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Artigo de método

Citologia Broncoscópica e Sequenciamento Metagenômico para Diferenciar Lesão Pulmonar Relacionada ao Tratamento do Câncer e Infecciosa

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DOI:

10.3791/70725

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26 de maio de 2026

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1Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases, The First Hospital of Jilin University, 2Pulmonary and Critical Care Medicine Department, First Hospital of Jilin University, 3Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jilin University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar o fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) por meio de coleta integrada guiada por broncoscopia, análise citológica e sequenciamento metagenômico de próxima geração (mNGS). Esse fluxo de trabalho abrangente distingue com precisão lesão pulmonar relacionada ao tratamento do câncer de infecções pulmonares, facilitando decisões clínicas precisas e oportunas.

Resumo

Pacientes com lesão pulmonar relacionada ao tratamento do câncer (CTLI) frequentemente apresentam sintomas respiratórios inespecíficos e alterações radiológicas que imitam de perto pneumonia infecciosa ou progressão tumoral, apresentando um desafio significativo para um diagnóstico definitivo. Processos diagnósticos tradicionais, principalmente avaliados por biomarcadores sanguíneos e culturas microbianas padrão, geralmente não conseguem fazer um diagnóstico claro e levam muito tempo. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para diagnosticar o CTLI combinando análise citológica do líquido de lavagem broncoalveolar (BALF) com sequenciamento metagenômico de próxima geração (mNGS). O fluxo de trabalho procedural consiste em três estágios principais. Primeiro, é realizada uma broncoscopia padronizada para obter amostras de BALF de alta qualidade. Segundo, a realização de uma análise citológica das amostras obtidas de BALF fornece um retrato do microambiente pulmonar. Isso permite a identificação de características inflamatórias e a triagem de células malignas para excluir a progressão tumoral. Por fim, a mNGS é utilizada para identificar ou excluir etiologias infecciosas ativas. Essa técnica genômica avançada alcança uma detecção rápida, altamente sensível e imparcial de patógenos, superando com sucesso as limitações das culturas tradicionais. Resultados representativos usando esse método demonstram que essa abordagem pode distinguir efetivamente pneumonite imunológica de infecções pulmonares ativas ou progressão tumoral. Comparado aos métodos diagnósticos tradicionais, esse protocolo tem a vantagem de distinguir rápida e com precisão o CTLI de etiologias infecciosas e malignidades ocultas. Em última análise, esse fluxo de trabalho padronizado esclarece diagnósticos clínicos, orienta decisões críticas de tratamento e melhora os resultados dos pacientes.

Introdução

Avanços nos tratamentos antitumorais, como inibidores de checkpoint imunológico e terapias direcionadas, melhoraram significativamente a sobrevivência dos pacientes, mas também aumentaram a incidência de toxicidades pulmonares não infecciosas, conhecidas coletivamente como lesão pulmonar relacionada ao tratamento do câncer (CTLI)1,2,3,4,5,6,7 . Notavelmente, a pneumonite inibidora de checkpoint (CIP) surgiu como um evento adverso fatal relacionado ao sistema imunológico, com taxas de incidência geral de 2–19% e taxas de mortalidade chegando a 35%8,9,10. O diagnóstico da LCT apresenta um grande desafio clínico porque seus sintomas respiratórios inespecíficos e manifestações radiológicas — como opacidades do vidro polido, consolidação ou opacidades reticulares — imitam de perto os da pneumonia infecciosa ou progressãotumoral 11,12,13,14.

