Uso de RMN em solução para caracterizar condensados biomoleculares sob condições bifásicas

Resumo

Aqui apresentamos protocolos para metodologias de RMN, DIFfusão REstrita de espécimes invisíveis (REDIFINE) e DEtectioN CONdensate por Transferência de Magnetização SEmi-sólida (CONDENSE-MT), que permitem a caracterização quantitativa e sem rótulo de condensados biomoleculares sob condições bifásicas, revelando particionamento molecular, dinâmica de troca, hidratação de condensados e estrutura de gotículas sem sedimentação ou marcação.

Resumo

Condensados biomoleculares formados por separação de fases líquido–líquido (LLPS) organizam o ambiente intracelular e regulam diversos processos bioquímicos. Apesar de sua importância, sondar a composição de condensados, a dinâmica de troca e a organização interna continuam sendo desafiadoras, especialmente sem etiquetas externas. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) pode fornecer uma janela única, sem marcação, para essas assemblagens em mesoescala, capturando tanto o movimento molecular quanto a heterogeneidade ambiental. Duas metodologias complementares de RMN permitem uma caracterização abrangente dos condensados diretamente em seu estado bifásico. Para condensados que são dinâmicos o suficiente para serem observados por RMN, a abordagem de troca de difusão, REstricted DIffusion of INvisible speciEs, abreviada como REDIFINE, utiliza o contraste de difusão com a troca química para quantificar a fração de moléculas particionadas entre as fases condensada e diluída, determinar o tamanho das gotículas e a permeabilidade da interface, e extrair taxas de troca molecular através da fronteira de fase. Para condensados mais rígidos que são invisíveis na RMN, o método de magnetização-transferência semi-sólida detectado pela água, CONdensate DEtectioN por Transferência de Magnetização SEmi-sólida, ou abreviado CONDENSE-MT, explora o contraste de relaxamento e a troca de prótons entre biomoléculas condensadas e solvente em fase diluída para monitorar condensados nos prótons de água a granel, fornecendo acesso a particionamento relativo, taxas de rotação molecular, dinâmica de hidratação e conteúdo de água ligada. Juntas, essas abordagens oferecem uma visão multidimensional e quantitativa da estrutura e dinâmica do condensado sob condições bifásicas quase nativas, sem etiquetas fluorescentes ou de detecção. Sua integração amplia a caixa de ferramentas de RMN para estudar a separação de fases biomoleculares e estabelece uma base para conectar propriedades fisicoquímicas do condensado com sua função biológica e a má regulação patológica.

Introdução

As células alcançam sua extraordinária organização espacial e temporal ao compartimentalizar reações^{bioquímicas 1,2,3}. Além dos organelos ligados à membrana, muitos processos celulares cruciais ocorrem dentro de compartimentos sem membrana formados pela separação de fase líquido–líquido (LLPS) de proteínas e ácidos^{nucleicos 4}. Essas assembleias dinâmicas, frequentemente chamadas de condensados biomoleculares, incluem o nucléolo, grânulos de estresse, manchas nucleares e corpos de processamento, que desempenham papéis essenciais, por exemplo, no metabolismo do RNA, regulação da transcrição ou transdução^{de sinal 5,6}. Sua capacidade de formar, dissolver e trocar componentes em resposta a sinais ambientais oferece às células um mecanismo versátil para organizar atividades bioquímicas sem depender de membranas lipídicas.

Um grande subconjunto de condensados biomoleculares surge de proteínas de ligação a RNA (RBPs) que contêm regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) e domínios de ligação ao RNA (RBDs^)7,8. Essas proteínas podem se separar sozinhas ou em complexo com o RNA, originando condensados com diversas propriedades materiais e funções biológicas. Por exemplo, a proteína nucleocapsídea (N) do SARS-CoV-2 forma condensados biomoleculares^{dependentes de RNA 9} implicados no empacotamento e montagem do genoma viral, enquanto a proteína de ligação ao trato polipirimidina 1 (PTBP1) forma condensados nucleares que contribuem para o silenciamento^{gênico 10}. Além disso, proteínas como FUS e DDX4 sofrem LLPS impulsionadas por suas regiões desordenadas, influenciando o metabolismo do RNA e a formação de grânulos de^{estresse 11,12}. A desregulação desses processos está ligada a doenças neurodegenerativas como a esclerose lateral amiotrófica (ELA) e a demência frontotemporal, onde transições de fase aberrantes podem levar à agregação e à perda de função¹³.

