Engenharia de Modelo Pré-Clínico de Mouse de Alta Fidelidade para Metástase Cerebral utilizando a Técnica de Injeção Pulsátil Interlock e Reparo Vascular Microcirúrgico

Resumo

Este estudo estabelece modelos de alta fidelidade para metástase cerebral por meio de injeção intracarótida transitória de células tumorais usando injeção pulsátil Interlock e reparo microcirúrgico. Preserva o fluxo sanguíneo cerebral, previne a oclusão da artéria carótida comum e oferece modelos pré-clínicos superiores, com taxas melhoradas de metástase tumoral e redução da mortalidade.

Resumo

A metástase cerebral continua sendo um problema clínico devastador. Um grande desafio na pesquisa sobre metástase cerebral é a falta de modelos de alta qualidade que recapitulem com precisão o processo metastático, permitindo assim insights mecanicistas sobre como as células cancerígenas colonizam o cérebro. Modelos tradicionais de injeção intracarótida de metástase cerebral frequentemente exigem a ligadura permanente da artéria carótida comum (CCA), o que altera a hemodinâmica cerebral e compromete a integridade da barreira hematoencefálica (BBB). O protocolo apresenta um método refinado para estabelecer um modelo de camundongo de alta fidelidade para metástase cerebral. A inovação central envolve a técnica de Injeção Pulsátil Interlock (IPI) para entrega de células tumorais, seguida por reconstrução arterial microcirúrgica no local da punção para restaurar o fluxo sanguíneo fisiológico na CCA. Comparado ao modelo convencional de ligadura CCA, a abordagem de reparo microcirúrgico IPI–reduziu significativamente a mortalidade perioperatória (2,86% vs. 25,71%) e aumentou a taxa de estabelecimento de metástase cerebral (94,12% vs. 65,38%). A técnica IPI utiliza uma configuração de seringa em tandem para minimizar a regurgitação celular durante a injeção intracarótida. Após a infusão de células tumorais, a ACC é reparada meticulosamente usando suturas microcirúrgicas sob um estereoscópio, evitando assim a oclusão permanente. Isso preserva a hemodinâmica cerebral nativa e a integridade da BBB no momento da entrada das células tumorais, além de melhorar significativamente as taxas de sucesso cirúrgico e reduzir a mortalidade. As lesões intracranianas metastáticas são validadas por bioluminescência serial e histopatologia. O método oferece uma plataforma superior para o estudo da fisiopatologia da metástase cerebral e para avaliação terapêutica pré-clínica, recapitulando assim o processo metastático.

Introdução

As metástases cerebrais representam o tipo mais comum de tumor cerebral maligno em adultos, ocorrendo aproximadamente dez vezes mais frequentemente do que tumores cerebrais^primários. Estima-se que 10%–20% dos pacientes com câncer sistêmico desenvolvam metástases cerebrais durante os estágios avançados da doença, que é uma das principais causas de^{mortalidade 1,2}. Apesar dos avanços significativos no tratamento de cânceres primários, o prognóstico para pacientes com metástases cerebrais permanece ruim. A taxa de sobrevivência em um ano de pacientes com metástase cerebral é inferior a 20%³. O mecanismo do porquê e de como alguns cânceres metastatizam para o cérebro permanece desconhecido. O desafio terapêutico é agravado pela biologia única das metástases cerebrais, incluindo a presença da BBB, o microambiente imunológico cerebral distinto e as complexas interações das células tumorais com células^{neurogliais 4,5}.

