Um componente bioativo do pêndulo Aconitum atenua a inflamação relacionada à artrite reumatoide em ratos por meio da regulação da via PI3K/Akt

Resumo

Utilizando farmacologia em rede e acoplamento molecular, componentes da artrite anti-reumatoide (AR) de A. pendulum foram identificados. Estudos in vivo mostraram que alcaloides diterpenos, especialmente a smirnotina A, aliviam os sintomas da AR em ratos por meio da via PI3K/Akt.

Resumo

Na medicina tradicional chinesa e em várias práticas médicas étnicas, as raízes do pêndulo Aconitum N. Busch são comumente usadas por sua capacidade de dragar meridianos, dissipar reumatismo, promover a circulação sanguínea e aliviar a artralgia. Como resultado, essa planta medicinal tornou-se um tratamento bem respeitado para entorses e doenças reumáticas em diferentes sistemas médicos étnicos. Este estudo investigou os mecanismos pelos quais seis compostos previamente isolados de A. pendulum amenizam a inflamação relacionada à artrite reumatoide (AR) usando abordagens in vitro e in vivo . Uma combinação de técnicas, incluindo farmacologia em rede, acoplamento molecular, ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA), coloração de hematoxilina e eosina (H&E), reação em cadeia quantitativa em tempo real da polimerase (q-PCR) e western blot (WB), foi empregada. Os resultados demonstraram que a smirnotina A, um dos seis compostos, alivia os sintomas da AR ao direcionar a via de sinalização PI3K/Akt e suprimir a resposta inflamatória. Esses achados fornecem uma base científica para entender a base material e a ação mecanicista subjacente ao uso tradicional de A. pendulum no tratamento da AR.

Introdução

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune crônica caracterizada por inflamação sinovial, hiperplasia do revestimento sinovial, infiltração de células imunes, formação de tecido pano invasivo e consequente destruição^{articular 1,2,3}. Com uma prevalência global de 0,5%–1%, a AR representa um ônus significativo para a saúde pública e impacta severamente a qualidade de vida dos^pacientes 4,5,6,7. Terapias convencionais — como metotrexato (MTX), glicocorticoides, inibidores da Janus quinase (JAK) e anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) — são frequentemente limitadas por efeitos adversos e resposta variável do paciente, ressaltando a necessidade de tratamentos^{inovadores 8}.

Produtos naturais, especialmente alcaloides, ganharam atenção por seus mecanismos multi-alvo e perfis de segurança favoráveis no manejo da AR. Alcaloides como berberina, sinomenina e matrina modulam as principais vias inflamatórias, incluindo a proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), o fator nuclear kappa B (NF-κB), fosfatidilinositol 3-quinase/proteína quinase B (PI3K/Akt), e a quinase Janus/transdutor de sinal e ativador de transcrição (JAK/STAT) e regulam citocinas como fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina (IL)-1β e IL-6, demonstrando potencial^{terapêutico 9. 10}.

Na medicina tibetana, a AR é classificada como brum bu (artralgia de umidade), atribuída a um desequilíbrio dos três humores e ao acúmulo de água amarela imatura nas^{articulações 11,12} (Figura 1). Aconitum pendulum N. Busch é uma erva tradicionalmente usada para expulsar a umidade, promover a circulação e aliviar a dor^13,14. Mais de 50 formulações clássicas tibetanas contendo essa erva foram documentadas, com um histórico de uso clínico que abrange mais de 300 anos^15,16. No entanto, seus componentes e mecanismos bioativos permanecem pouco caracterizados.

Aqui, combinamos farmacologia em rede e acoplamento molecular para prever os constituintes anti-AR do pêndulo Aconitum N. Busch e seus potenciais alvos e vias. Essas previsões são posteriormente validadas experimentalmente (Figura 2). Essa abordagem integrada visa elucidar a base material e os fundamentos mecanicistas do pêndulo do Aconitum N. Busch no tratamento da AR, fornecendo uma base para o desenvolvimento futuro de medicamentos.