A condensação não se limita a proteínas e complexos proteína–RNA. O RNA sozinho pode sofrer LLPS, especialmente no contexto de sequências de expansão repetida associadas a vários distúrbios^{neurodegenerativos 14,15}. Expansões repetidas de trinucleotídeos e hexanucleotídeos, como a CAG na doença de Huntington ou a CUG na distrofia miotônica, podem formar condensados semelhantes a gotículas tanto in vitro quanto em células¹⁴. Compreender a base física da condensação de RNA, bem como como ela difere dos condensados impulsionados por proteínas e proteínas e RNAs, é crucial para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes às doenças de expansão repetida.

Apesar de sua importância biológica, a caracterização quantitativa e sem rótulo dos condensados biomoleculares continua sendo um desafio^{formidável 16}. As técnicas convencionais de microscopia e espectroscopia de fluorescência dependem de marcadores externos, que podem perturbar a estrutura, dinâmica ou comportamento de fases da^{biomolécula 17,18}. Além disso, alguns condensados são invisíveis à RMN devido ao movimento molecular restrito e à forma de linhas amplas, limitando a informação acessível pelas abordagens tradicionais de RMN. Consequentemente, há uma necessidade urgente de estratégias experimentais que possam sondar condensados diretamente em seu estado bifásico, semelhante ao nativo, sem rotulagem. Dado o papel importante da fronteira da fase das gotículas nos processos de troca e na maturação do condensado, é igualmente importante estabilizar gotículas biomoleculares dentro de um determinado volume de amostra, evitando assim a sedimentação da fase densa. Isso pode ser facilmente alcançado usando os hidrogéis de agarosa que imitam o citoesqueleto.

Desenvolvimentos recentes em metodologias baseadas em RMN fornecem essa solução. A abordagem REDIFINE (REstricted DIffusion of INvisible speciEs)¹⁹ combina RMN por difusão com análise de troca química para quantificar particionamento molecular, cinética de troca e tamanho de gotículas em condensados de proteína e proteína–RNA. Complementarmente, a técnica CONDENSE-MT (CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer)²⁰ detecta condensados invisíveis por RMN por meio de transferência de magnetização de água, permitindo quantificar a quantidade de matéria condensada em dadas condições e revelando ainda mais dinâmicas de hidratação e taxas de rotação molecular dentro do condensado. Juntos, esses métodos possibilitam investigações não invasivas e sem marcadores de diversos tipos de condensados, apenas proteínas, proteínas–RNA e apenas RNA sob condições bifásicas de equilíbrio. Ao expandir a caixa de ferramentas da RMN, eles abrem a porta para uma exploração sistemática e quantitativa da estrutura do condensado, dinâmica e suas conexões com a função biológica e as doenças.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Escolha de tampão: Use tampões testados nos quais as biomoléculas são mais estáveis.
   NOTA: Os sinais de RMN são tipicamente mais fortes em pH mais baixo. Como requisito técnico, adicione 5% de D₂O como bloqueio de campo a todas as amostras de RMN (v/v final).
2. Estabilize a amostra bifásica, usando um hidrogel de agarosa que imita o citoesqueleto como meio. Pese o pó de agarosa para preparar um estoque de agarose de 1,5% (p/v) no mesmo tampão. Use agarose comum como alternativa mais barata para condensados biomoleculares formados por proteínas intrinsecamente desordenadas (IDPs) e RNAs que suportam temperaturas mais altas. Use agarose de baixa fusão ao preparar condensados delicados envolvendo proteínas que contêm domínios^{dobrados 19}.
3. Preparação do estoque de agarose: Aqueça a suspensão a cerca de 80 °C por 10 minutos e dissolva completamente a agarose misturando ou fazendo vórtice.
   ATENÇÃO: A agarose derretida é quente e pode queimar; Manipulação com luvas resistentes ao calor.
   NOTA: Mantenha a agarose derretida aquecida (por exemplo, 55 °C para agarose comum e 37 °C para agarose de baixa fusão) em banho-maria para permanecer líquida antes de misturar com a amostra biológica.
   A agarose derretida pode ser mantida quente por várias dezenas de^{minutos 19,21}.
4. Prepare a amostra bifásica final:
   1. Para preparar uma amostra bifásica estabilizada por hidrogel de agarose, misture estoques de proteína (e/ou RNA) com o respectivo tampão quente de agarose em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: A concentração final de proteína/RNA é tipicamente de 50-500 μM para ser adequada para a detecção por RMN.
   2. Transfira imediatamente a mistura para um tubo de RMN de 3 mm usando uma longa pipeta de vidro. Deixe a agarose solidificar logo após a transferência.
      NOTA: Sem a agarose, a amostra bifásica sedimenta ao longo do tempo, complicando a aquisição e análise dos dados de RMN porque a amostra muda fisicamente na escala temporal do experimento.
5. Realize uma inspeção visual: Inspecione a amostra visualmente. Se ocorrer separação de fase, a amostra aparece imediatamente turva e permanece assim. Isso indica que a amostra bifásica foi estabilizada com sucesso na agarose.
6. Ao planejar rodar o CONDENSE-MT, prepare uma amostra adicional de referência de agarose fazendo os mesmos passos, apenas omitindo a adição da biomolécula. Adicione o buffer para obter o mesmo volume de amostra. Prepare essa amostra somente após preparar a amostra de condensado e medir todos os dados nela para garantir que a amostra de referência de agarose não seja incubada por mais tempo.