Tanto a pesquisa farmacodinâmica quanto a de patogênese sobre metástase cerebral dependem fortemente de modelos animais pré-clínicos precisos que recapitulam com precisão o processo da doença humana. Modelos animais atuais de metástase cerebral, embora amplamente utilizados, baseiam-se principalmente em implantação ortotópica intracraniana, injeção intravenosa ou na veia caudal, injeção intracardíaca ou injeção intracarótida^{na artéria} 6,7,8,9,10. No entanto, esses modelos refletem de forma imperfeita a progressão da doença humana, frequentemente falhando em capturar etapas-chave como a extravasação de células tumorais em uma BBB intacta sob condições de fluxo^{fisiológico 11}. Injeções intravenosas e intracardíacas resultam em baixa eficiência específica de formação tumoral cerebral e frequentemente levam a metástases extracranianas generalizadas, causando morte prematura de animais antes do desenvolvimento de metástases cerebrais^{substanciais 12}. O método tradicional de injeção na artéria intracarótida aumenta as taxas de formação de tumores intracranianos, mas requer a ligadura permanente do CCA. Ao alterar a hemodinâmica cerebral, essa ligadura pode induzir isquemia em regiões ipsilaterais do cérebro e prejudicar os padrões fisiológicos de fluxo sanguíneo necessários para a entrega das células tumorais, afetando assim sua distribuição espacial e nicho de colonização dentro do^{cérebro 13,14}.

Modelos animais de alta qualidade que possam imitar mais fielmente a fisiopatologia da metástase cerebral são^{cruciais 15}. Um modelo ideal de metástase cerebral deve recapitular toda a cascata metastática, incluindo o retorno das células tumorais para a vasculatura cerebral, extravasação através da barreira hematoencefálica (BBB) e interações dinâmicas com o microambiente^{cerebral 16}. Alta fidelidade de modelos é fundamental tanto para estudos mecanicistas quanto para avaliação^{terapêutica 6}. No entanto, os modelos existentes de injeção intracarótida não reproduzem totalmente condições fisiológicas chave, especialmente a preservação do fluxo sanguíneo cerebral normal e a distribuição natural das células tumorais circulantes.

Para superar as limitações dos modelos pré-clínicos existentes de metástase cerebral, foi desenvolvido um modelo animal de alta fidelidade que recapitula com mais precisão a cascata metastática, baseado na técnica IPI e na reparação arterial microcirúrgica. Esse método envolve oclusão arterial transitória após a injeção de células tumorais, seguida de reparo meticuloso do local da punção arterial para restaurar o fluxo sanguíneo fisiológico para a CCA ipsilateral. Essa abordagem não só aumenta a consistência e as taxas de sucesso do modelo, mas também, crucialmente, preserva a BBB ao manter a hemodinâmica cerebral nativa. Ao minimizar a perturbação do fluxo sanguíneo cerebral, o modelo modificado de injeção intracarótida oferece uma plataforma de alta fidelidade que recapitula com mais precisão o processo natural de colonização metastática cerebral, oferecendo assim uma ferramenta aprimorada para investigar mecanismos de metástase cerebral e avaliar potenciais terapias.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso dos Animais (IACUC) do Instituto de Biofísica da Academia Chinesa de Ciências (número de aprovação: SYXK2021124). Animais que atingiram os limites predefinidos foram eutanasiados de acordo com as Diretrizes para a Eutanásia de Animais do Comitê Institucional de Cuidado e Uso dos Animais (IACUC) do Instituto de Biofísica da Academia Chinesa de Ciências e as Diretrizes da AVMA para a Eutanásia de Animais (2020)¹⁷.

1. Preparação da suspensão de célula única

1. Cultivar células B16F10 e 4T1 em meio RPMI-1640 completo suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Mantenha as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂.
3. Confirme a expressão da luciferase e verifique a ausência de contaminação por micoplasma um dia antes dos procedimentos cirúrgicos.
4. No dia da cirurgia, colhe as células quando atingirem 80% de confluência, primeiro lavando com soro sorológico tamponado com fosfato (PBS) antes da tripsinização (0,25%) por menos de 3 minutos a 37 °C.
5. Adicione 10% de meio RPMI-1640 contendo FBS nas células para extinguir a tripsina de 0,25%.
6. Centrifuge as células a 300 × g por 3 minutos. Lave as células duas vezes em PBS para remover o soro residual, depois conte-as com um hemocitômetro.
7. Use o ensaio de exclusão do azul de Trypan para confirmar que a viabilidade celular permanece entre 90% e 95% durante a injeção.
8. Resuspenda células em PBS a 2 × 10⁶ células/mL. Mantenha as células no gelo até a injeção.
   NOTA: Células B16F10 e 4T1 marcadas com luciferase podem ser usadas. B16F10 é apresentado como o exemplo representativo.