Protocolo

Cinquenta ratos machos específicos de patógenos (FPS) de Sprague-Dawley (pesando entre 180 e 200 g) foram fornecidos pelo Centro Provincial de Controle e Prevenção de Doenças de Hubei (Academia Provincial de Medicina Preventiva de Hubei) (Wuhan, China; Certificado de Licença de Animal nº SCXK(JB) 2023-0005). Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos em estrita conformidade com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição, 2011). O protocolo do estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Experimental de Animais da Tianjin Genink Biological Technology Co., Ltd. (Aprovação nº GENINK-20250074). Reagentes e equipamentos chave usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais que acompanha.

Cultura celular
A linhagem celular MH7A da artrite reumatoide humana (AR) foi cultivada no meio Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e mantido a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO^₂17.

Animais e tratamentos
Os animais eram mantidos em uma instalação padrão livre de patógenos específicos (SPF) com um sistema de gaiola ventilada individualmente (IVC) sob condições ambientais estritamente controladas: temperatura climatizada de 21,0–25,0 °C, umidade relativa de 40–70%, fotoperíodo de 12 horas e renovação completa do ar 15 vezes por hora. Após um período de aclimatação de 7 dias, os ratos foram divididos aleatoriamente em seis grupos experimentais, com ratos adicionais reservados como reserva para circunstâncias imprevistas. Um modelo agudo de artrite inflamatória adjuvante (AA) foi induzido por injeção subcutânea de 100 μL de adjuvante de Freund completo (CFA; 10 mg·^mL-1) na pata traseira direita¹⁸. Os grupos experimentais foram desenhados da seguinte forma: grupo controle em branco, grupo modelo AA, grupo controle positivo (metotrexato, 0,9 mg^·kg-1)¹⁹ e três grupos de tratamento com smirnotina A administrados em níveis baixos (0,962 mg·^kg-1), médios (1,923 mg·^kg-1) e doses altas (3,846 mg·^kg-1) baseados no valor IC₅₀.

Previsão de alvos de doenças e compostos
Com base na triagem preliminar de atividade realizada por nosso grupo de pesquisa, seis compostos que demonstraram bioatividade favorável foram selecionados para investigação: cinco alcaloides diterpenoides (Figura 3), benzoilaconina (1), 14-benzoil-8-O-metilaconina (2), (−)-(A-b)-14α-benzoiloxi-N-etil-13β, 15α-dihidroxi-1α,6α,8β,16β,18-pentametoxiaconitano (3), smirnotina A (4) e aconitina (5), juntamente com um derivado da cumarina, escopoletina (6)²⁰. As notações simplificadas do sistema de entrada molecular de entrada de linha (SMILES) desses compostos foram recuperadas do banco de dados PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/) ou geradas usando o ChemDraw 18.0. Essas notações foram posteriormente importadas para o banco de dados SwissTargetPrediction (https://swisstargetprediction.ch/), com a espécie especificada como "Homo sapiens". Os alvos potenciais foram identificados selecionando genes com valor de probabilidade > 0, e os Nomes de Alvos e IDs UniProt correspondentes foram^{coletados 21,22.}

Redes PPI
Os genes-alvo sobrepostos foram analisados por uma rede de interação proteína-proteína (PPI) usando o banco de dados STRING (https://string-db.org/)²³. Os dados resultantes, formatados em TSV, foram então importados para o Cytoscape 3.9.1 para visualização e análise adicionais. Os parâmetros topológicos da rede foram calculados usando o plugin Network Analyzer embutido. Na rede visualizada, o tamanho do nó e a intensidade da cor foram mapeados ao valor de grau, enquanto a espessura das bordas refletia a intensidade da interação entre os alvos. Os alvos centrais foram identificados e classificados com base no grau^{de associação 24}.

Análise de enriquecimento de vias da Ontologia Genética (GO) e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG)
Os alvos comuns foram submetidos ao banco de dados Metascape (https://metascape.org) para análises de enriquecimento de vias GO^{e KEGG 25}. Os resultados funcionais foram visualizados usando a plataforma de bioinformática WeiShengXin (https://www.bioinformatics.com.cn).