2. Gravação de experimentos REDIFINE

1. Trave, faça o shim, combine e sintonize o canal ¹H normalmente. Calibre o comprimento do pulso de 90° em ¹H usando seu procedimento geral.
2. Grave um espectro 1D com supressão de água. Idealmente, um sinal biomolecular forte é observado (Figura Suplementar 1A).
   1. Se nenhum ou muito pouco sinal for observado, assuma que a proteína/RNA condensada não é observável por RMN e que a partição na fase condensada é alta. Nesse caso, não prossiga com o REDIFINE, pois essa metodologia depende de um sinal biomolecular observável.
   2. Nessa situação, em princípio, experimentos CONDENSE-MT devem funcionar muito bem, então pule imediatamente para o Passo 4 (Gravação dos experimentos CONDENSE-MT).
3. Carregue o experimento convencional de Espectroscopia Ordenada por Difusão (DOSY) que se baseia em um procedimento convencional de Ecocardiograma Estimulado 2D usando gradientes bipolares (sequência de pulsos de Bruker: stebpgp1s19). Consulte os manuais do usuário do Bruker DOSY e Diffusion para mais detalhes.
4. Ajuste P0, P1 e P27 para o comprimento calibrado de pulso de 90°. Defina como regra geral NS para 32 varreduras, DS para 16, TD1 para 16, e ajuste TD2 e SW2 para resultar em tempo de aquisição de 80-100 ms. Defina d1 para 1,5 s.
   NOTA: Os gradientes devem ser devidamente calibrados.
5. Otimize o atraso do Watergate d19 normalmente de acordo com seu campo magnético, para obter excitação máxima em aromáticos (aprox. 7 ppm) ou alifáticos (aprox. 1 ppm). Ajuste o d20 para 75 ms. A escolha do p30 dependerá do tamanho da proteína/RNA. Para proteínas >20 kDa, use 5 ms; Para proteínas menores, use 3,5 ms como regra geral.
6. Registre um experimento DOSY pelo comando: 'xau dosy 2 95 16 l y y', que organiza a intensidade do gradiente de difusão de 2 a 95 % em 16 passos, de forma linear.
   1. Idealmente, deve-se observar o decaimento inicial do sinal decorrente da fase diluída, enquanto o decaimento do sinal de fase condensada deve estabilizar (Figura 1A e Figura Suplementar 1B).
7. Para continuar adquirindo dados para o conjunto completo de REDIFINE, crie 9 novos stebpgp1s19 copiando os parâmetros do inicial que você acabou de rodar. Em cada experimento consecutivo, mudar apenas o atraso de difusão d20 em passos variáveis para cobrir a faixa de 100–1000 ms (ou seja, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 1.000 ms).
8. Execute cada um desses experimentos pelo comando 'xau dosy 2 95 16 l y n'. O último "n" garante que o ganho do receptor seja preservado ao longo dos 10 experimentos.