2. Preparação de camundongos e preparação perioperatória

1. Use camundongos machos C57BL/6 de 7–8 semanas.
2. Coloque uma bolsa térmica sob a placa cirúrgica para evitar hipotermia. Ligue a bolsa térmica 30 minutos antes da cirurgia.
3. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos, a placa cirúrgica e a gaiola de alojamento com um autoclave. Desinfete o estereoscópio e a mesa cirúrgica com 75% de etanol.
4. Outros itens que não podem ser esterilizados por autoclavagem devem ser desinfetados com irradiação UV e etanol a 75% (Figura 1A).
5. Pese o camundongo antes da anestesiação e registre o peso pré-operatório como referência.
6. Adicione 10 g de tribromoetanol a um tubo de centrífuga, depois adicione 10 mL de álcool amílico terciário. Sacode o tubo até que o tribromoetanol esteja completamente dissolvido.
   NOTA: O tribromoetanol pode causar efeitos adversos, incluindo mortalidade; Monitore cuidadosamente a profundidade da anestesia.
7. Filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm para preparar uma solução 100% de estoque.
8. Dilua a solução 100% original com 0,9% de NaCl de soro fisiológico ou diluente até uma solução de trabalho de 2,5% (diluição 1:40). A eficácia de cada solução de trabalho recém-preparada deve ser testada quanto à anestesia em camundongos.
9. Anestesiar camundongos por injeção intraperitoneal (i.p.) de 2,5% de tribromoetanol a 0,2 mL/10 g de peso corporal. Quando necessário, prolongue a anestesia administrando uma dose de reforço a um terço do volume original da anestesia (Figura 1B).
   NOTA: Ajuste a dosagem do anestésico com base no peso corporal e monitore continuamente a respiração.
10. Certifique-se de que o camundongo esteja totalmente anestesiado aplicando um estímulo leve (por exemplo, beliscão no dedo do pé) e observando que não há resposta motora.
11. Raspe o pelo na região do pescoço e faça uma marca de corte dos dedos após a anestesia.
12. Aplique pomada para os olhos para proteger os olhos do ressecamento.
13. Coloque o camundongo sobre uma placa cirúrgica e prenda os 4 membros e incisivos superiores com fita adesiva (Figura 1C).
14. Monitore a profundidade da anestesia avaliando a frequência respiratória e o reflexo de beliscão para garantir que os camundongos permaneçam sem dor e imóveis durante o procedimento.
15. Os animais são aleatoriamente atribuídos a grupos experimentais, e a análise de imagem foi realizada por pesquisadores cegos para a alocação de grupos.