A construção da rede dos "componentes ativos de medicamento-alvos-doenças-vias"
Componentes ativos e seus alvos correspondentes foram sistematicamente triados, seguidos por uma análise de enriquecimento funcional para identificar as principais vias de sinalização e seus alvos associados. Esses elementos foram posteriormente integrados usando o Cytoscape 3.9.1 para construir uma rede abrangente de "fármaco–componentes ativos–doença–alvos–vias". A análise topológica foi então realizada com a ferramenta Network Analyzer, na qual os nós eram classificados com base em parâmetros-chave, incluindo Grau e Intermediedade, para identificar elementos centrais dentro da rede.

Acoplamento molecular de compostos-chave a alvos centrais
As estruturas tridimensionais das proteínas alvo centrais, incluindo ESR1 (9BQE), PTGS2 (5F19), EGFR (2XKN), GSK3B (5HLN), SRC (5MTJ) e ERBB2 (8U8X), foram recuperadas do Banco de Dados de Proteínas do RCSB (http://www.rcsb.org/; acessado em 7 de maio de 2025). Estruturas compostas foram construídas no ChemDraw (versão 18.0) e posteriormente convertidas para o formato SDF tridimensional usando o módulo integrado Chem3D. Os resultados do acoplamento molecular foram visualizados com PyMOL, e as afinidades de ligação foram avaliadas de acordo com a energia de interação (kcal·^mol-1)²⁶.

Ensaio de viabilidade celular
Células MH7A na fase de crescimento logarítmico foram semeadas em placas de 96 poços com uma densidade de 5 ×^{10 células 3} por poço. Ao atingir 80% de confluência, as células foram inicialmente tratadas com lipopolissacarídeo (LPS) (1 μg·^mL-1) por 6 horas e depois expostas a diferentes concentrações de smirnotina A (5, 25, 50, 75 e 100 μg·^mL-1). Cada grupo de tratamento foi montado em quadruplicado e incubado por 24 horas a 37 °C sob 5% de CO₂. Após a incubação, 100 μL de solução 10% de CCK8 foram adicionados a cada poço, seguidos por incubação adicional a 37 °C por 2 horas. A absorvância em 450 nm foi medida usando um leitor de microplaca.

Ensaio ELISA em células MH7A
O sobrenadante foi coletado por centrifugação a 2000 × g por 20 minutos a 4 °C. Os níveis de citocinas inflamatórias, incluindo IL-6, IL-1β, TNF-α e IL-10, foram quantificados no sobrenadante usando kits ELISA correspondentes, estritamente conforme as instruções do fabricante.

Medição do grau de inchaço dos dedos dos pés
O grau de inchaço da pata traseira direita foi avaliado medindo o volume da pata a cada 3 dias após a modelagem. As medições foram feitas duas vezes por rato e a média foi feita. A resposta inflamatória foi quantificada como o aumento percentual do volume das patas em relação ao valor inicial.

Medição do índice de órgãos
Todos os ratos foram anestesiados e eutanasiados 24 horas após a administração final. O método humanitário reconhecido pela comunidade veterinária internacional é adotado. Primeiro, uma alta concentração (5%) de isoflurano é usada para anestesiar profundamente o animal. Quando perde a consciência e todos os reflexos, o peito é aberto e o coração é cortado, garantindo que o animal morra sem dor e sem qualquer sensação. O baço e o timo foram prontamente excisados e pesados. Após a lavagem com soro fisiológico, o excesso de umidade nas superfícies dos tecidos foi removido por aplicação com papel filtrante, e os peso úmido dos órgãos foram^{registrados em 27,28}.

Hematoxilina e eosina (HE)
Para preservar a integridade das amostras de tecido da pata, toda a porção distal à articulação do tornozelo direito de cada rato foi coletada e armazenada. Para seccionar, foi usado o tecido inchado das patas. O procedimento de amostragem foi o seguinte: o tecido aproximadamente 1 cm acima da articulação do tornozelo direito foi completamente dissecado, o pelo foi removido e o eixo ósseo foi cortado na extremidade proximal. A amostra foi imediatamente fixada em solução de paraformaldeído a 10%. Após a fixação, o tecido foi colocado em solução descalcificante de EDTA a 15%. A descalcificação era monitorada a cada 3 dias, e a solução era renovada conforme necessário até que o tecido amolecesse, indicando a conclusão da descalcificação. O tecido foi então desidratado por meio de uma série graduada de etanol (75% por 4 horas, 85% por 2 horas, 90% por 1,5 hora, 95% por 1 hora, e duas mudanças de 100% de etanol por 0,5 hora). As seções foram desparafinizadas, reidratadas com etanol, tingidas com hematoxilina por 10 minutos, enxaguadas com água da torneira, diferenciadas em ácido clorídrico–etanol por 10 segundos, enxaguadas com água da torneira, azuladas, novamente enxaguarias, imersas em etanol 85% por 5 minutos, contra-tingidas com eosina por 5 minutos, enxaguadas com água da torneira por 3 segundos, desidratadas, limpas e montadas para^{observação 29}.