Atualmente, um diagnóstico de LCT deve ser determinado excluindo cuidadosamente outrasetiologias 15. Os fluxos de trabalho diagnósticos tradicionais dependem fortemente de biomarcadores sanguíneos e culturas microbianas padrão, que são demorados e frequentemente não produzem um diagnósticodefinitivo 16,17,18,19,20,21,22,23. Embora a biópsia cirúrgica pulmonar forneça evidências histopatológicas claras, sua invasividade a torna inadequada para pacientes com câncer gravemente grave. Consequentemente, há uma necessidade crítica de uma abordagem diagnóstica eficaz e minimamente invasiva. Na prática clínica, o protocolo aqui descrito deve ser aplicado a pacientes com câncer que já receberam ou estão recebendo tratamentos antitumorais (por exemplo, imunoterapia ou terapia direcionada) e apresentam novos sintomas respiratórios e alterações nas imagens pulmonares. É especialmente recomendado quando se suspeita clinicamente de CTLI, testes não invasivos padrão não fornecem um diagnóstico claro e o paciente não tolera exames cirúrgicos invasivos.

A broncoscopia combinada com lavagem broncoalveolar (BAL) serve como uma "biópsia líquida" minimamente invasiva do trato respiratórioinferior 24. Ao integrar a análise citológica do fluido BAL (BALF) com o sequenciamento metagenômico de próxima geração (mNGS), essa abordagem melhora significativamente os fluxos de trabalho diagnósticos existentes. Primeiro, a citologia BALF fornece um retrato direto do microambiente pulmonar; pode identificar características inflamatóriascaracterísticas 25, como linfocitose e uma razão invertida CD4/CD8 no CIP, enquanto simultaneamente faz triagem para células malignas para descartar progressãotumoral 26,27,28,29,30. Segundo, a mNGS alcança uma detecção rápida, altamente sensível e imparcial de patógenos, superando as baixas taxas de detecção e atrasos das culturas tradicionais, especialmente para bactérias exigentes ou patógenosatípicos 31,32,33,34,35. O uso combinado dessas modalidades demonstrou melhorar significativamente a detecção de infecções mistas e orientar tratamentos precisos, reduzindo drasticamente a mortalidade dospacientes 4,5.

Apesar desse potencial clínico, atualmente não existe um protocolo padronizado para coleta e análise abrangente de BALF no contexto do CTLI. Aqui, introduzimos um protocolo padronizado para obtenção e processamento de BALF por meio de broncoscopia, combinando explicitamente avaliação citológica com mNGS. A novidade metodológica desse fluxo de trabalho está em sua capacidade diagnóstica dupla: ele utiliza a citologia para mapear o microambiente imunológico e excluir malignidades, junto com a mNGS para determinar ou descartar definitivamente infecções ativas. Comparado aos métodos diagnósticos tradicionais, esse protocolo integrado oferece a vantagem distinta de diferenciar rápida e precisamente o CTLI de etiologias infecciosas e da progressão do tumor oculto. Em última análise, esse fluxo de trabalho padronizado acelera o cronograma diagnóstico e orienta intervenções clínicas direcionadas e oportunas (Figura 1).

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Protocolo

Esse protocolo segue os princípios da Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do nosso hospital. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes antes do procedimento.