3. Procedimentos cirúrgicos padrão da técnica IPI e reparo microcirúrgico

1. Desinfete a região do pescoço com solução de povidona-iodo e deixe a pele secar completamente antes de prosseguir (Figura 1D).
2. Drapear o camundongo assépticamente usando um drapeado cirúrgico estéril, expondo apenas a região do pescoço (Figura 1E).
3. Faça uma incisão cervical na linha média de aproximadamente 0,8–1 cm de comprimento usando tesoura cirúrgica estéril, com pinças finas para retração do tecido (Figura 2A).
4. Realize dissecação romba da fáscia superficial e dos músculos subjacentes usando pinças angulares finas para expor a bainha carótida direita (Figura 2B1, Figura 2C1).
5. Isole a artéria carótida externa direita (ECA) da bainha carotídea e ligue a ECA direita para evitar o vazamento celular para os ramos extracranianos (Figura 2B2, Figura 2C2).
6. Isole cuidadosamente a CCA direita dentro da bainha carótida, preservando o nervo vago localizado lateralmente e abaixo do vaso (Figura 2C1).
7. Coloque um pequeno pedaço de uma luva de borracha e um algodão umedecido com soro por baixo do CCA direito isolado como travesseiro para elevar e estabilizar o vaso.
   NOTA: Elevar o CCA estabiliza o vaso e facilita a perfuração e injeção precisas. (Figura 2B4, Figura 2C4).
8. Coloque dois nós não apertados com laços abertos no CCA distal e proximal ao algodão, e então faça o nó proximal (Figura 2B3, Figura 2C3).
9. Aplique um clipe microvascular no CCA próximo ao nó distal não apertado para bloquear temporariamente o fluxo sanguíneo do CCA (Figura 2B4, Figura 2C4).
10. Implantação de células cancerígenas
    1. Perfuração de intertravamento
       1. Perfure o segmento elevado do CCA direito usando uma agulha de 32G com o chanfro voltado para cima.
       2. Retire a seringa inicial mantendo o local da perfuração.
       3. Misture a suspensão de células cancerígenas com vórtice e puxe 100 μL para dentro da seringa de microlitros, garantindo que nenhuma bolha de ar seja aspirada.
       4. Insira a ponta da agulha da seringa de microlitros no local da perfuração criado no Passo 3.10.1.1 e segure-a de forma estável sem iniciar a injeção para garantir uma posição estável antes da entrega celular (Figura 2B, Figura 2C5, Figura Suplementar 1).
          NOTA: Use uma seringa de 32G para perfuração e uma seringa de microlitros para injeção para garantir posicionamento estável e entrega controlada. A Figura Suplementar 1 mostra os parâmetros das duas seringas. O diâmetro externo da seringa 32G é de 0,22 mm, enquanto a agulha da seringa de microlitros é de 0,26 mm, facilitando a inserção segura e a injeção controlada.
    2. Injeção pulsátil (Figura 2C5)
       1. Remova o clipe microvascular aplicado no Passo 3.9.
       2. Inicie a injeção da suspensão de células tumorais na ICA através da seringa de microlitros.
       3. Administre a suspensão usando um movimento de injeção pulsátil, avançando suavemente o êmbolo da seringa em pequenos pulsos em vez de pressão contínua.
       4. Administrar a suspensão usando qualquer um dos seguintes critérios: critério do ciclo cardíaco, injetando ~1 μL de suspensão celular a cada 8 ciclos cardíacos guiados pelo fluxo sanguíneo retrógrado pulsátil na artéria carótida interna distal; ou o critério da taxa de injeção, injetando ~1 μL/s garantindo que a taxa não ultrapasse 60 μL/min.
       5. Monitore o vaso durante a injeção. A entrega bem-sucedida é indicada quando o vaso vermelho se torna temporariamente transparente à medida que a suspensão passa pelo lúmen, sem extravasamento visível ao redor do local da perfuração.
       6. Após concluir a injeção, retire cuidadosamente a seringa de microlitro.
       7. Aperte imediatamente o nó distal de forma controlada para selar o vaso e minimizar a regurgitação (Figura 2B6, Figura 2C6).
          NOTA: A injeção pulsátil reduz a superperfusão e minimiza o risco de elevação da pressão intracraniana.
11. Reparo microcirúrgico (Figura 2B6, Figura 2C6)
    1. Use um ponto microcirúrgico de nylon 10-0 para fechar o local da perfuração de forma estanque, posicionando os pontos de entrada e saída da agulha imediatamente adjacentes à margem do defeito para minimizar o vazamento vascular e preservar a permeabilidade luminal.
    2. Passe a agulha de sutura microcirúrgica pelo orifício de perfuração na parede do vaso sob alta ampliação e deixe o ponto solto temporariamente.
    3. Lave o campo cirúrgico com soro fisiológico heparinizado.
    4. Fixe o ponto com dois a três nós quadrados.
    5. Corte as extremidades livres do ponto para aproximadamente 1–2 mm para evitar afrouxamento e minimizar a carga de corpos estranhos.
       NOTA: Procedimentos cirúrgicos padrão da técnica IPI e reparo microcirúrgico são descritos no Vídeo Suplementar 1.

4. Restauração do fluxo sanguíneo do CCA

1. Afrouxe gradualmente o nó proximal.
2. Lave o lúmen para remover qualquer possível coágulo microscópico. Coloque um algodão seco no campo cirúrgico para monitorar sangramentos excessivos.
3. Uma vez que não há derrame ativo no local da punção, afrouxe cautelosamente o nó distal para restaurar o fluxo sanguíneo carotídeo (Figura 2B7, Figura 2C7).