3. Processamento de conjuntos de dados REDIFINE e visualização dos resultados

1. Processe cada experimento (10 no total) da seguinte maneira:
   1. Defina qsine de SSB 2 como função janela, extraia a^5ª fatia usando qsin; fp, faça fases no 1D e salve os parâmetros de fase no conjunto de dados 2D.
   2. Depois, processe 2D com xf2, faça a correção de linha de base abs2 e extraia essas 16 fatias com split2D (entradas adicionais na janela pop-up: r – 16 – 11). Isso extrairá 16 espectros adquiridos usando diferentes intensidades de gradiente e os salvará como experimentos processados em 1D de 11 a 26 dentro do mesmo conjunto de dados.
   3. Repita o mesmo para os 9 experimentos restantes. Às vezes, é crucial verificar pelo menos as primeiras 4-5 fatias para garantir que a fase e a correção de linha de base estejam corretas. Se necessário, corrija manualmente – uma boa fase e linha de base são pré-requisitos para uma quantificação adequada (Figura 1B).
2. Use o código Matlab fornecido LLPS_REDIFINE_fit para a análise (Figura Suplementar 2A). No código, ajuste de acordo com seus experimentos o seguinte: 'Delta' (difusão vezes d20), 'P.d' (duração total do gradiente 2*p30), exp(1.:) para exp(10.:) baseado no # dos experimentos que você executou. Depois, defina P.G de acordo com a intensidade do gradiente da sua sonda (acessível na pasta do experimento TopSpin no arquivo "difflist").
3. Ajuste a 'pasta' e o 'caminho' com base na localização dos seus dados. Execute o código até a linha 40. Isso vai te dar a fatia 1D – a partir daqui, escolha as regiões de integração; Esses devem abranger aromáticos ou alifáticos, e escolher a região o mais estreita possível, sem considerar diferentes grupos moleculares como as amidas.
4. Insira as fronteiras de integração nos pontos das variáveis 'esquerda' e 'direita' conforme (Figura Suplementar 2A). Isso é para integrar os dados para a análise quantitativa (Figura 1C). Escolha o nome da matriz de acordo com sua amostra, data de execução e alguns detalhes experimentais.
5. Roda todo o código. No 'fit0', você pode escolher os parâmetros iniciais que a função de otimização usará para iniciar a minimização. Comece pelos valores padrão e, se a convergência não for alcançada, altere o segundo valor fit0 (população na fase condensada) em passos de 0,1 de 0,1 para 1.
   NOTA: Às vezes, o conjunto de dados possui vários mínimos locais, e é necessário variar extensivamente os parâmetros iniciais para começar a convergir para o mínimo mais global.
6. Quando o ajuste satisfatório foi alcançado, os valores de ajuste serão escritos dentro da figura (Figura 1D e Figura Suplementar 2B) e podem ser acessados na variável 'ajuste'. Plote ainda esses parâmetros como um gráfico de estatísticas para melhor visualização.

4. Gravação de experimentos CONDENSE-MT

NOTA: O objetivo do experimento é detectar indiretamente os condensados por meio da observação deles no sinal de água do solvente via troca de prótons²⁰. No experimento CONDENSE-MT, um perfil de impressão digital MT é adquirido e analisado (Figura 2A)²⁰.

1. Grave seu espectro 1D favorito com supressão de água. Se muito pouco sinal for observado, é muito provável que o experimento CONDENSE-MT funcione muito bem.
2. A análise quantitativa CONDENSE-MT requer a determinação prévia da taxa R1 da água. Determine a taxa_R1 via recuperação por inversão_T1 . Copie a sequência de pulsos fornecida, o conjunto de parâmetros do Bruker e a lista vd para as respectivas pastas. Carregue o conjunto de parâmetros "T1_inversion_recovery" e ajuste potências e frequências no seu espectrômetro de RMN (de acordo com o "edprosol").
   1. Calibre o pulso de 90° de 1H (p1), ajuste NS para 2, DS para 0, d1 para 20 s, SW para 10 ppm, TD2 para 16k e TD1 para 24 (do comprimento da sua lista de vd ajustada). Ative um gradiente fraco ao longo de Z (GPZ0 = 0,1 %) para evitar efeitos de amortecimento de radiação.
3. Para o experimento CONDENSE-MT,
   1. Copie o conjunto de parâmetros de Bruker, a sequência e a lista de frequências fornecidos para as pastas específicas de Bruker, carregue o conjunto de parâmetros "CONDENSE-MT" e ajuste as frequências e potências de acordo com seu espectrômetro.
   2. Ajuste P1 para o comprimento calibrado de 90° do pulso e P4 para 1 μs para o pulso de excitação, a fim de evitar amortecimento por radiação. Defina NS para 2, DS para 16, d1 para 4 s, SW2 para 20 ppm, TD2 para 8k, TD1 para o comprimento da lista de frequências (tipicamente 46). Ajuste SPNAM10 para Squa100.1000 e sua duração de p10 a 5 s.
   3. Encontre a potência do SP10 para gerar irradiação de 100 Hz (o comando 'pulse 100 Hz' vai calcular sua potência tanto em watts quanto em dB). Ajuste a potência SP10 do pulso de irradiação de acordo e execute esse experimento pseudo-2D usando o comando 'zg'.
      NOTA: O experimento usará a lista de frequências fornecida que abrange os deslocamentos de irradiação desde a ressonância com a água até a ressonância muito distante (100000 Hz) para detectar o sinal da água em diferentes deslocamentos de irradiação (Figura 2B). Um gráfico de integrais de água (garantir a fase adequada dos espectros; Figura 2C) com relação ao deslocamento da irradiação, resulta no perfil CONDENSE-MT mostrado na Figura 2A.
4. Criar 7 novos experimentos e, em cada um consecutivo, aumentar apenas a potência da irradiação para cobrir a faixa de 170 Hz a 1000 Hz (ou seja, 170, 250, 330, 500, 650, 780, 1.000 Hz). Em todo experimento, use o comando do ponto anterior. Para cada potência de saturação, toda a lista de deslocamentos será adquirida (Figura 2D).
   NOTA: O ajuste condense-MT requer os dados de referência adquiridos na amostra apenas de agarose (meio sem condensados biomoleculares). Garantir o mesmo intervalo de tempo entre a preparação da amostra e a aquisição dos dados, e adquirir o mesmo conjunto de dados de 8 experimentos em uma amostra de referência agarose. Isso serve para garantir que tanto a referência de agarose quanto a amostra bifásica fossem incubadas pelo mesmo período.