1. Preparação pré-procedimento

  1. Avaliação do paciente (dentro de 1 semana após a broncoscopia)
    1. Obtenha exames laboratoriais recentes, incluindo hemograma completo e perfil de coagulação, para garantir a segurança de um procedimento invasivo (Arquivo Suplementar 1).
    2. Realize um eletrocardiograma de 12 derivações.
    3. Avalie os sinais vitais e garanta a estabilidade hemodinâmica.
    4. Meça a saturação de oxigênio em repouso do paciente no ar ambiente para avaliar a função pulmonar.
      NOTA: Se o SpO₂ estiver baixo ou o paciente apresentar comprometimento respiratório, considere uma análise de gases sanguíneos arteriais para o PaO₂/PaCO₂ basal.
    5. Faça triagem para todas as contraindicações.
    6. Instrua o paciente a jejuar por pelo menos 6 horas e evitar beber água por 2 horas antes do procedimento para reduzir o risco de aspiração.
    7. Realize sucção e limpeza oral e nasal imediatamente antes do procedimento para minimizar a contaminação das vias aéreas superiores.
  2. Preparação de equipamentos e pessoal
    1. Prepare todos os equipamentos necessários para broncoscopia e monitoramento. Selecione um tamanho apropriado do broncoscópio com base na anatomia das vias aéreas do paciente. Verifique a funcionalidade de sucção do broncoscópio.
      NOTA: Certifique-se de que equipamentos de ressuscitação de emergência, incluindo dispositivos suplementares de fornecimento de oxigênio e aparelhos de sucção, estejam imediatamente disponíveis na sala de procedimentos para gerenciar possíveis complicações nas vias aéreas. Qualquer broncoscopia certificada com treinamento padrão pode executar esse procedimento de forma independente, sem certificações especializadas.
    2. Aqueça a solução fisiológica estéril (0,9% NaCl) destinada à lavagem a 37 °C.
    3. Extraia de 100 a 150 mL da solução salina estéril aquecida em várias seringas de 20 mL para facilitar a rápida instilação.
  3. Configuração de posicionamento e monitoramento do paciente
    1. Coloque o paciente em deitado na mesa de broncoscopia.
    2. Instale equipamentos de monitoramento contínuo para o paciente antes de iniciar o procedimento.
      1. Aplique eletrocardiograma (ECG) diretamente no tórax do paciente para monitoramento contínuo da atividade cardíaca.
      2. Conecte uma sonda de oxímetro de pulso ao dedo do paciente para monitorar continuamente a saturação de oxigênio e o pulso no sangue.
      3. Fixe um braço de pressão arterial não invasivo no braço superior do paciente para detectar continuamente a pressão venosa.
  4. Configuração do dispositivo de suporte de oxigênio e desmame pós-procedimento
    1. Prepare e configure o dispositivo de suporte de oxigênio apropriado com base no estado respiratório básico do paciente. Complete essa configuração antes de iniciar a broncoscopia.
    2. Configuração de cânula nasal de alto fluxo (HFNC)
      1. Selecione um sistema HFNC para pacientes comSpO 2 ≥ 90% do ar ambiente e sem hipercapnia. Conecte a cânula ao paciente e ajuste a vazão inicial de gás para ≥60 L/min comFiO 2 de 1,0. Ajuste continuamente o FiO2 durante o procedimento para manterSpO 2 ≥ 90%.
    3. Estratégia de transição para pacientes com ventilação não invasiva (NVI)
      1. Remova a máscara NIV e faça a transição do paciente para um sistema HFNC imediatamente antes da inserção do broncoscópio. Ajuste a vazão do gás HFNC para ≥60 L/min comFiO 2 de 1,0. Realize sucção ativa das vias aéreas durante o período sem máscara para eliminar secreções e otimizar a permeabilidade das vias aéreas.