Ensaio ELISA do soro de rato
Amostras de sangue foram centrifugadas a 2000 × g por 20 minutos a 4 °C, e o sobrenadante resultante foi coletado para análise de citocinas. As concentrações de IL-1β, IL-6 e TNF-α foram determinadas usando kits ELISA comerciais, estritamente de acordo com os protocolos do fabricante. Uma curva padrão foi gerada e ajustada usando o software cvxpt32, e os níveis de expressão de cada citocina foram calculados interpolando os valores de absorção na equação correspondente da curva padrão. As concentrações finais de proteínas foram calculadas a partir das medições experimentais reais.

Análise quantitativa de reação em cadeia da polimerase (qPCR)
O RNA total foi isolado de células sinoviais usando o reagente TRIzol, com separação de fases alcançada pela adição^{de clorofórmio 30}. Um kit comercial de transcrição reversa foi então empregado para sintetizar cDNA a partir do RNA isolado, seguindo rigorosamente as instruções do fabricante. qRT-PCR foi realizada usando um reagente SYBR Premix. Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usada como gene de referência endógeno, e os níveis relativos de expressão gênica foram calculados usando o método ^2-ΔΔCt . As seguintes sequências de espoletas foram usadas: GAPDH Forward: ACAGCACAGGGTGTGGGGAC, e GAPDH Reverse: TTTGAGGGTGCAGCGAACTT; IL-17A Frente: CTGATGCTGTTGCTGCTGCTACTGA, e IL-17A Reverso: TGGAACGGTTGAGGTAGTCTGA; TRAF6 Frente: ACATTTCCCTCTTTGTCCACACAC, e TRAF6 Reverso: TTAGCATCCATGACCTCTTCGT; IL-10 Frente: CTGCAGGACTTTAAGGGTTACTT, e IL-10 Reverso: CTTGCTTTTTTCTCACAGGGA; IL-1β Frente: CCTGTGTGATGAAAGACGGC, e IL-1β Reverso: TATGTCCCGACCATTGCTGT; IL-6 Frente: GTTGCCTTCTTGGGACTGATG, e IL-6 Ré: TACTGGTCTGTTGTGGGTGGT.

Extração de proteínas e western blot
O tecido sinovial foi lisado em tampão de radioimunoprecipitação (RIPA) suplementado com fosfatase/inibidor de protease, e as concentrações de proteína foram medidas com um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA). Para o Western bloting, lisados contendo quantidades iguais de proteína foram submetidos à eletroforese em gel de dodecilo sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e posteriormente transferidos para membranas de polivinideno fluoreto (PVDF). Após bloqueio com leite desnatado 5% em soro tampão Tris com 0,1% Tween (TBST) por 2 horas a 25 °C, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários (GAPDH 1:50000; P-PI3K 1:1000; PI3K 1:1000; P-AKT 1:3000; AKT 1:6000). Após lavagem extensiva com TBST, as membranas foram reagidas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte (HRP) (Anti-Mouse IgG 1:10000; Anti-coelho IgG 1:1000) por 2 horas em temperatura ambiente. Após outra série de lavagens com TBST, as bandas proteicas foram visualizadas usando um substrato de quimioluminescência aprimorada (ECL). As intensidades das bandas foram quantificadas com o software ImageJ e normalizadas para GAPDH como controle de carga.

Análise estatística
Todos os dados foram analisados usando o software Graphpad Prism 9.5 e são apresentados como a média ±± desvio padrão. Comparações estatísticas foram realizadas usando ANOVA unidirecional quando apropriado. Um valor-p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Comparado ao grupo de controle: ^*p < 0,05, ^**p < 0,01, p < 0,001 e p < 0,0001; Comparado ao grupo Modelo/LPS: ^#p < 0,05, ^##p < 0,01, ^###p < 0,001 e ^####p < 0,0001.