5. Processamento de conjuntos de dados CONDENSE-MT e visualização dos resultados

1. Processe cada experimento CONDENSE-MT (8 no total, Figura Suplementar 3A) da seguinte maneira.
   1. Defina qsine de SSB 2 como função janela, extraia a^46ª fatia usando qsin; fp, fasear o pico da água em 1D e salvar os parâmetros de fase no conjunto de dados 2D, depois processar 2D com xf2 e extrair essas 46 fatias com split2D (entradas adicionais na janela pop-up: r – 46 – 11).
      NOTA: Isso extrairá 46 espectros 1D adquiridos usando diferentes deslocamentos de irradiação e os salvará como experimentos processados 1D de 11 a 56 dentro do mesmo conjunto de dados (Figura Suplementar 3A, mostrada para o experimento CONDENSE-MT de 1000 Hz).
   2. Repita o mesmo para os 7 experimentos restantes. Verifique várias fatias de cada experimento para garantir que a fase e a linha de base estejam corretas (Figura 2C). Se necessário, corrija manualmente – uma boa fase e referência são pré-requisitos para uma quantificação adequada!
2. Repita os mesmos passos nos dados adquiridos usando amostra de referência de agarose e nos experimentos de recuperação por inversão, extraindo a 24ª fatia para faseamento e usando split2D (r – 24 – 11).
3. Ajuste os dados adquiridos usando o código Matlab fornecido. Siga as instruções específicas do roteiro.
4. Realize primeiro a análise de ajuste para a amostra de referência de agarose para obter os parâmetros de fundo na ausência de condensados. O código read_CONDENSE_MT_data primeiro lê os dados processados de RMN e integra o sinal de ressonância de água nas fatias 1D geradas pelo comando split2D (Figura Suplementar 3B).
5. Defina os limites de integração individualmente; um espectro 1D de referência será plotado no Matlab para avaliar os limites de integração (Figura Suplementar 3C). O código normalizará ainda mais os dados e ajustará as integrais normalizadas da água em função do offset de irradiação e da potência ao modelo^{CONDENSE-MT 20}. O read_CONDENSE_MT_data armazenará as integrais normalizadas na variável integral_water_real_all, que então é usada para ajustes subsequentes.
6. Determine a taxa de relaxamento R₁ da água na presença de agarose ou condensados antes de ajustar os dados CONDENSE-MT.
   NOTA: O ajuste do experimento de recuperação por inversão de água pode ser feito dentro da primeira seção do script CONDENSE-MT_full Matlab (ou do script CONDENSE_MT_referenceMTpool no caso dos dados de referência de agarose). O nome do arquivo e o caminho do experimento, assim como o ID do experimento, podem ser inseridos para executar o script Inversion_Recovery Matlab (Figura Suplementar 4A, seção 1). Se necessário, o número de fatias 1D e os limites de integração podem ser ajustados neste script; este último depende dos parâmetros de processamento usados no TopSpin. Esta seção determinará a taxa R1 da água e a armazenará na variável P.R1w , necessária para a adaptação subsequente dos dados CONDENSE-MT.
7. Para dados de agarose, use as integrais normalizadas diretamente para ajuste, usando o script CONDENSE_MT_referenceMTpool (que chama a função function_1MT .
8. Para quantificação de condensados, use os parâmetros ajustados da agarose como entrada para o ajuste global dos dados adquiridos na amostra condensada (Figura Suplementar 4A). Isso fixará as propriedades físicas da malha de agarose como valores constantes ao ajuste, permitindo a quantificação do efeito adicional mediado por condensado de um condensado embutido na malha de agarose (Figura 2E).
9. Faça a quantificação do condensado usando o script CONDENSE-MT_full , que chama a função function_2MT Matlab. Os parâmetros iniciais para otimização computacional são fornecidos via fit0 (Figura Suplementar 4B). A incerteza do parâmetro do ajuste será calculada com a matriz jacobiana, da qual a matriz variância-covariância será derivada (Figura Suplementar 4B).
10. Avalie a qualidade do ajuste pelo desvio de ajuste, semelhante ao desvio residual da previsão do modelo em relação aos dados experimentais. Para controle de qualidade adicional, plote o ajuste junto com dados experimentais (Figura Suplementar 4C).