5. Confirmar reparo bem-sucedido

1. Restauração da pulsação
   1. Observe a CCA para pulsações robustas, indicando reperfusão bem-sucedida.
2. Verifique a patente e a integridade da embarcação
   1. Inspecione o local de reparo para garantir que está livre de estenose e que o lúmen permaneça permeável e contínuo com o segmento proximal do vaso.

6. Irrigação por feridas e fechamento

1. Irrigue cuidadosamente o campo cirúrgico com soro fisiológico normal não heparinizado para remover detritos e coágulos sanguíneos.
2. Feche a incisão cutânea usando uma sutura contínua.
   NOTA: Mantenha o campo cirúrgico úmido e realize todas as manipulações com cuidado para minimizar lesões tecidulares.

7. Cuidados pós-operatórios

1. Suporte de líquidos: Administrar 0,5–1 mL de soro salino estéril morno por via subcutânea imediatamente após a cirurgia para compensar a perda de líquido perioperatória.
2. Profilaxia da infecção: Se a duração da cirurgia exceder 40 minutos, administre enrofloxacina (5 mg/kg, uma vez ao dia) por 3 dias consecutivos. Antibióticos não são necessários se o procedimento durar menos de 40 minutos.
3. Nutrição e hidratação: Forneça hidrogel ou alimentos amolecidos por pelo menos 1 semana após a cirurgia para garantir hidratação e nutrição adequadas.
4. Monitoramento diário: Realize avaliações diárias de saúde, observando comportamentos circulares, déficits neurológicos, infecção de feridas e perda de peso.
5. Curso pós-operatório esperado: Durante as primeiras 48 horas, os camundongos podem apresentar atividade reduzida, piloereção leve e perda de peso de até 15% do valor inicial pré-operatório, seguido de recuperação gradual.
6. Analgesia: Administre meloxicam (5 mg/kg, por via subcutânea) uma vez ao dia por 2–3 dias para aliviar a dor e promover a recuperação.

8. Critérios de avaliação para o estabelecimento bem-sucedido de modelos animais

1. Monitoramento do peso corporal
   1. Pese os camundongos diariamente e registre o peso corporal.
2. Avaliação clínica
   1. Avalie os sinais clínicos diariamente, incluindo postura e comportamento circular.
3. Imagem por bioluminescência
   1. Ligue os interruptores de energia do instrumento de imagem e do computador.
   2. Inicie o software de análise de imagem por bioluminescência (Versão 4.7.2) e clique em "Inicializar" para inicializar o sistema de imagem por bioluminescência.
   3. Durante a inicialização, a luz de status de temperatura no painel de controle do sistema de imagem aparecerá vermelha. Realize a imagem somente depois que a luz de status de temperatura ficar verde.
   4. Retenha comida e água dos camundongos por 6 horas antes da imagem para evitar aspiração durante a anestesia.
   5. Prepare o substrato de imagem em uma concentração de 10 mg/mL, protegido da luz durante todo o procedimento. Calcule o volume de injeção em 10 μL/g de peso corporal.
   6. Imobilize o rato para a imagem. Limpe o local da injeção na parte inferior esquerda do abdômen com 75% de álcool medicinal.
   7. Use um cotonete para estimular suavemente a parede abdominal no local da injeção, minimizando o risco da agulha entrar no intestino.
   8. Após perfurar a parede abdominal, aspire suavemente para confirmar a ausência de sangue e, em seguida, injete lentamente o substrato de imagem in vivo .
   9. Aos 4 minutos e 30 segundos após a injeção do substrato, transfira o camundongo para uma câmara de indução de anestesia.
   10. Induza anestesia usando isoflurano a 3%. Quando os reflexos de endireitamento e de pinça forem perdidos, reduza a concentração de isoflurano para 2% para manutenção.
   11. Coloque o camundongo anestesiado na câmara de imagem, garantindo que o cone nasal cubra totalmente a boca e o nariz. Feche a porta da câmara de imagem com segurança.
   12. No painel de controle do sistema de imagem, selecione "Luminescente" como modo de imagem. Ajuste manualmente o tempo de exposição para 60 s. Selecione "Fotografia", "Sobreposição" e "Grade de Alinhamento".
   13. Defina o campo de visão para D para registrar três camundongos. Ajuste a altura da imagem para 1,5 cm. Selecione "bloco" para o filtro de excitação e "aberto" para o filtro de emissão.
   14. Aos 10 minutos após a injeção do substrato, clique em "Adquirir" para capturar a imagem.
   15. Após a aquisição da imagem, navegue até a Paleta de Ferramentas e selecione "Ferramentas de ROI". Use a ferramenta "Círculo" para delimitar a região de interesse (ROI), depois clique em "Medir ROIs" para obter dados quantitativos.
4. Análise histológica
   1. Colhe tecidos cerebrais no ponto final experimental e submeta-os à análise histológica.
   2. Identificar e confirmar lesões metastáticas por coloração por hematoxilina e eosina (H&E).