Resultados

Efeitos dos derivados de A. pendulum no alvo anti-AR
As estruturas 3D dos seis compostos foram recuperadas no formato SDF, e os números SMILES foram enviados para o banco de dados SwissTargetPrediction para previsão de alvos. Alvos com probabilidade maior que 0 eram mantidos, e os resultados eram exportados como um arquivo CSV. Após a remoção de duplicados, um total de 97 alvos potenciais relacionados a compostos foi identificado.

...

Discussão

Este estudo integrado fornece novos insights mecanicistas sobre a atividade anti-artrite reumatoide da smirnotina A, um alcaloide C19-diterpenoide do pêndulo Aconitum N. Busch. Nossos achados demonstram que a smirnotina A ameniza a inflamação da AR por meio da inibição direcionada da via de sinalização PI3K/Akt, representando um mecanismo distinto dos alcaloides diterpenoides relatados anteriormente.

A combinação de predição de farmacologia em rede e ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	Vazyme	P111
Anticorpo monoclonal de camundongos AKT (60 kDa)	Biotecnologia Wuhan Sanying	60203-2-IG
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Biotecnologia Guangzhou Jiebeisi	G3522
Padrão BSA	Biotecnologia Guangzhou Jiebeisi	G8532
Meio Completo para células MH7A	Shanghai Fuheng Biotechnology	FH-MH7A
Kit ELISA para IL-10	Biotecnologia Lunchangshuo	ED-13626
Kit ELISA para IL-17A	Biotecnologia Lunchangshuo	ED-10344
Kit ELISA para IL-1 e beta;	Biotecnologia Lunchangshuo	ED-10351
Kit ELISA para IL-6	Biotecnologia Lunchangshuo	ED-10377
Kit ELISA para TNF-& alpha;	Biotecnologia Lunchangshuo	ED-11776
Sistema de PCR Quantitativo de Fluorescência	Biossistemas Aplicados	VIIA-7
Anticorpo monoclonal de camundongos GAPDH	Biotecnologia Wuhan Sanying	60004-1-IG
Centrífuga Refrigerada de Alta Velocidade	Equipamento de Instrumentos Kecheng de Hunan	HI-16KR
HiScript II Q Select RT SuperMix para qPCR	Vazyme	R223
Anticorpo secundário anti-camundongo marcado com HRP	Biotecnologia Wuhan Sanying	SA00001-1
Anticorpo secundário anti-coelho marcado com HRP	Beyotime Biotecnologia	A0208
Linha de sinócicitos semelhantes a fibroblastos da artrite reumatoide humana MH7A	Biotecnologia Qisai	QS-H075
Leitor de Microplacas	BioTek	MQX200
Microscópio	Leica	FLEXACAM C1
Leitor de Microplacas Multimodo	Dispositivos Moleculares	FlexStation 3
Anticorpo policlonal P-AKT (60 kDa) do coelho	Biotecnologia Wuhan Sanying	28731-1-AP
Microtomo de Parafina	Leica	RM 2016
Amplificador de PCR	Biossistemas Aplicados	proFlex
Soro Tamponado com Fosfato (1 e vezes; PBS)	Biotecnologia Qisai	QS-S001
Anticorpo policlonal de coelho PI3K (85 kDa)	Afinidade	AF6241
Anticorpo policlonal de coelho P-PI3K (85 kDa)	Afinidade	AF3242
Smirnotine A	Isolado e identificado pelo nosso laboratório	C39H49NO11
Desidratador de tecidos	Wuhan Junjie Electronic	JT-12J
Máquina de Embutimento de Tecidos	Wuhan Junjie Electronic	JB-L6
Máquina de Espalhamento de Tecidos e Assaria	Wuhan Junjie Electronic	JK-6
Trizol	Ambion	15596-026
Solução de Digestão Celular de Tripsina (0,25% de tripsina e nbsp; com EDTA, sem fenol vermelho)	Biotecnologia Qisai	QS-S401