Resultados

O protocolo LLPS REDIFINE descrito aqui foi aplicado ao domínio FUS N-terminal (NTD). A DTN do FUS se separa facilmente sob condições ambientes em concentrações^{micromolares 19,21}. Esta amostra específica foi preparada a uma concentração de 200 μM em tampão HEPES de 30 mM contendo 200 mM de KCl no pH 7,5, com 0,5% de agarose regular. Após a separação de fase, os sinais FUS NTD permanecem observáveis na fase condensada (Figura 1A,B). Isso o torna um candidato perfeito para LLPS REDIFINE estudar. Ou seja, a maioria das proteínas propensas a LLPS contém regiões longas e intrinsecamente desordenadas que geralmente permanecem observáveis na fase condensada; no entanto, em proteínas mais estruturadas, isso não é o caso.

O ajuste REDIFINE (Figura 1D e Figura 3A,B) revelou múltiplos parâmetros únicos para essa amostra FUS NTD. Especificamente, determinou os coeficientes de difusão nas fases diluída e condensada (D_dil e_{D cond}), a população de proteína na fase condensada (ν_cond), o tamanho médio da gota R e a permeabilidade da interfase p. Tamanho e permeabilidade da gota definem a taxa de troca de interfase da fase condensada para a diluída k_cd=3p/R, permitindo obter informações sobre a dinâmica de troca¹⁹.

Esses resultados podem ser visualizados de diferentes maneiras (Figura 3B). Usando um gráfico de aranha, pode-se comparar resultados entre diferentes condições ou amostras. Por outro lado, pode-se representar pictoricamente os parâmetros REDIFINE no modelo para visualizá-los da forma mais eficaz. Note que o REDIFINE fornece todos esses resultados sem rótulo em apenas algumas horas, usando apenas uma amostra.

Como o sinal de RMN do FUS NTD permanece detectável na fase condensada (Figura 3C), o CONDENSE-MT provavelmente não será aplicável devido à falta de contraste de relaxamento. Gravamos o conjunto de dados CONDENSE-MT no FUS NTD e, de fato, nenhuma diferença no perfil MT foi observada entre a referência agarose e a amostra bifásica FUS NTD (Figura 3C). Isso torna a metodologia CONDENSE-MT inaplicável a esta amostra específica de FUS NTD.

No entanto, o CONDENSE-MT fornece caracterização dinâmica dos condensados de RNA de expansão repetida (Figura 3C,D)²⁰. Note que o CONDENSE-MT poderia fornecer múltiplos parâmetros que caracterizam de forma única o RNA na fase condensada (Figura 3D), apesar de seu sinal ser inobservável na RMN convencional (Figura 3C). Os parâmetros obtidos são a cinética de troca de prótons entre condensado e água em massa (_{condensado k, H2O} e k_{H2O, condensado}), a taxa de relaxamento T₂ para o condensado (T_{2, condensado}), refletindo o grau de parada dinâmica das biomoléculas após a condensação, e a taxa aparente de R₂ da água em massa (R_{2, água}). Esse último parâmetro é uma combinação linear da taxa de rotação da água diluída e da água condensada com rotação lenta. Valores mais altos de_{R 2} indicam uma população maior de água no condensado, o que eleva a taxa geral aparente de R₂ da água⁽Figura 2E e Figura 3D).