      2. Monitore de perto o paciente para dessaturação durante a transição temporária da VNI para a HFNC. Se o SpO₂ cair abaixo de 90% e permanecer refratário à sucção e às configurações máximas de HFNC, aborte imediatamente o procedimento de broncoscopia. Reaplique prontamente a máscara NIV para restaurar a pressão positiva ou escale para a intubação endotraqueal invasiva caso o estado respiratório do paciente se deteriore.
    4. Instalação invasiva de ventilação mecânica (IMV)
      1. Ajuste o volume de maré para 6–8 mL/kg de peso corporal previsto, FiO₂ para 1,0, pressão final expiratória positiva (PEEP) para 5–8 cmH₂O e frequência respiratória para 12–16 respirações/min. Insira o broncoscópio diretamente pelo tubo endotraqueal estabelecido.
    5. Mantenha o monitoramento contínuo dos sinais vitais após a conclusão da lavagem broncoalveolar (BAL). Titule o oxigênio suplementar para manterSpO2 entre 92% e 96% (ou 88% a 92% para pacientes com hipercapnia crônica).
    6. Verifique se o paciente atende a todos os seguintes critérios antes de reduzir o suporte de oxigênio: saída completa da sedação, restauração dos reflexos protetores das vias aéreas, estabilidade hemodinâmica e ausência de sangramento ativo ou broncoespasmo severo.
    7. Para o desmame HFNC, reduza primeiro a concentração, seguido pela vazão. Reduza o FiO₂ em incrementos de 5% a 10% até atingir ≤40%. Subsequentemente, diminua a vazão em incrementos de 5% a 10%. Descontinuar completamente o HFNC quando o paciente mantiver o SpO₂ alvo com FiO₂ ≤ 35% e vazão ≤ 20 L/min.
    8. Para o desmame da VNI, certifique-se de que a hipoxemia melhore e os sinais vitais estejam estáveis, e então prossiga com um de dois métodos:
      1. Diminua o IPAP em 2–3 cmH₂O por ajuste, reduza a PEEP para 4–5 cmH₂O e diminua a FiO₂ para ≤40%.
      2. Para o desmame intermitente, faça a transição do paciente para HFNC para facilitar e estender gradualmente a duração da respiração espontânea. Reinicie imediatamente o suporte total da VNI se o paciente apresentar taquipneia (>30 respirações/min), taquicardia (>140 batimentos/min), fadiga muscular respiratória, alteração do estado mental ou SpO₂ < 90%.
    9. Para o desmame IMV, realize um teste respiratório espontâneo ou um teste de vazamento no manguito. Prossiga para a extubação somente após o paciente passar com sucesso no teste, demonstrar força adequada na tosse espontânea e apresentar secreções minimas nas vias aéreas.
  5. Sedação e anestesia
    1. Injete 15 mL de lidocaína a 2% na mucosa nasal e orofaringe, dividido em 2 a 5 doses.
    2. Inale 10 mL de lidocaína 2% em doses divididas pelo canal de trabalho do broncoscópio. Aplique essas doses passo a passo enquanto avança o broncoscópio para as vias aéreas para cobrir a mucosa traqueal, carina e árvore brônquica.
      NOTA: A dose máxima segura absoluta de lidocaína tópica é incerta. A toxicidade geralmente ocorre quando a concentração sérica excede 5 μg/mL, mas efeitos colaterais subjetivos podem aparecer em concentrações mais baixas. Acompanhe cuidadosamente o volume total de anestésico administrado.
    3. Administre sedação sistêmica de acordo com a preferência do paciente, grau de ansiedade e tolerância esperada ao procedimento para garantir anestesia adequada, maximizar o conforto do paciente e reduzir a tosse. Administrar midazolam 2–2,5 mg por injeção intravenosa lenta, ou reduzir a dose para 0,5–1 mg para pacientes frágeis ouidosos 36.
    4. Monitor SpO₂, ECG e pressão arterial não invasiva (NIBP) são adotados continuamente37.
      NOTA: A sedação sistêmica aumenta significativamente os riscos de hipoxemia refratária, colapso das vias aéreas e intubação traqueal de emergência. Monitore de perto o paciente durante todo o procedimento.