9. Objetivos humanos

1. Para garantir o bem-estar animal e o cumprimento dos padrões éticos, critérios humanos pré-definidos foram estabelecidos como critérios para a eutanásia imediata.
2. Os camundongos são eutanasiados por inalação de dióxido de carbono (CO₂), seguida por luxação cervical como método físico secundário para confirmar a morte.
3. A eutanásia imediata deve ser realizada caso ocorra qualquer uma das seguintes condições.
   1. Déficits neurológicos
      1. Disfunção motora: ataxia (andamento instável, balanço), círculos, paralisia, hemiparesia ou tremores.
      2. Alterações comportamentais ou de consciência: letargia, estupor ou coma.
      3. Sinais de aumento da pressão intracraniana: postura anormal (por exemplo, costas curvadas indicando desconforto) ou inclinação da cabeça.
      4. Convulsões: convulsões generalizadas ou focais.
   2. Mudanças no peso corporal e na função fisiológica
      1. Perda de peso corporal superior a 20% ou incapacidade de comer ou beber de forma independente devido à carga tumoral ou fraqueza severa.
      2. Disneia (ofegante ou ofegante) ou incontinência urinária/fecal.
   3. Status tumoral
      1. Encerre o experimento imediatamente se for detectada ulceração, infecção ou necrose associada ao tumor.
   4. Carga tumoral máxima tolerada
      1. Os camundongos passam por imagens de bioluminescência duas vezes por semana.
      2. Uma vez que o sinal do tumor intracraniano entra em uma fase de crescimento exponencial (por exemplo, dobrando entre duas sessões consecutivas de imagem), o monitoramento neurológico é aumentado para duas vezes ao dia.
      3. A eutanásia foi realizada imediatamente após o início da ataxia ou convulsões, independentemente do valor do sinal de bioluminescência.

Resultados

Imagem bioluminescente e análise quantitativa
Seguindo o protocolo cirúrgico padronizado, o modelo camundongo otimizado da metástase cerebral demonstrou sinais bioluminescentes intracranianos estáveis em imagens in vivo seriadas após a operação. Imagens bioluminescentes in vivo contínuas (Figura 3A) e análise quantitativa (Figura 3B) durante 4 semanas após a inoculação intracarótida mostrara...