DISPONIBILIDADE DE DADOS E CÓDIGOS

Os dados brutos e códigos de processamento LLPS REDIFINE estão disponíveis no repositório Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . Os dados brutos e códigos de processamento do CONDENSE-MT foram depositados no repositório Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697. O MATLAB é necessário para o processamento. Eles também são fornecidos neste artigo (Arquivos de Codificação Suplementar).

Figura 1: Fluxo de trabalho REDIFINE. (A) Medições de difusão produzem curvas complexas de decaimento bifásico de difusão em amostras condensadas. O decaimento resultante contém parâmetros desconvolucionados que descrevem os coeficientes de difusão das espécies nas fases condensada e diluída, suas populações, tamanho das gotículas e taxa de troca de interfase. (B) Para decodificar esses parâmetros isolados, é necessário registrar um conjunto de dados pseudo-3D variando não apenas a intensidade do gradiente, mas também os atrasos de difusão. É absolutamente essencial para a quantificação que cada fatia dessas medições seja devidamente faseada e corrigida pela linha de base. (C) Após verificar a qualidade dos dados medidos e processados, esses cortes 1D são inseridos no código MATLAB para análise e plotagem final. (D) Os dados são então ajustados por um solucionador de programação não linear. O ajuste e os parâmetros resultantes são ilustrados para a amostra bifásica de FUS NTD. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Fluxo de trabalho CONDENSE-MT (A) Um perfil único de CONDENSE-MT observado na ressonância da água, ilustrando a ampliação devido à presença de biomoléculas condensadas e água. (B) A água é observada para cada deslocamento de irradiação. (C) Para quantificação, é essencial que todos os espectros sejam faseados corretamente. (D) Após adquirir a ressonância da água em diferentes deslocamentos de irradiação, o experimento é repetido em diferentes potências de irradiação. Isso gerará um conjunto de dados do sinal relativo da água em função tanto do deslocamento quanto da potência de irradiação (E). Os dados são então ajustados por um solucionador de programação não linear. O ajuste e os parâmetros resultantes são ilustrados para a amostra bifásica de RNA 31xCAG. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Apresentação dos resultados de MT de REDIFINE e CONDENSE. (A) Representação em gráfico de aranha dos parâmetros REDIFINE para análise comparativa entre amostras ou condições. (B) Modelo esquemático ilustrando parâmetros derivados de REDIFINE, incluindo coeficientes de difusão, raio de gotas, particionamento e taxa de câmbio de interfase. (C) Comparação dos perfis CONDENSE-MT adquiridos para referência de agarose e FUS NTD bifásico em agarose a 500 Hz de irradiação.
(D) Análise CONDENSE-MT de condensados de RNA de expansão repetida 31xCAG mostrando extração de parâmetros e visualização dos efeitos de transferência de magnetização associados ao condensado. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Configuração REDIFINE. (A) O domínio N do FUS permanece observável após a preparação da amostra condensada bifásica. Observa-se um forte sinal de prótons amida/amino e aromático. (B) O decaimento do sinal observado no experimento de difusão DOSY ilustra o decaimento mais rápido da população de proteínas em fase diluída e o decaimento mais lento da proteína na fase condensada. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Processamento REDIFINE. (A) Código Matlab usado para ajuste REDIFINE, com parâmetros destacados onde a entrada específica é necessária. O inserto ilustra como se escolhe a área de integração. (B) Minimização da função de ajuste e dos resultados resultantes. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Configuração CONDENSE-MT. (A) Visão geral dos experimentos de RMN necessários para a análise CONDENSE-MT, incluindo o experimento de recuperação de inversão de água (exno. 5) e os experimentos CONDENSE-MT com diferentes potências de irradiação (expno 11-18). (B), (C) Visão geral do script Matlab para leitura e integração dos espectros 1D da água para conjuntos de dados CONDENSE-MT. Os experimentos CONDENSE-MT são apresentados como main8. Os limites de integração são registrados como water_left e water_right. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Processamento CONDENSE-MT. (A) Primeira seção do script de ajuste CONDENSE-MT, que inclui a conexão de recuperação por inversão de água (seção 1) e a entrada dos parâmetros de fundo de agarose previamente determinados. (B) Ajuste e determinação da incerteza dos parâmetros dos conjuntos de dados CONDENSE-MT. Os parâmetros iniciais para o ajuste podem ser definidos dentro do fit0. (C) Plotar a seção do resultado do ajuste CONDENSE-MT. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivos de codificação suplementar: Scripts MATLAB para análise REDIFINE e CONDENSE-MT. Códigos Bruker Topspin para configurar o experimento CONDENSE-MT e scripts MATLAB usados para processar e ajustar conjuntos de dados de difusão REDIFINE e conjuntos de dados de magnetização-transferência CONDENSE-MT, incluindo integração de dados, análise de relaxamento e rotinas globais de ajuste de modelos. O MATLAB é necessário para executar os scripts. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Aqui, apresentamos protocolos detalhados para caracterização por RMN sem rótulo de condensados biomoleculares bifásicos. Essas envolvem as duas metodologias emergentes, LLPS REDIFINE e um experimento complementar, porém ortogonal, chamado CONDENSE-MT. Embora seja geralmente aplicável, o LLPS REDIFINE depende da detecção biomolecular e requer um sinal observável na separação de fases para análise adequada. Embora isso possa limitar a aplicabilidade da REDIFINE, a maioria dos condensados contém proteínas com regiões intrinsecamente desordenadas que geralmente são observáveis por RMN. Em particular, para condensados apenas de proteína:RNA e RNA, o sinal das biomoléculas na fase condensada se expande além dos limites de detecção após a separação de fases. Se o coeficiente de partição na fase condensada for alto, quase nenhum sinal é observado pela RMN convencional. O CONDENSE-TM contorna essa limitação de detecção ao ser uma técnica observada pela água que depende de uma diferença significativa de relaxamento entre espécies moleculares em fases diluída e condensada.