2. Procedimento BAL

NOTA: Realize o procedimento de coleta do BALF estritamente de acordo com protocolos padrão e diretrizes de prática clínica.

  1. Seleção do segmento pulmonar alvo (Figura 2)
    1. Revise a tomografia computadorizada torácica de alta resolução (HRCT) mais recente do paciente antes do procedimento para determinar a distribuição anatômica precisa da doença pulmonar.
    2. Selecione o segmento pulmonar alvo para a BAL com base na distribuição específica da doença identificada na tomografia da TCR.
    3. Direcione o broncoscópio para realizar a lavagem no segmento mais afetado radiograficamente ou no segmento que demonstra a progressão mais rápida para doença localizada ou marcadamente assimétrica.
    4. Direcione o broncoscópio para lavar tanto o lobo médio direito quanto a lingula do lobo superior esquerdo para doenças difusas ou simétricas, pois esses locais anatômicos normalmente proporcionam um retorno adequado de líquido.
  2. Pré-lavagem e descarte de amostras
    1. Injete 20–30 mL de soro salino aquecido através do broncoscópio no segmento encaixado. Espere 20–30 segundos.
    2. Aplique uma sucção suave (pressão negativa 50–100 mmHg) para aspirar o fluido de volta. Recolha essa primeira alíquota em uma armadilha e descarte-a sem enviá-la para análise, pois pode conter muco e detritos brônquicos.
  3. Procedimento principal de lavagem
    1. Conecte firmemente uma seringa estéril contendo 0,9% de soro fisiológico normal ao canal de trabalho do broncoscópio.
    2. Injete 20 mL de soro fisiológico pelo canal de trabalho ao longo de 3–5 s. Faça uma pausa imediata por 5 a 10 segundos após a injeção, permitindo que o líquido se disperse completamente e se deposite nos espaços alveolares distais por gravidade.
    3. Aplique uma sucção suave para recuperar o líquido infundido em uma armadilha de coleta estéril. Mantenha uma pressão de sucção abaixo de 100 mmHg para evitar colapso significativo das vias aéreas ou danos à mucosa das vias aéreas.
    4. Repita a sequência de instilação, pausa e sucção estritamente até que o volume total infundido esteja entre 100 e 150 mL para garantir que a amostra do trato respiratório inferior seja adequada e representativa.
      NOTA: Monitore continuamente os sinais vitais, a saturação de oxigênio e o conforto do paciente durante todo o procedimento. Pause o procedimento imediatamente se houver tosse forte ou dessaturação e retome somente após a estabilização do paciente.
  4. Técnica de recuperação de fluidos
    1. Use baixa pressão de sucção (≤100 mmHg) para evitar o colapso das vias aéreas.
    2. Empregue uma técnica de "sucção pulsada" em vez de sucção contínua: oclua e libere intermitentemente o tubo de sucção para permitir a mistura do ar, mobilizando o fluido e evitando que o brônquio colapse contra o endoscópio.
    3. Busque uma coleta de pelo menos 40–60 mL de BALF.
      NOTA: Interrompa a lavagem se o paciente desenvolver complicações (por exemplo, broncoespasmo, hipoxemia intolerável), mesmo que o volume total não seja recuperado. Mantenha o tempo total do procedimento para a instilação e aspiração de BAL abaixo de 2–3 minutos para minimizar o risco de hipóxia.
  5. Cuidados pós-lavagem
    1. Retire o broncoscópio cuidadosamente ao concluir o BAL.
    2. Aspire quaisquer secreções restantes das vias aéreas centrais.
      NOTA: Continue com o suporte de HFNC ou NIV se utilizado até que o paciente esteja estável na recuperação. Monitore o paciente para complicações pós-procedimentais, como sangramento ou pneumotórax.

