebra, foi tentada a perfusão do coração dopeixe-zebra 9,10,11. Isso requer equipamentos personalizados complexos e técnicos altamente qualificados para alcançar a canulação, permanecendo um método de baixo rendimento. O analisador oferece uma alternativa mais simples usando um equipamento comercialmente disponível para fenotipagem de ventrículos de alta produtividade (20 ventrículos por vez). Até onde sabemos, não houve comparação direta do método descrito neste artigo com outras técnicas de oximetria viva, como um eletrodo do tipo Clark.

Importante, o método que descrevemos é adaptável dependendo da questão de pesquisa. O ensaio já foi usado anteriormente para caracterizar embriões inteiros depeixe-zebra 25,26. Além do teste de estresse Mito descrito aqui, o teste Mito Fuel Flex foi otimizado para avaliar a utilização metabólica do combustível em fatias cardíacashumanas 27. Além disso, o teste do fenótipo de energia celular foi adaptado para caracterizar a capacidade glicolítica dos corações regeneradores de Astyanax mexicanus 28. Prevemos que esse protocolo será utilizado para outras estruturas 3D, como organoides cardíacos, e será útil para validar perturbações genéticas das vias metabólicas em corações de peixe-zebra não lesionados.

Reconhecemos que essa técnica tem certas limitações. Em termos de desafios técnicos, após o isolamento, os corações foram manuseados em meio DMEM que estava à temperatura ambiente e não mantido em 28 °C, que é a temperatura ideal para o peixe-zebra19. Reduzir a temperatura da água para 18 °C pode ter efeitos significativos na função do coração in situdo peixe-zebra (29,30). No entanto, não esperamos que a exposição de curto prazo à temperatura ambiente tenha um efeito significativo na fisiologia dos ventrículos isolados, pois os ventrículos retornam rapidamente ao analisador de 28 °C. Em nossas mãos, a maioria dos ventrículos parou de bater visivelmente ao dissecar o átrio, apontando para a ausência de estímulo do marcapasso como uma etiologia da não contração. Além disso, durante o período de isolamento, o meio não foi oxigenado, o que pode levar a uma leve hipóxia, que se recupera aos níveis normais de oxigênio após a mistura no analisador antes da primeira medição.

Uma consideração prática adicional sobre a temperatura dos corações também está relacionada ao aquecedor desligado no analisador, levando assim a uma redução da temperatura de 37 °C para 28–29 °C. O analisador não permite a redução da potência do aquecedor para a temperatura desejada. No entanto, quando o analisador está em funcionamento, a temperatura dentro da bandeja é 6–7 °C maior do que a temperatura ambiente. Essa faixa de temperatura coincide com a temperatura ideal para a criação depeixes-zebra, 19.

Este ensaio é realizado em ventrículos de peixe-zebra em grande volume. Consequentemente, é impossível distinguir as contribuições de tipos celulares individuais para as mudanças observadas no OCR e no ECAR. Isso pode se mostrar de grande importância ao investigar as taxas metabólicas dos primeiros momentos de regeneração, quando o alto influxo de célulasimunológicas pode mascarar as alterações de TOC dos cardiomiócitos. Além disso, o sangue residual restante no lúmen ventricular pode influenciar as leituras metabólicas. Permitir que o coração sangre na presença deheparina 7 pode reduzir ainda mais a influência da coagulação das células sanguíneas no coração. Além disso, para aumentar a difusão dos inibidores usados em direção às células internas do ventrículo, tentamos uma etapa de permeabilização usando saponina. A permeabilização da saponina levou a uma queda sustentada na OCR durante todo o ensaio, levando os ventrículos à insuficiência respiratória. Essas limitações poderiam ser evitadas pelo isolamento, cultura e análise de cardiomiócitos isolados, embora essa abordagem exija a cultura prolongada das células32 , o que pode não ser ideal para um ambiente regenerativo.

O tecido lesionado pode influenciar o método de normalização utilizado. Neste estudo, normalizamos o OCR por μg de proteína/mL usando o ensaio BCA. Embora o ensaio BCA não reaja fortemente com proteínas de colágeno devido à sua composição rica em hidroxiprolina e prolina, que são pouco detectadas usando coper, a presença de outros componentes da ferida desprovidos de células pode influenciar a normalização. Estudos futuros poderiam considerar o uso do DNAtotal 33 como um reflexo preciso das células vivas no ventrículo.