A preparação adequada da amostra é fundamental para a aplicação bem-sucedida tanto do REDIFINE quanto do CONDENSE-MT. Portanto, é importante garantir que a agarose esteja totalmente derretida antes de transferi-la para a mistura, evitar a formação extensa de bolhas de ar durante a transferência e fornecer material suficiente para preencher de forma confiável um tubo de RMN com misturas bifásicas que tendem a aderir inicialmente à parede de vidro. Para o CONDENSE-MT, é crucial transferir reproduvelmente um dado volume de agarose, pois o fundo de agarose será quantificado separadamente. Se a partição das biomoléculas entre fases condensada e diluída for altamente distorcida, ou se a troca entre fases for muito lenta ou rápida, os efeitos REDIFINE ou CONDENSE-MT podem estar ausentes ou serem muito fracos para quantificação confiável. Isso pode se assemelhar a uma limitação importante dessas técnicas. Nesse caso, porém, aumentar ou diminuir a temperatura pode ser útil, pois a temperatura é um modulador poderoso da partição molecular e das taxas de troca química. Uma vez adquiridos os conjuntos de dados, os resultados ótimos de ajuste são frequentemente obtidos iterativamente, repetindo a otimização computacional usando os parâmetros de melhor ajuste do ajuste inicial ou anterior como valores de entrada.

Para sistemas que produzem fortes efeitos REDIFINE e CONDENSE-MT, esses experimentos podem fornecer insights sem rótulo sobre particionamento molecular, taxas de câmbio e dinâmica molecular que são difíceis de alcançar com outros métodos sem marcadores. Além disso, métodos baseados em RMN geralmente não são invasivos, permitindo que amostras sejam analisadas várias vezes ou armazenadas por períodos prolongados, possibilitando o monitoramento das propriedades do condensado ao longo do tempo. Isso é de particular interesse no contexto da maturação patológica do condensado da fibrilização, que é desafiadora de estudar com métodos complementares ao longo de períodos muito longos.

Considerando que organelos celulares sem membrana geralmente são conjuntos multicomponentes com arquitetura complexa, aplicações futuras dessa técnica incluirão a detecção e caracterização de sistemas modelos de condensados multicomponentes cada vez mais sofisticados, bem como análises de condensados em contexto celular via RMN em célula. Isso, no entanto, requer a adaptação do REDIFINE ou CONDENSE-MT a sistemas tão complexos, e esforços para alcançar isso estão em andamento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Espectrômetro de RMN Avance NEO de 700 MHz	Bruker Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Os dados são adquiridos em espectrômetro de RMN de 700 MHz.
Topspin	Bruekr Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Os dados são processados usando este software.
Proteína FUS NTD		N/A	Essa proteína é expressa e purificada em nosso laboratório
RNA 31xCAG		N/A	O RNA é produzido e purificado em nosso laboratório
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	Os dados são processados e visualizados usando esse software.