3. Manuseio de amostras e controle de qualidade

  1. Medição, transporte e avaliação inicial do BALF
    1. Registre o volume de fluido retornado versus o volume injetado imediatamente durante o procedimento.
    2. Calcule a porcentagem de recuperação usando a seguinte fórmula:
      Percentual de recuperação = (volume recuperado / volume incutido) × 100%
      NOTA: Uma recuperação de ≥30% é geralmente considerada uma boa amostra de BALF.
    3. Coloque o BALF coletado no gelo imediatamente. Transporte o BALF prontamente para o laboratório.
      ATENÇÃO: Amostras humanas de BALF são potencialmente infecciosas. Manuseie todas as amostras com as precauções padrão apropriadas.
    4. Observe e registre a cor macroscópica e a turbidez da amostra de BALF antes do processamento.
      NOTA: Fluido claro ou amarelo pálido sem turbidez visível é típico de estados não infecciosos. Uma aparência turva ou leitosa está associada à proteinose alveolar pulmonar (PAP)38. Líquido purulento indica uma possível infecção bacteriana. Líquido tingido de sangue indica potencial sangramento ou hemorragia alveolardifusa 39.
  2. Avaliação de viabilidade celular
    1. Dilua o BALF a uma concentração de aproximadamente 1 × 106 células/mL usando soro fisiológico estéril.
    2. Misture o BALF diluído com azul de Tripan em uma proporção de volume 1:1 para obter uma mistura de reação de 20 μL.
      ATENÇÃO: O azul de tripano é um produto químico tóxico e suspeito de carcinógeno.
    3. Incube a mistura de reação por 3 minutos em temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C).
    4. Coloque a mistura em um hemocitômetro. Examine as células sob um microscópio de luz de baixa potência.
    5. Conte no mínimo 200 células para determinar sistematicamente a viabilidade das células.
      NOTA: As células viáveis permanecem não coradas, transparentes e morfologicamente intactas, enquanto as células não viáveis absorvem o corante azul. Uma viabilidade celular inicial de >90%–95% é necessária para garantir contagens de citologia a jusante confiáveis.
  3. Distribuição alíquota
    1. Divida o BALF em tubos designados para diferentes análises durante a operação de lavagem.
    2. Designe o Tubo 1 como "descartado" para a primeira alíquota retornada.
    3. Designe o Tubo 2 para microbiologia e aloque 10–20 mL de BALF para o diagnóstico de patógenos (por exemplo, mNGS).
      NOTA: Realize rotineira de coloração/cultura bacteriana de Gram, coloração/cultura fúngica, exame de bacilo ácido-rápido (AFB) e PCR simultaneamente na prática clínica.
    4. Designe o Tubo 3 para citologia e reserve pelo menos 10 mL para a contagem celular total e diferencial.
    5. Designe o Tubo 4 como reserva opcional e armazene qualquer fluido remanescente (a 4 °C para curto prazo ou -80 °C para mais longo) para testes adicionais.
      NOTA: Congele a amostra de mNGS a -80 °C imediatamente se o teste não puder começar imediatamente. Processar amostras de citologia frescas; se houver um atraso, refrigere a amostra a 4 °C por até 24 horas para preservar a morfologia celular.