Discussão

Modelos pré-clínicos robustos que recapitulam com precisão a metástase cerebral são essenciais para elucidar mecanismos fisiopatológicos e avaliar a eficácia terapêutica. O modelo tradicional de injeção intracarótida requer a ligadura da artéria carótida comum (ACC), que altera o fluxo sanguíneo cerebral de maneira não fisiológica, potencialmente induzindo lesão isquêmica ipsilateral e rompendo a barreira hematoencefálica (BBB⁾9,...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10-0 microsurgical suture with needle	Lingqiao	2650798	Microsurgical suture for repair of the common carotid artery puncture site
100 µL microliter syringe	Bolige Tools	100UL	Microliter syringe for tumor cell delivery during interlock pulsatile injection
100 µL pipette	Eppendorf	3123-000250	Pipette for saline irrigation of the surgical field
32G 1 mL insulin syringe	Kindly	YY0497	Insulin syringe used to create the initial arterial puncture site
4-0 silk suture	Ethicon	W501	Suture material for closure of the skin incision
4T1 breast cancer cell line	Obtained from Laboratory Shengdian Wang, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences	CRL-2539	Tumor cell line used for intracarotid brain metastasis modeling
75% Ethanol	Annjet	Q/371402AAJ008	Disinfectant for cleaning the injection site
7–8-week-old male C57BL/6J mice	Charles River Laboratories	1.10011E+17	Experimental animals used for the B16F10 brain metastasis model
8-week-old female BALB/c mice	Charles River Laboratories	1.10011E+17	Experimental animals used for the 4T1 brain metastasis model
Angled-tip forceps	Kewo Tools	—	Microsurgical forceps for tissue dissection and vessel manipulation
B16F10 melanoma cell line	Obtained from Laboratory Shengdian Wang, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences	CRL-6475	Melanoma cell line used for intracarotid brain metastasis modeling
Bioluminescence imaging analysis software	Living Image (version 4.7.2)	—	Software for analysis of bioluminescence imaging data
DMEM	Xigong Bio Tech	M1805	Cell culture medium for tumor cell maintenance
Enrofloxacin (antibiotic)	MCE	HY-B0502	Antibiotic used for postoperative infection prophylaxis
Eosin Y solution	Beyotime	E301879	Histological staining reagent for eosin staining
Eye ointment	Baiyunshan	H44023089	Ophthalmic ointment for protection of the eyes during anesthesia
Fetal bovine serum (FBS)	Pan Sera Tech	ST30-3302	Serum supplement for cell culture medium
GraphPad Prism	Version 4.7.2	—	Statistical analysis software for survival curves and quantitative data analysis
Hematoxylin solution	Beyotime	C0105S	Histological staining reagent for hematoxylin staining
Isoflurane	H.F.Q. Biotechnology	101357015	Inhalation anesthetic used during imaging procedures
IVIS Spectrum in vivo imaging system	Lumina Series III	—	Imaging system for in vivo bioluminescence imaging
Meloxicam (analgesic)	Qilu Animal Health	150252467	Non-steroidal anti-inflammatory drug used for postoperative analgesia
Microsurgical scissors	Kewo Tools	—	Microsurgical scissors for tissue dissection
Mini vessel clip	Zheyong Tools	200521	Microvascular clip for temporary occlusion of the common carotid artery
Needle holder	Jiangxin Tools	1420 20Cr13	Surgical instrument for handling microsurgical sutures
Paraformaldehyde (4%)	Zhongsheng Wanda Tech	20240411	Fixative for brain tissue preservation prior to histological analysis
Penicillin	Gibco	1758-9324	Antibiotic for cell culture
Povidone-iodine solution	Sihuanpai	Q/PGSHW0009	Antiseptic solution for surgical skin disinfection
RPMI-1640 medium	Xigong Bio Tech	12-115F	Cell culture medium for tumor cell growth
Scilogex mixers	Scilogex	MX-S	Vortex mixer for homogenizing tumor cell suspensions
Steam indicator tape	3M-Comply	1322-24MM	Sterilization indicator for autoclaved surgical instruments
Stereomicroscope	Olympus	SZ61	Microscope used for visualization during microsurgical procedures
Zeiss Stemi 508 stereomicroscope	Zeiss	Stemi 508	Stereomicroscope used for high-magnification surgical visualization
Sterile saline (0.9%)	Kelun	25M14D07	Sterile irrigation solution used to maintain moisture of the surgical field
Streptomycin	Gibco	1758-9319	Antibiotic for cell culture
Surgical drape	Dafang	001-2016	Sterile drape used to isolate the surgical field
Surgical gloves	Ansell Medi-grip	210-64005	Sterile gloves used during surgical procedures
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	MKBH0634V	Injectable anesthetic for surgical procedures
Ultrasound Doppler	Mindray S7 SCI	—	High-resolution ultrasound system for assessment of carotid artery blood flow