Além disso, não conseguimos reproduzir a redução prevista na OCR causada pela inibição dependente de oligomicina do complexoV 15. Embora certos estudos mostrem redução da OCR pelo tratamento com oligomicina em cardiomiócitosisolados 32,34,35, os dados aqui se assemelham à falta de resposta relatada em um estudo recente em cardiomiócitos adultos isolados 36. Como a concentração de oligomicina que usamos é significativamente maior do que a relatada nos estudos mencionados, não está claro se aumentar a concentração final para mais de 50 μM teria algum efeito.

Por fim, embora o consumo de oxigênio dependa principalmente da respiração, a acidificação extracelular não é exclusivamente impulsionada pelo lactato produzido pela glicólise, mas também pela conversão do dióxido de carbono em ácido carbônico. Foi relatado que, em mioblastos alimentados com glicose, um terço da acidificação extracelular resulta do dióxido de carbono nas condições de base37. Consequentemente, aconselhamos cautela na interpretação das medições ECAR resultantes do analisador Seahorse se nenhuma correção para a proporção da acidificação impulsionada pelarespiração for realizada 38.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Somos gratos a Nick Howe (Agilent Technologies) e Thomas Nicol (Universidade de Oxford) pelo apoio e discussão crítica durante o desenvolvimento desse método. Gostaríamos de reconhecer a equipe de nossa unidade animal no Nível 1 (Unidade de Serviços Biomédicos da Universidade de Oxford) e do Instituto de Medicina do Desenvolvimento e Regenerativa (Universidade de Oxford) pela manutenção e transferência do peixe-zebra. Esse trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa Médica (MR/W006731/1 para KL), King Faisal Specialist Hospital & Research Centre (bolsa de pós-doutorado para RA), Wellcome Institutional Strategic Support Fund (204826/Z/16/Z para JSOM), British Heart Foundation IBSRF (FS//17/58/33072 para LCH), Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia (715895, CAVEHEART, ERC-2016-STG para MTMM), bolsas de projeto da British Heart Foundation (PG/15/111/31939 e PG/23/11189 para MTMM), o MTMM reconhece o apoio do BHF Oxford Centre of Research Excellence, Universidade de Oxford (RE/24/130024) e do BHF Centre of Regenerative Medicine (RM/13/3/30159).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,5ml tubos Eppendorf  StarlabS1615-5550
Placa de 96 poços  ThermoFisherAB-0800
Antimicina AChemCruz & nbsp;SC-202467A
Meio DMEMAgilent1035755-100
DMSOSigma-Aldrich D2650-100mL
Gelo seco 
EtanolSupelco1.00983.2500
Kit de Ensaio de Fluxo Extracelular  Agilent103518-100O pacote contém placa utilitária, hidrobooster, cartucho sensor, tampa (vem com as placas do ilhéu)
FCCPSigma-Aldrich C2920
GlicoseAgilent103577-100
GlutaminaAgilent103579-100
Incubadora
Microplacas de captura de ilhotasAgilent101122-10025 grades incluídas no pacote
Ferramenta de captura de tela de ilhéuAgilent101135-100
Pinças de microdissecaçãoideal-tek3131760Tamanho 5-S (serão necessários 2x para isolar o ventrículo do bulbo arterioso e do átrio)
Tesouras de microdissecaçãoFST15009-08
MS-222Sigma-Aldrich E10521
OligomicinaMP 151786
Homogeneizador de mottor de pilão VWR431-0100
PilõesVWR431-0094
Placa de Petri 35mmGreiner Bio-One627102
Placa de Petri 92mmStarstedt82.1473
Kit de Ensaio BCA PierceTermo Científica23227
Comprimidos Mini Inibidores de Protease e Fosfatase Pierce, Livres de EDTATermo CientíficaA32961
PiruvatoAgilent103578-100
Buffer de lise RIPASanta CrusSC-364162
RotenoneMP 02150154-CF
Interface Agilent da Seahorse AnalyticsAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
Analisador Seahorse XFe24Agilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
SelanteTermo CientíficaAB-0558
SPECTROstar NanoMG LABTECH GmbH601-0298
SpongeFaça uma incisão longa e profunda o suficiente para encaixar o lado ventral do peixe para cima
Wave (versão 2.6.1.56)Agilenthttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
Calibrante XF  Agilent100840-000

Referências

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