4. Processamento laboratorial do BALF

  1. Contagem total de células
    1. Inverta o tubo para misturar suavemente o BALF e resuspenda as células.
    2. Dilua o BALF com um volume apropriado de soro fisiológico estéril se a amostra contiver tampões de muco macroscópicos e detritos.
    3. Pré-molhe um pedaço de gaze médica estéril cuidadosamente com soro sorológico estéril antes da filtração. Filtre a amostra diluída através de duas camadas da gaze médica estéril pré-umedecida.
    4. Colete o filtrado em um tubo de coleta estéril. Conte o total de células nucleadas usando um analisador hematológico.
      NOTA: Baixa contaminação por células epiteliais (<5% das células) e uma proporção mínima de glóbulos vermelhos (<10%) indicam uma amostra alveolar de alta qualidade.
  2. Contagem diferencial de células
    1. Transfira 1 mL da amostra bem misturada de BALF para um microtubo de 1,5 mL. Centrifuge o microtubo a 211 × g por 5 minutos para concentrar as células.
    2. Remova o sobrenadante, deixando exatamente 50–100 μL de fluido no microtubo. Ressuspenda completamente a pelota celular no sobrenadante restante.
    3. Pipete 10–20 μL da suspensão da célula ressuspensa sobre a superfície de uma lâmina de vidro limpa, próxima à borda fosca.
    4. Segure uma segunda lâmina de vidro limpa em um ângulo de 30–45° em relação à primeira lâmina. Empurre a segunda lâmina para frente usando uma técnica suave de espalhamento em cunha para criar uma camada celular fina e uniforme.
    5. Repita os passos 4.2.3 a 4.2.4 para preparar 2–3 slides idênticos.
    6. Deixe as lâminas espalhadas secarem completamente ao ar em temperatura ambiente.
    7. Tinga os slides usando o método Wright-Giemsa.
    8. Observe as lâminas tingidas sob um microscópio óptico usando uma objetiva de imersão em óleo de alta potência (ampliação de 1.000×).
    9. Identifique e categorize pelo menos 400 células para determinar a contagem diferencial de células.
      NOTA: Mantenha quaisquer amostras de BALF com alta suspeita clínica de malignidade em 4 °C e submetam-nas ao laboratório central de patologia para citocentrifugação padronizada em até 2 horas após a coleta da amostra.
  3. Pipeline mNGS
    1. Inative a amostra de fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) incubando-a a 65 °C por 30 minutos.
    2. Transfira 0,5 mL da amostra de BALF inativada para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 g de esferas de vidro de 0,5 mm.
    3. Fixe o tubo da microcentrífuga a uma plataforma horizontal em um misturador de vórtice. Agite a mistura entre 2.800 e 3.200 rpm por 30 minutos para facilitar a ruptura mecânica da parede celular microbiana e a subsequente liberação de DNA.
    4. Centrifuge o tubo brevemente para fixar as esferas e transfira cuidadosamente 0,3 mL do sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    5. Extraia os ácidos nucleicos totais do sobrenadante usando um kit de extração de DNA em microvolume, seguindo rigorosamente as instruções do fabricante.
    6. Meça a concentração do DNA extraído usando um fluorômetro.
    7. [PONTO DE PAUSA] Armazene o DNA extraído a -20 °C para uso de curto prazo ou a -80 °C para armazenamento a longo prazo caso a preparação da biblioteca não seja realizada imediatamente.
    8. Construa as bibliotecas de metagenômica a partir do DNA extraído utilizando um kit de preparação de bibliotecas de entrada ultra-baixa.
    9. Inspecionar as bibliotecas construídas para garantir tamanhos de fragmentos apropriados e concentração suficiente.
    10. Sequencie as bibliotecas qualificadas em uma plataforma de sequenciamento de alta velocidade.
  4. Análise de dados de sequenciamento
    1. Elimine leituras de baixa qualidade e sequências adaptadoras dos dados brutos de sequenciamento usando software de processamento de sequências.
    2. Leituras descartadas com comprimento menor que 35 pares de bases (pb), leituras com baixa complexidade e leituras com pontuação de qualidade Phred (pontuação Q) abaixo de 20.
    3. Alinhe as leituras de alta qualidade ao genoma de referência humano (versão hg38) usando um algoritmo de Alinhamento Burrows-Wheeler para identificar sequências de DNA humano.
    4. Descarte as sequências de hospedeiros humanos alinhadas para isolar os dados de sequenciamento não hospedeiros.
    5. Analise as leituras restantes de sequenciamento não hospedeiro em um banco de dados de referência de classificação para obter informações microbianas no nível da espécie. Construa o banco de dados com base em bancos de dados de genomas microbianos publicados, como o banco de dados de sequências de referência do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI). Certifique-se de que contenha dados abrangentes sobre patógenos (por exemplo, 25.863 patógenos compreendendo 12.142 bactérias, 2.680 fungos, 10.061 vírus, 654 parasitas, 206 micobactérias e 120 micoplasma/clamídia).
    6. Estabeleça controles negativos ('sem modelo', NTC) e positivos processando-os pelos mesmos procedimentos de extração, preparação de bibliotecas e análise de bioinformática.
    7. Examine o número de leitura estritamente mapeado (SMRN) e a cobertura genômica para avaliação diagnóstica.
      NOTA: SMRN denota a quantidade de sequências que estão precisamente alinhadas com o microrganismo no nível da espécie.
    8. Classifique um resultado bacteriano, fúngico, micoplasma ou clamídia como resultado mNGS como positivo se o microrganismo não for detectado na NTC E sua cobertura genômica estiver entre os 10 melhores entre os microrganismos do mesmo gênero, OU se a razão de SMRN_sample para SMRN_NTC for > 10 (quando SMRN_NTC ≠ 0).
    9. Confirme que o SMRN_sample atende aos seguintes limiares mínimos para um resultado positivo: ≥3 para bactérias, fungos, micoplasmas e clamídias; ≥100 para parasitas; e ≥1 para Mycobacterium tuberculosis.
    10. Classifique um resultado viral de mNGS como positivo se o vírus não for detectado no NTC, OU se a razão de SMRN_sample para SMRN_NTC for >5 (quando SMRN_NTC ≠ 0).
    11. Confirme que o SMRN_sample para vírus é ≥1.
    12. Compile uma lista de patógenos candidatos junto com suas contagens de leitura ou abundâncias relativas.
    13. Registre quaisquer genes de resistência a antibióticos ou fatores de virulência identificados pelo pipeline de bioinformática.
    14. Defina um acerto significativo combinando o número de leituras, comparação estatística com grupos controle e relevância clínica.
    15. Avalie se cada patógeno identificado pode explicar a situação clínica.

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Resultados

Seguindo o protocolo padronizado acima, os clínicos podem obter reprodutivamente amostras de BALF de alta qualidade e utilizar análises celulares e genômicas para distinguir o CTLI de seus imitadores. Abaixo, apresentamos um resultado representativo do nosso caso para ilustrar os achados típicos. Uma mulher de 68 anos com câncer de pulmão pouco diferenciado estágio IV (tumor primário da região pleural direita) sob imunoterapia com pembrolizumabe é apresentada para ilustrar a abordagem BA...

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Discussão

Na era atual da terapia contra o câncer, lesões de órgãos relacionadas ao tratamento, como as induzidas por inibidores de checkpoint imunológico (ICIs), continuam sendo uma preocupação clínica importante que pode limitar a progressão do tratamento ou até mesmo ser potencialmentefatais 3,4. Entre os eventos adversos imunológicos (IRAEs) induzidos por ICI, a pneumonite tem recebido atenção significativa como causa principal de desf...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Declaração de Assistência à IA:
Os autores declaram o uso de tecnologias assistidas por IA durante a preparação deste manuscrito. Especificamente, o Gemini by Google foi utilizado exclusivamente para aprimorar a língua inglesa, corrigir erros gramaticais e garantir que a formatação estrutural seguisse as diretrizes do periódico. A ferramenta de IA não foi usada para geração, análise de dados ou interpretação de resultados científicos. Todos os autores revisaram minuciosamente o texto gerado, fizeram as edições necessárias e assumiram total responsabilidade pela precisão científica e integridade do manuscrito final.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo Projeto de Melhoria da Capacidade de Tecnologia em Saúde da Comissão Provincial de Saúde de Jilin (Subsídio nº 2023JC007).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2% de lidocaínaHunan KelunN/AAnestesia local para mucosa das vias aéreas.
Contas de vidro de 0,5 mmSigmaN/AUsado para a perturbação mecânica da parede celular de microrganismos.
Broncoscópio eletrônico BF-260OlympusN/AO broncoscópio é usado para obter o líquido de lavagem alveolar.
Alinhamento Burrows-WheelerCódigo Aberto0.7.17(RRID:SCR_010910)Algoritmo para mapear sequências ao genoma humano.
Instrumento de oxigenoterapia umidificada de alto fluxoBMC MedicalN/AForneça um certo fluxo, gás respiratório aquecido e umidificado para pacientes com respiração espontânea.
Misturador de vórticeScientific  IndústriasN/AIndústrias Científicas
MidazolamJiangsu EnhuaN/ASedativo sistêmico para conforto do paciente.
Plataforma Nextseq 550IlluminaN/AA sequência genética para sequenciar o genoma no BALF
Kit de Biblioteca de Entrada Ultrabaixa QIAseqTiangenN/AKit para construir biblioteca metagenômica
Qubit 4.0Thermo Fisher ScientificN/AInstrumento para detectar o conteúdo de ácido nucleico BALF
TIANamp Micro DNA Kit DP316TiangenN/AO kit de extração de DNA para extrair ácidos nucleicos totais do BALF
Azul de tripanBiosharpN/AContraste usado para avaliação de viabilidade celular.
  Banho-mariaJoanN/AUsado para inativação da amostra de BALF a 65 °C.
Mancha de Wright-GiemsaYuanmuN/AUsado para coloração diferencial de células.
Analisador de hematologia XN-9000SysmexSN-13699Analisador hematológico para contar células nucleadas totais da amostra de BALF

Referências

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